Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Resumen

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Resumen

Al lado de los hepatocitos parenquimatosos, el hígado consiste en células no parenquimatosas (APN), a saber las células de Kupffer (KC), hígado células endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). De dos dimensiones (2D) cultura de hepatocitos humanos primaria (HPP) todavía se considera como el "patrón oro" para las pruebas in vitro de metabolismo de fármacos y hepatotoxicidad. Es bien sabido que el monocultivo 2D de PHH sufre de desdiferenciación y pérdida de función. Recientemente se demostró que NPC hepáticas jugar un papel central en la fisiología del hígado (patógeno) y el mantenimiento de las funciones PHH. La investigación actual se centra en la reconstrucción de la arquitectura del tejido in vivo por 3D-y co-cultivo de los modelos para superar las limitaciones de los monocultivos 2D. Previamente hemos publicado un método para aislar células de hígado humano y se investigó la idoneidad de estas células para su uso en cultivos de células en Biología y Medicina Experimental ^1. Basado en el amplio interés en este technique el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá una fácil reproducción de esta técnica.

células de hígado humano se aislaron de muestras de tejido hepático humano de las intervenciones quirúrgicas por un EGTA / colagenasa técnica P perfusión de dos etapas. PHH se separaron de la NPC por una centrifugación inicial a 50 x g. Densidad etapas de centrifugación de gradiente se utilizan para la eliminación de células muertas. poblaciones de células hepáticas individuales fueron aislados de la fracción enriquecida NPC usando las propiedades de células específicas y procedimientos de clasificación de células. Al lado del aislamiento PHH fuimos capaces de separar KC, LEC y HSC para su posterior cultivo.

En conjunto, el protocolo presentado permite el aislamiento de PHH y NPC en alta calidad y la cantidad de muestra de tejido de un donante. El acceso a las poblaciones de células hepáticas purificados podría permitir la creación de in vivo como Li humanamodelos Ver.

Introducción

tejido hepático humano es muy complejo y se compone de dos entidades diferentes de células, las células del parénquima y células no parenquimatosas (APN). las células hepáticas parenquimatosas incluyen los hepatocitos y cholangiocytes. Los hepatocitos representan 60 a 70% de las células hepáticas totales y representan la mayor parte de las funciones del hígado metabólicos, por ejemplo, ácidos biliares y complementan la síntesis del factor, la biotransformación y la energía metabolismo ^2,3.

La fracción más pequeña NPC constituye el 30-40% de las células hepáticas totales. NPC incluyen diferentes poblaciones de células, a saber, células de Kupffer (KC), células hepáticas endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). Esta fracción de células heterogénea juega un papel central en los procesos fisiológicos del hígado. Además, NPC participar en la mediación de daño hepático agudo, por ejemplo, lesión hepática inducida por fármacos (DILI), así como en lesiones crónicas del hígado, como la cirrosis ^4.

En los últimos años, hlas células del hígado Uman se han vuelto cada vez más importante en la investigación y el desarrollo de las pruebas de drogas, el desarrollo de medicamentos e identificación de nuevas vías bioquímicas en las enfermedades hepáticas. Para el ensayo in vitro monocultivos PHH se siguen considerando como el "patrón oro" ^5. La principal limitación de los modelos actuales de hígado homotípicos es desdiferenciación y pérdida de función de los hepatocitos dentro de unos pocos días ^4. El establecimiento de técnicas (3D) de cultivo de 3-dimensionales ha demostrado que estas limitaciones se pueden compensar ^4,6. Sin embargo, incluso las modernas técnicas de cultivo en 3D no son capaces de mostrar todos los modos de acciones hepatotóxicos ^7. Faltan las poblaciones de la APN en los modelos in vitro existentes se discuten como una posible razón de esta discrepancia a la situación in vivo. Se ha demostrado que la comunicación célula-célula entre las diferentes poblaciones de células de hígado juega un papel central en la homeostasis fisiológica, sino también en pathophysiologic procesa ^8. Por lo tanto la atención científica se centra cada vez más en la APN y sus interacciones célula-célula. Su uso con propósitos específicos en co-cultivo y sistemas de ingeniería tisular podría ser una solución para la alta demanda de los modelos in vitro de hígado ^8,9, que son lo más cercano a la situación in vivo como sea posible.

