Простой и Компьютерный обонятельных тестирование для мышей

Резюме

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Аннотация

Обоняние высоко консервативен среди видов и необходим для воспроизводства и выживания.

У человека, обоняние также является одним из органов чувств, что пострадавших при старении и сильным предиктором нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, обоняние тестирование используется в качестве неинвазивного метода диагностики для выявления неврологического дефицита на ранних стадиях. Для того, чтобы понять механизмы, лежащие в основе обонятельной чувствительности к сети, обонятельные исследования на грызунах набирает обороты в последнее десятилетие.

Здесь мы представляем очень простой, эффективный и времени воспроизводимого метода обоняния тестирования врожденного восприятия запаха и чувствительности у мышей без необходимости какого-либо предварительного пищи или воды ограничений. Испытания проводятся в знакомой среде на мышах, требуют только ароматы и 2 минутные сеансы воздействия одоранта. Анализ проводится, ретроспективном, используя компьютерные помощь команды на ImageJ а может быть, поэтому, Осуществляется с начала до конца, от одного исследователя.

Этот протокол не требует какого-либо специального оборудования или установки и указывается для любой лаборатории, заинтересованной в тестировании обонятельный восприятие и чувствительность.

Введение

Обоняние является одним из наиболее развитых и важных сенсорных функций у млекопитающих. Любое ухудшение в обонятельной деятельности может повлиять на потребление продуктов питания, социальное поведение и, в худшем случае, даже выживание. У человека, обонятельные ухудшение зависит ¹ возраст и считается сильным предиктором неврологических расстройств ^{2 - 6.} Идентификация тест обонятельные разработана в Университете штата Пенсильвания в настоящее время представляет собой один из наиболее часто используемых, неинвазивных и количественной, диагностических тестов, которые могут оценить ранние неврологические дефициты ⁷ и предсказать с большой долей вероятности прогрессирования деменции ^8,9.

Доступность обонятельной системы и известность обоняния грызунов, вызвало интенсивное направление исследований адресации механизмы, лежащие в основе обонятельные функции ^10. Ранее мы показали, что потеря функции Recept сигнализацииили Notch1 влияет обонятельный избежать ^11. В этом протоколе мы используем мышей, лишенных лиганд сигнализации, Jagged1, в нейронах или глии изучать обонятельные характеристики.

Врожденный обоняние определяется тремя параметрами, как восприятия, различения запахов и обонятельных чувствительности ^4. Обонятельная испытания на грызунах может быть осуществлено различными способами, и некоторые поведенческие исследования используют olfactometers, которые обеспечивают запах животному при определенных концентраций паров и в точном времени ^{12 - 14.} Тем не менее, эти приборы дорого и могут быть доступны только в специализированных учреждениях. В нашей работе, мы предоставляем простой, быстрый и воспроизводимый обонятельный протокол тестирования, который осуществляется с помощью летучих ароматов. Тесты описано мера восприятия к аттрактанта или репеллента запаха и оценить дискриминации между запахом и воды ^11,15,16. Используя ту же настройку, же можно также измерить чувствительность к запах при различных концентрациях ^16,17. Ретроспективном помощью компьютера обработки видео, вдохновленный работой Пейдж и коллег ^18, обеспечивает объективные результаты без необходимости экспериментального ослепления и позволяет для одного человека, чтобы осуществить весь эксперимент.

Этот протокол предназначен для обеспечения отправной точкой для изучения обонятельной поведение у мышей.

протокол

Все процедуры на животных в соответствии с Директивой ЕС 2010/63 / ЕС о защите животных, используемых для научных целей и утверждаются местным комитетом по уходу за животными (Кантон Фрибур, Швейцария) по.

1. Подготовка животных

1. Экспериментальные животные
   1. Выполните эксперименты на взрослых мужчин дикого типа и трансгенных мышей (C57BL / 6 фон) 3-5 месяцев. Три группы мышей соответствуют диких управления типа однопометными (группа, Jagged1 Flox / Flox ¹⁹⁾ и два условных KO линий мышей (группа Б, Jagged1ncKO и С, Jagged1gcKO).
   2. Дом мышей при стандартных лабораторных условиях в проветриваемом помещении, с 12 ч контролируемой темный / светлый цикл и обеспечить пищу и воду без ограничений.

2. Экспериментальная установка

1. Экспериментальная арена
   1. Для экспериментального арене, используйте чистую стерилизованную клетку мыши (36 см длина х 20,5 см ширина х 13,5 см высота) (1А).
   2. Связать каждой мыши в клетке номером с пресной постельные принадлежности, высокой 3 см. Если клетки используются повторно, а в тесте чувствительности запаха, принять следующие меры, чтобы избежать перекрестного загрязнения между запахов и мышей.
      1. Отметить сторону воды.
      2. Очистить узкие стенки клеток с двумя тонкую бумагу опрыскивают 70% -ным этанолом, по одному на каждой стороне.
      3. Накапливаются клетки в соответствии с генотипом мышей и временного хранения под капотом ламинарного.
2. Камера
   1. Установите камеру на штатив настроенного с целью на 58 см от дна клетки (рис 1А). Закрепите положение штатива и клетку и ограничивают с отметками для обеспечения камеры, сосредоточены на верхней части клетки.
   2. Запись видео в 320 пикселей х 240 пикселей, 15.08 кадров в секунду как MOV файлов.
3. Запахи
   1. Ресуспендируют ScenTS, когда указано, в растворителе, в котором они растворимы.
   2. Для испытаний предпочтение использование арахисового масла. Ресуспендируют арахисовое масло в арахисовом масле (10% вес / объем).
   3. Для тестового использования избегания чистого 2-метилмасляную (2-МБ) кислоты (98%).
   4. Для испытания чувствительности, использовать женский мочи из той же колонии мыши и фона (C57BL / 6).
      1. Для удобства сбора мочи 1-2 дней до обонятельной теста. Задержите и удерживайте нажатой клавишу мыши под капотом с его живота над клетке сетки. В клетке сетки поместить пластиковый Петри, чтобы собрать капли мочи.
      2. Соберите мочу из каждой самки в 1,5 мл трубки и смешать все образцы мочи для нормализации изменчивости между животными. Хранить при -20 ° С до использования.
      3. В день эксперимента, оттаивают мочи и выполнить 4 разведений в бидистиллированной воде при коэффициенте разбавления 10 (1:10, 1: 100; 1: 1000; 1: 10000).

3. Обонятельный Тестирование

Примечание: В этом протоколе запахов были намеренно выбраны, которые воспринимаются как сильные аттрактанты (арахисовое масло и женщина мочи) или сильного репеллента (2 МБ кислоты) ^15. Важно проводить предпочтения и тесты чувствительности к приятных ароматов до теста избегания, чтобы исключить возможность какого-либо вмешательства с обонятельной поведения. Тем не менее, для простоты, в этой статье, предпочтение и избегания теста будет как описано в тесте восприятия. Каждый поведенческий сессия начинается с фазы привыкания.

1. Привыкание Фаза
   1. Место животное в чистом назначенного клетку и пусть это исследовать в течение 5 мин (Фиг.1В). Так среды экспериментальной клетке знаком домашней клетке, это короткое время достаточно, чтобы позволить привыкания.
   2. Если чувствительность теста завершена в течение одного дня, выполнять привыкания только один раз перед аппликацийп высшей разбавленной запаха. Если тест чувствительности осуществляется в разные дни, каждый день необходимо фазы привыкания на новом чистой клетке.
2. Восприятие Тест
   1. После привыкания, включите камеру и сразу же пипеткой 60 мкл приятным ароматом (арахисовое масло) и 60 мкл нейтрального аромата (водопроводной воды) на противоположных стенках клетки примерно в 10 см от дна (рис 1в).
   2. Пусть мышь исследовать запахи в течение 2 мин (рис 1D). После этого выключите камеру.
   3. В этот момент, перейти к следующему мыши, начиная с этапа привыкания. Проводят исследование избегания точно таким же образом с применением 60 мкл репеллента запаха (2-МБ кислота) и 60 мкл воды.
3. Тест чувствительности
   1. Оценка привлекательности порог самцов мышей с возрастающими концентрациями женской моче в следующем порядке: 1: 10000; 1: 1000; 1: 100; 1:10 и чистый мочи.
   2. После приучения, подвергнуть каждой мыши в высоком разведении пипеткой экспериментатором как описано ранее в разделе 3.2.1.
   3. Запишите исследовательское поведение мочи в сравнении с водой, в сроки 2 мин на видео камеру. После того как все мыши когорты испытывали на самом высоком разбавлении (1: 10000), подвергать более высокой концентрации мочи, как было указано выше.

4. После специального анализа данных

Примечание: Все поведенческие тесты, описанные обрабатываются постфактум, следуя инструкциям анализа данных.