Actualmente, el principal reto es el desarrollo de un modelo de hígado co-cultura humana normalizada, que contiene partes claramente definidas de PHH y el CNP. En consecuencia, se necesitan técnicas de aislamiento de las células del hígado muy heterogéneos y los que tienen que ser optimizado para obtener poblaciones de células puras. Mientras que los protocolos estandarizados para el aislamiento PHH existen ^10, el aislamiento normalizado de la APN humano está todavía en desarrollo. Protocolos de aislamiento de la APN más publicados se basan en experimentos con células no humanas ^11,12. Sólo unas pocas publicaciones describen el proceso de aislamiento de la APN humana y la mayoría sólo cubrenmétodos para el aislamiento de un solo tipo de células ^11-16. Las características de las células más importantes que han sido aprovechadas para la separación celular son el tamaño, la densidad, el comportamiento de fijación, y la expresión de proteínas de la superficie. Sobre la base de estas características se desarrolló un protocolo simplificado para aislar PHH, KC, LEC y HSC, que fue publicado previamente en Biología y Medicina Experimental ^1. Debido al amplio interés en esta técnica, el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá la reproducción de la técnica con mayor facilidad. El protocolo incluye también métodos de control de calidad para la evaluación de rendimiento y la viabilidad, así como para la evaluación de la identificación y la pureza usando immunostainings específicos.

Protocolo

Nota: se aislaron Todas las células de tejido hepático resecado no tumoral humana, que se mantuvo después de la resección parcial del hígado con tumores hepáticos primarios o secundarios. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes de acuerdo con las directrices éticas de la Charité - Universidad de Berlín.

1. Preparación de materiales y soluciones

1. Esterilizar todos los instrumentos y los materiales por adelantado para evitar la contaminación bacteriana durante el proceso de aislamiento.
2. Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la muestra de tejido del hígado, el proceso de aislamiento de los hepatocitos y las células hepáticas no parenquimatosas y el cultivo de células hepáticas humanas primarias de acuerdo con las Tablas 1 y 2, con excepción de la digestión-Solution que se prepara recién antes de su uso. Todas las soluciones se pueden almacenar a 4 ° C y se recomienda para usarlos dentro de las 4 semanas después de la preparación.
3. Esterilizartodas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras superior botella.

2. Preparación de los equipos de perfusión

1. Configurar el equipo para la perfusión y la digestión de la muestra de tejido del hígado como se muestra en la Figura 1A.
2. Ajustar la temperatura del baño de agua a 39 ° C para garantizar una actividad óptima P colagenasa durante la perfusión y la digestión.

3. perfusión y digestión de la muestra de tejido del hígado (1,5 hr)

1. Seleccionar una muestra de tejido con la cápsula de Glisson una intacto del tejido hepático resecado. Al cortar la muestra de tejido, tratar de obtener una superficie de corte pequeña con buenos vasos visibles. Evitar los tiempos de isquemia caliente por el transporte y manipulación de la muestra de tejido hepático en hielo hasta que la perfusión.
2. Tome el peso del tejido en condiciones estériles y colocar la muestra de tejido hepático en una placa de Petri en el flujo de aire laminar. Limpiar la superficie de la muestra de tejido con una compresa estéril de rerestante sangre y eliminar el conjunto de cánula de perfusión utilizando 1x-Solución I para garantizar que toda la cánula eran permeables.
3. Utilice pegamento de tejido para fijar las aceitunas de las cánulas en algunos vasos sanguíneos más grandes. Dependiendo del tamaño de la muestra de tejido del hígado y el número de los vasos en la superficie, el uso de una cánula fijada con 3 a 8 cánulas. Prueba de la perfusión y comprobar si hay fugas. Cerrar todos los vasos sanguíneos, los cuales sale clara 1x-perfusión Solución I, con adhesivo tisular.
4. Colocar la muestra de tejido del hígado canulado en el embudo Büchner en su disco de filtro perforada (Figura 1A).
5. Ajuste el caudal de la bomba peristáltica entre 7,5 ml / min y 14,6 ml / min en función del número de cánulas usadas y en la resistencia del tejido hepático. Ajustar la velocidad de flujo cada vez para asegurar que hay una perfusión actual pero lento. Perfundir el tejido hasta que toda la sangre se vacía pero al menos 20 min. Observar el tejido vuelve más brillante en áreas con buenas perfusien.
   Nota: En algunos casos, puede ser necesario para sujetar una de las cánulas con abrazaderas de plástico o para aumentar la presión interna de un área empujando suavemente con una espátula en contra de la cápsula hepática, para optimizar la perfusión. Un cambio completo de color a un amarillo claro al color marrón claro indica una buena perfusión.
6. Cambiar el fluido de perfusión a la digestión-Solution que contiene colagenasa P (Tabla 1).
7. Reorganizar la configuración (Figura 1A) para la etapa de digestión. Por lo tanto realizar un flujo circular de digestión-solución de acuerdo con la Figura 1B para un máximo de 15 min.
   Nota: Es fundamental para detener la perfusión inmediatamente cuando la muestra de tejido del hígado se digiere lo suficiente. Una buena digestión se puede observar, cuando el tejido no muestra signos de elasticidad según la evaluación de mantenimiento de las deformaciones de la cápsula, cuando se empuja con una espátula.

4. Aislamiento de los hepatocitos (1 hr)

1. Turna la bomba peristáltica fuera y colocar la muestra de tejido hepático en un plato de cristal. Enjuague el exterior de la muestra de tejido con hielo frío Stop-Solution (Tabla 1). Retire las cánulas de la muestra de tejido del hígado. Utilice un bisturí para abrir la muestra de tejido del hígado, mediante la incisión en el medio de la zona donde se unen las cánulas. Mantener la atención que la cápsula Glisson's se mantiene intacta.
2. Enjuague el interior de la muestra de tejido y luego cubrir toda la muestra de tejido con hielo frío Stop-Solution. Agitar el tejido suavemente para liberar las células de los tejidos.
3. Recoger la suspensión celular y se filtra a través de una mirada embudo (embudo de plástico forrada con compresas de gasa) en tubos de 50 ml de plástico. Añadir más Stop-Solución para la muestra de tejido hepático hasta que se consume un volumen final de 500 ml.
4. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recoger el sobrenadante para su posterior aislamiento de células no parenquimatosas. Lavar el sedimento celular con PBS (Figura 2A).
5. Centrifugar la suspensión celular de nuevo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recoger el sobrenadante y resuspender el sedimento en medio de hepatocitos de incubación (Tabla 2, Figura 2B).
6. Determinar el número de células y la viabilidad en la suspensión de células resultante usando tinción con azul de tripano. Contar las células vivas y muertas en una cámara de recuento Neubauer. Calcular el número de células, la viabilidad y el rendimiento de PHH utilizando las fórmulas de abajo.
   
   Rendimiento (células contadas) = ​​células contadas x factor de dilución x volumen de suspensión celular (ml) x 10.000
   
   rendimiento (hepatocitos / (g de hígado muestra de tejido)) = (rendimiento (hepatocitos / (medios ml)) x volumen de suspensión de células (ml)) / (peso de la muestra de tejido del hígado (g))
   
   viabilidad (%) = 100% x (número de células vivas) / (número total de células)

5. Purificación de los hepatocitos (1 hr)

Nota: Se recomienda esta etapa de purificación, si la viabilidades inferior a 70%.

1. Realizar todos los pasos en el hielo. Preparar un gradiente de densidad 25% mediante la mezcla de solución de gradiente de densidad de 5 ml y 15 ml de PBS para centrifugación en gradiente de densidad.
2. Poner un máximo de 50 células Mio en total de la suspensión celular de los hepatocitos ricos lentamente y con cuidado en la parte superior de la capa de gradiente de densidad de 25% para asegurar que una clara separación de las dos capas se consigue (Figura 2C). Poner los tubos con cuidado en la centrífuga y se centrifuga a 1250 xg, 20 min, 4 ° C sin freno (Figura 2D).
3. Aspirar la suspensión celular restante y las células muertas en la interfase. Dependiendo del contenido de grasa uno también podría aspirar el gradiente de solución de densidad.
   Nota: PHH con bajo contenido de lípidos forman un sedimento denso y el gradiente de densidad puede ser aspirado por completo. PHH con alto contenido en lípidos formar un sedimento más difuso y una gran cantidad de células viables puede permanecer en la solución de gradiente de densidad por encima de la pastilla.
4. Vuelva a suspender los gránulos de hepatocitos con PBS y centrifugar de nuevo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Agrupar los gránulos, se lava de nuevo con PBS y resuspender purificada PHH en medio de hepatocitos de incubación. Realizar el recuento de células como se describe en el paso 4.6.

6. Cultivo de hepatocitos

1. Preparar las placas de cultivo de células para la siembra de PHH recubriéndolos con una matriz extracelular, por ejemplo colágeno de cola de rata (colágeno de tipo I). Preparar el colágeno de cola de rata de acuerdo con el protocolo establecido por Rajan et al. ¹⁷
2. Se diluye la cola de rata colágeno solución madre de 1: 200 en PBS. Transferencia / cm solución de 100 l ² de rata colágeno de cola en las placas de cultivo, teniendo cuidado de que toda la superficie está cubierta. Incubar los plásticos de cultivo de células durante 20 min a temperatura ambiente. Aspirar la solución de colágeno de cola de rata restante.
3. Semilla de 15 x 10 ⁴ hepatocitos / ^cm2 en medio de hepatocitos de incubación sobre la cultura dishes recubierta con colágeno de cola de rata. Cultivar las células en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante al menos 4 horas. Después de 4 horas los hepatocitos se han adherido y el medio puede ser cambiado.
4. Realizar investigaciones en función de la configuración experimental. Se recomienda un tiempo de cultivo de 48 horas para permitir que las células se recuperen del proceso de aislamiento.

7. Aislamiento de células hepáticas no parenquimatosas (1,5-2 h)

1. Centrifugar el sobrenadante recogido (paso 4,5 y 4,6) a 72 xg, 5 min, 4 ° C para eliminar los eritrocitos y hepatocitos restantes. Agrupar los sobrenadantes y centrifugar dos veces para obtener dos sedimentos celulares: 300 xg, 5 min, 4 ° C durante la sedimentación de HSC, LEC y en parte KC y 650 xg, 7 min, 4 ° C para la sedimentación de los restantes KC.
2. Piscina ambos pellets y las vuelve a suspender en HBSS. Preparar un 25% y una densidad del 50% gradientes mediante la mezcla de solución de gradiente de densidad y PBS durante Centrif gradiente de densidadugation (25% de solución de gradiente de densidad: 5 ml solución de gradiente de densidad y 15 ml de PBS, solución de gradiente de densidad de 50%: solución de gradiente de 10 ml de densidad y 10 ml de PBS, ver Figura 2). Colocar la solución de gradiente de densidad 25% cuidadosamente en la parte superior de la capa de solución de gradiente de densidad de 50%.
3. Ponga la suspensión NPC con cuidado y poco a poco en la parte superior de la capa de solución de gradiente de densidad de 25% de una manera que se consigue una clara separación de las dos capas.
4. Centrifugar la suspensión de células en el gradiente de densidad en 1.800 xg, 20 min, 4 ° C sin freno (Figura 2.2).
5. Aspirar las células muertas y restos de células de la capa superior. El NPC se encuentran en la interfase entre la capa de gradiente de densidad de 25% y 50% (Figura 2). Recoger la APN, lavarlos con HBSS y se centrifuga la suspensión celular aplicando el paso de doble centrifugación descrito anteriormente (punto 7.2.).

8. separación de las células de Kupffer (adherenciaEtapa de Separación) (1 h)

1. Realizar un recuento de células para el KC en la fracción de la APN como se describe en el paso 4.6. (Para aparición de KC en suspensión véase la Figura 3B). Centrifugar la fracción NPC con la etapa de centrifugación de doble descrita anteriormente (paso 7.2) y volver a suspender el medio NPC en Kupffer la siembra de células (Tabla 2).
2. Sembrar la fracción que contiene KC en recipientes de cultivo celular de plástico a una densidad de 5 x 10 ⁵ KC / ^cm2. Los cultivos se incuban KC durante 20 minutos en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO _2. KC primaria se adhieren sobre plásticos de cultivo de células dentro de un corto período de tiempo (Figura 2.3).
3. Recoger el sobrenadante que contiene no adherido APN, que consiste principalmente de LEC y HSC. Piscina los sobrenadantes para la separación posterior de LEC (véase la sección 9) y HSC (véase el apartado 10). Lavar el adherente KC con HBSS y cultivarlas en Kupffer medio de cultivo de la célula (Tabla 2) a 37 ° C, 5% de CO₂ en una incubadora humidificada.

9. Separación de las células endoteliales (1,5 hr)

1. Centrifugar el sobrenadante recogido (etapa 8.5.) En 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lavar el pellet con PBS. Después de la centrifugación a 300 xg, 5 min, 4ºC volver a suspender las células en Stellate celular / medio de separación de células endoteliales y realizar un recuento de todas las células restantes como se describe en el paso 4.6.
2. Vuelva a suspender 1 x 10 ⁷ células Mio en 1 ml de las células estrelladas / medio de separación de células endoteliales, añadir 20 l solución de bloqueo de la MACS-KIT y 20 l de los granos del CD31 Micro para immunolabeling e incubar la suspensión resultante durante 15 minutos a 4 temperatura ° C (Figura 2.4).
3. LEC separado de HSC como se describe en el protocolo manufacturer's para el sistema de clasificación de células activadas magnéticamente MACS (Figura 2.5). Eluir magnéticamente retenido LEC CD31-positivas y suspenderlos en Stellate Cell / medio de cultivo de células endoteliales (Tabla 2).
4. Realizar celular contando para LEC como se describe en el paso 4.6. LEC de semillas en una densidad de 1,25 x 10 ⁵ células / cm ² en recipientes de cultivo celular recubiertas con colágeno de cola de rata (véase el paso 6.1). Cultivar las células a 37 ° C, 5% de _CO2 en un incubador humidificado.

10. Separación de células estrelladas (0,5 hr)

1. Sin etiqueta HSC pasar la columna de separación durante el procedimiento MACS. Recoger la fracción HSC (véase el paso 9.5, figura 2.5). Realizar el recuento de células como se describe en el paso 4.6.
2. HSC semilla con una densidad de 5 x 10 ⁴ células / cm ² en recipientes de cultivo celular recubiertas con colágeno de cola de rata (véase el paso 6.1) en Stellate celular / medio de cultivo de células endoteliales (Tabla 2) y cultivarlas a 37 ° C, 5% CO ₂ en un incubador humidificado.

Tabla 1: perfusión y solución de aislamiento.

Tabla 2: Cultivo y aislamiento medios de comunicación.

Resultados

La separación en una fracción del parénquima y no parenquimatosas, usando centrifugación en gradiente de densidad como un procedimiento de limpieza en combinación con el uso de propiedades de adherencia y MACS conduce a éxito PHH y NPC aislamiento. PHH y el CNP se pueden aislar en alta calidad y en cantidad. La figura 1 muestra la configuración representante del equipo para la perfusión del hígado y la digestión. 10% de FCS se añadió a la colagenasa P que con...

Discusión

El protocolo publicado describe una técnica para aislar puro PHH y NPC, a saber, KC, HSC y LEC, a la vez de alta calidad y pureza a partir de la misma muestra de tejido hepático humano. La mayoría de las publicaciones que se ocupan de aislamientos de células del hígado cubren sólo una de esas poblaciones de células ^18-20 y procedimientos de aislamiento realizadas con tejidos humanos son raros (revisado por Damm y col.) ^21. Adaptación de los métodos establecidos con el tejido anima...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G