1. Откройте MOV файлов в ImageJ для систем Windows,
   1. Установите Quick Time для Java с использованием пользовательских настроек из http://www.apple.com/quicktime/download.
   2. Установите плагин Quick Time с сайта ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. Импорт QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) в библиотеки EXTENSион ImageJ (.ImageJ JRE Lib EXT).
   4. Копировать также QTJava.zip в папку плагинов и переименовать его в QTJava.jar.
   5. Установите шесть скрипты, прикрепленные в папке макросов (ImageJ Plugins Макросы).
   6. Открыть ImageJ и скомпилировать и запустить плагин Quick Time, после близко ImageJ.
   7. Повторно ImageJ и откройте файл MOV, используя File> Import> с помощью Quick Time.
2. Регулировка Видео
   1. После того как видео файл открывается в ImageJ, вырезать видео, чтобы получить постоянную разведку 2 мин с момента экспериментатор пипеткой на отдушки в клетку (T0). Определить кадр, соответствующий T0 и удалить предыдущие кадры, используя шагом 1 (ImageJ изображения Стеки ToolsSlice удаления). Используйте ту же команду, чтобы удалить все кадры, превышающие разведку 2 мин.
   2. Убедитесь, что клетка по центру и при необходимости использовать изображения> Transform> Команда Повернуть, чтобы выровнять его.
3. СмотриО Обработка
   Примечание: Видео обработка полностью с помощью компьютера и использует макросы команд, сопровождающих эту статью.
   1. Для того, чтобы ограничить область на клетку в 127 пикселей х 218 пикселей размером запустить Шаг 1 макрос из плагинов> Макрос> Выполнить команду. Перемещение фиксированный прямоугольник над клеткой (рис 2, шаг 1).
   2. Обрезать область клетку на область интереса (ROI), используя Шаг 2 макроса (рис 2, этап 2).
   3. Используйте Шаг 3 макрос извлечь изображение мыши от фона путем присвоения пороговый сигнал, despeckling и фильтрации дисперсию сигнала. Значения выходных в оси Z участка показывают средние значения серого, соответствующий интенсивности тени мыши движущегося в окупаемости инвестиций в "водной камеры" при разведке 2 мин. Скопируйте результаты в таблицу с именем в соответствии с ROI в файл электронной таблицы (рис 2, шаг 3).
   4. Используйте Шаг 4 макросизвлечь средние серые значения мыши в ROI »запах камеры". Скопируйте результаты в таблицу с именем в соответствии с ROI в том же файле электронной таблицы, как в 4.3.3 (рисунок 2, стадия 4).
   5. В целях дальнейшего ограничения анализ движения мыши в ROI »воды периметру" использовать Шаг 5 макроса. Скопируйте результат на листе с именем в соответствии с ROI в том же файле электронной таблицы, как в 4.3.3 (рисунок 2, раздел 5).
   6. Чтобы ограничить анализ движения мыши в ROI »запах периметру" использовать Шаг 6 макрос. Скопируйте результат на листе с именем в соответствии с файлом ROI таблицы, как в 4.3.3 (рисунок 2, стадия 6).
   7. Процесс все видео и проверить на соответствие количества кадров в животных. Вот, запишите все животных для 1810 кадров, соответствующих геологоразведочных сессии 2 мин.
   8. Для каждого животного, и для каждого ROI рода кадры со средним серым васифилис больше, чем 0. Divide количество кадров значениями соответствует 1 секунду и получать секунды, проведенные в каждой ROI.

5. Статистический анализ

1. Для каждого теста проверить однородность дисперсии внутри групп / генотипов с помощью теста Бартлетта, используя формулу, доступных на http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
2. В тесте притяжения и избегания, проводить сравнения между времена провел с водой в сравнении с запахом в одной группе с помощью Т-тест ненаправленная Стьюдента предполагая равные или неравные отклонения в зависимости от результатов теста Бартлетта. Сравните время, проведенное с запахами, минус время, проведенное с водой между генотипами односторонним ANOVA с тестом после специальной Бонферрони.
3. В тесте чувствительности анализа сравнения времени, проведенного с запахом вычитается из времени, затраченного с водоснаг среди групп в определенном разведении мочи по односторонним ANOVA с тестом после специальной Бонферрони. Сравните чувствительность среди групп на растущие концентрации запаха на 2-Way ANOVA с повторениями с теста после специальной Бонферрони.
4. Взаимодействие между генотипами и лечения в тесте притяжения и избегания исследованы 2-полосная ANOVA с тестом после специальной Бонферрони.

Результаты

Тест измеряет восприятие влечение к арахисовое масло и избежания до 2 МБ кислоты. Три группы мышей протестированы и время, проведенное в "запах периметру" количественно по сравнению с водой. В тесте предпочтений, контрольная группа отображает значительное предпочтение запаха по с...

Обсуждение

Тесты, предложенные в этом протоколе позволяют оценить различные аспекты врожденного обонятельной поведения у мышей: восприятие запахов, дискриминации между запахов в сравнении с водой и чувствительность к запахам. Этот протокол может быть применен к любой запах в соответствии с пре?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis