Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Resumo

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Resumo

Ao lado de hepatócitos do parênquima, o fígado é composto de células não-parenquimatosas (NPC), como as células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e células estreladas hepáticas (HSC). Bidimensional (2D) de cultura de hepatócitos humanos primários (PHH) ainda é considerado como o "padrão de ouro" para testes in vitro do metabolismo do fármaco e hepatotoxicidade. É bem conhecido que a monocultura 2D da PHH sofre de desdiferenciação e perda de função. Recentemente, foi mostrado que NPC hepática desempenham um papel central no fígado (pato-) fisiologia e a manutenção das funções PHH. A investigação actual centra-se na reconstrução de tecidos in vivo pela arquitectura 3d- e co-cultura de modelos para ultrapassar as limitações de monoculturas 2D. Anteriormente, publicou um método para isolar células do fígado humano e investigado o uso destas células para a sua utilização em culturas de células em Biologia Experimental e Medicina ^1. Com base no amplo interesse neste technique o objetivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento das células do fígado, incluindo um vídeo, o que permitirá uma fácil reprodução desta técnica.

células de fígado humano foram isoladas a partir de amostras de tecido de fígado humanas de intervenções cirúrgicas por uma técnica de perfusão P EGTA / colagenase em dois passos. PHH foram separadas a partir do APN por uma centrifugação inicial a 50 x g. Densidade passos de centrifugação de gradiente foram usadas para a remoção de células mortas. populações de células de fígado individuais foram isolados a partir da fracção enriquecida NPC usando as propriedades de células específicas e os procedimentos de separação de células. Ao lado do isolamento PHH fomos capazes de separar KC, LEC e HSC para posterior cultivo.

Tomados em conjunto, o protocolo apresentado permite o isolamento de PHH e NPC em alta qualidade e a quantidade de amostra de tecido de um dador. O acesso a populações de células do fígado purificados poderia permitir a criação de in vivo como li humanamodelos Ver.

Introdução

tecido de fígado humano é altamente complexo e consiste em duas entidades diferentes de células, células parenquimatosas e células não-parenquimatosas (NPC). células parenquimatosas do fígado incluem hepatócitos e cholangiocytes. Hepatócitos representam 60 a 70% das células do fígado totais e representam a maioria das funções metabólicas no fígado, por exemplo, ácidos biliares e complementar a síntese de factor de, biotransformação e metabolismo energético ^2,3.

A fracção mais pequena NPC constitui 30-40% do total de células de fígado. NPC incluem diferentes populações de células, ou seja, células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e as células estreladas hepáticas (HSC). Esta fracção de células heterogénea desempenha um papel central em processos fisiológicos do fígado. Além disso, NPC participar na mediação de lesão hepática aguda, por exemplo, lesão hepática induzida por drogas (DILI), assim como em lesões hepáticas crónicas, tais como a cirrose ^4.

Nos últimos anos, hcélulas do fígado uman tornaram-se cada vez mais essencial na pesquisa e desenvolvimento de testes de drogas, o desenvolvimento de drogas e identificação de novos caminhos bioquímicos em doenças do fígado. Para os testes in vitro monoculturas PHH ainda são considerados como o "padrão ouro" ^5. A principal limitação dos modelos actuais homotípicas fígado é desdiferenciação e perda de função dos hepatócitos em poucos dias ^4. O estabelecimento de 3-dimensionais (3D técnicas de cultura) mostrou que estas limitações podem ser compensadas ^4,6. No entanto, mesmo modernas técnicas de cultura 3D não são capazes de exibir todos os modos hepatotóxicos de ações ^7. Faltando populações NPC em modelos in vitro existentes são discutidos como uma possível razão para esta discrepância com a situação in vivo. Tem sido demonstrado que a comunicação célula-célula entre as diferentes populações de células de fígado desempenha um papel central na homeostase fisiológica, mas também em pathophysiologic processa ^8. Portanto, a atenção científica se concentra cada vez mais em NPC e suas interações célula-célula. Seu uso proposital em sistemas de engenharia de tecidos co-cultura e poderia ser uma solução para a elevada procura de modelos in vitro do fígado ^8,9, que são o mais próximo possível da situação in vivo quanto possível.

Atualmente, o principal desafio é o desenvolvimento de um modelo de co-cultura fígado humano padronizado, que contém partes claramente definidas de PHH e NPC. Em consequência, as técnicas de isolamento para as células do fígado muito heterogéneos são necessários e aqueles tem que ser optimizado para obter populações de células puras. Enquanto protocolos padronizados para isolamento PHH existem ^10, o isolamento padronizado de NPC humano ainda está em desenvolvimento. Protocolos de isolamento mais NPC publicados são baseadas em experiências com células não-humanos ^11,12. Apenas algumas publicações descrevem o processo de isolamento do NPC humana e mais cobrem apenasmétodos para o isolamento de um único tipo de célula ^11-16. As características mais importantes de células que foram aproveitadas para a separação de células são de tamanho, densidade, o comportamento de fixação, e a expressão de proteínas de superfície. Na base destas características foi desenvolvido um protocolo simplificado para isolar PHH, KC, LEC e HSC, o qual foi publicado anteriormente em Experimental Biology and Medicine ^1. Por causa do grande interesse nesta técnica, o objectivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento de células de fígado incluindo um vídeo, o que permitirá reproduzir a técnica mais facilmente. O protocolo também inclui métodos de controlo de qualidade para avaliação do rendimento e a viabilidade, bem como para a identificação e a pureza avaliação utilizando colorações imunológicas específicas.

Protocolo

Nota: Todas as células foram isoladas a partir de tecido do fígado ressecado não-tumoral humana, que permaneceu após a ressecção parcial do fígado com tumores hepáticos primários ou secundários. O consentimento informado dos pacientes foi obtido de acordo com as diretrizes éticas da Charité - Universitätsmedizin Berlim.

1. Preparação de Materiais e Soluções

1. Esterilizar todos os instrumentos e os materiais com antecedência, para evitar a contaminação bacteriana durante o processo de isolamento.
2. Preparar as soluções necessárias para a perfusão da amostra de tecido do fígado, o processo de isolamento de hepatócitos e células do fígado não-parenquimatosas e o cultivo de células de fígado humanas primárias de acordo com as Tabelas 1 e 2, com excepção da digestão-solução que é preparada imediatamente antes da utilização. Todas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° C e é recomendado para usá-los dentro de 4 semanas após a preparação.
3. Esterilizartodas as soluções que utilizam um filtro top 0,22 garrafa.

2. Preparação da perfusão Equipamento

1. Defina-se a equipamento para a perfusão e a digestão da amostra de tecido do fígado, como mostrado na Figura 1A.
2. Ajustar a temperatura do banho de água a 39 ° C para assegurar a actividade óptima P colagenase durante a perfusão e digestão.

3. perfusão e digestão da amostra de tecido do fígado (1,5 h)

1. Seleccionar uma amostra de tecido com uma cápsula de Glisson intacta a partir do tecido ressecado fígado. Ao cortar a amostra de tecido, tentar obter uma superfície de corte pequena com boas vasos visíveis. Evitar tempos de isquemia quente pelo transporte e manuseio da amostra de tecido do fígado em gelo até perfusão.
2. Aqui o peso de tecido sob condições estéreis e colocar a amostra de tecido do fígado em uma placa de Petri no fluxo de ar laminar. Limpar a superfície da amostra de tecido com uma compressa estéril de remaining sangue e liberar o conjunto cânula usando 1x Perfusão-Solution I para garantir que todos cânula eram permeáveis.
3. Use cola de tecido para fixar as azeitonas das cânulas em alguns vasos sanguíneos maiores. Dependendo do tamanho da amostra de tecido do fígado e o número de vasos na superfície, utilizar uma cânula de definir com 3 a 8 cânulas. Teste a perfusão e verificar se há vazamentos. Fechar todos os vasos sanguíneos, que vazam clara 1x Perfusão-Solution I, com cola de tecido.
4. Colocar a amostra de tecido do fígado canulada para o funil de Buchner sobre o seu disco de filtro perfurado (Figura 1A).
5. Definir a taxa de fluxo da bomba peristáltica entre 7,5 ml / min e 14,6 ml / min, dependendo do número de cânulas e utilizados na resistência do tecido do fígado. Ajustar o caudal de cada vez para garantir que há uma corrente de perfusão mas lento. Perfundir o tecido até que o sangue total é lavada para fora, mas, pelo menos, 20 min. Observe o tecido se tornar mais brilhante em áreas com boas perfusiem.
   Nota: Em alguns casos, pode ser necessário para fixar uma das cânulas com grampos plásticos ou para aumentar a pressão interior de uma área, empurrando suavemente com uma espátula contra a cápsula do fígado, para optimizar a perfusão. A mudança de cor completa para uma luz amarela para cor acastanhada luz indica uma boa perfusão.
6. Mudar o fluido de perfusão à digestão-solução contendo colagenase P (Tabela 1).
7. Reorganizar a configuração (Figura 1A) para a etapa de digestão. Portanto, realizar um fluxo circular da digestão-Solução de acordo com a Figura 1B para até 15 minutos.
   Nota: É crítico para parar imediatamente a perfusão, quando a amostra de tecido de fígado digerido é suficientemente. Uma boa digestão pode ser observado, quando o tecido não mostra sinal de elasticidade tal como avaliada por manutenção de deformações da cápsula, quando é empurrado com uma espátula.

4. Isolamento de hepatócitos (1 h)

1. Turna bomba peristáltica fora e colocar a amostra de tecido do fígado num prato de vidro. Lavar o exterior da amostra de tecido com gelo frio Stop Solution (Tabela 1). Retirar as cânulas da amostra de tecido do fígado. Usar um bisturi para abrir a amostra de tecido do fígado, por incisão no meio da área onde as cânulas foram ligados. Manter cuidado para que a cápsula Glisson's permanece intacta.
2. Lavar o interior da amostra de tecido e, em seguida cobrir toda a amostra de tecido com gelo frio Stop Solution. Agitar suavemente o tecido para libertar as células para fora do tecido.
3. Recolha a suspensão de células e filtrá-la através de um funil olhar (funil de plástico forrado com compressa de gaze) em tubos de 50 ml de plástico. Adicionar mais Stop-Solução para a amostra de tecido do fígado, até um volume final de 500 ml é consumido.
4. Centrifugar a suspensão de células a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante para o isolamento de células não-parenquimatosas mais tarde. Lava-se a pelete de células com PBS (Figura 2A).
5. Centrifugar novamente a suspensão de células a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento em meio de incubação de hepatócitos (Tabela 2, Figura 2B).
6. Determinar o número de células e a viabilidade na suspensão de células resultante utilizando coloração com azul de tripano. Contar as células vivas e mortas em uma câmara de contagem Neubauer. Calcule o número de células, viabilidade e produtividade de PHH usando as fórmulas abaixo.
   
   rendimento (células contadas) = ​​células contadas x factor de diluição x volume de suspensão de células (ml) x 10.000
   
   rendimento (hepatócitos / (g de fígado amostra de tecido)) = (rendimento (hepatócitos / (meios ml)) x volume de suspensão de células (ml)) / (peso da amostra de tecido do fígado (g))
   
   viabilidade (%) = 100% x (número de células vivas) / (número total de células)

5. Purificação de hepatócitos (1 h)

Nota: Este passo de purificação é recomendado, se a viabilidadeé inferior a 70%.

1. Execute todas as etapas no gelo. Preparar um gradiente de densidade de 25% por mistura de 5 ml de solução de gradiente de densidade e 15 ml de PBS por centrifugação em gradiente de densidade.
2. Coloque um máximo de 50 células Mio total de suspensão de células de hepatócitos rico cuidadosamente e lentamente na parte superior da camada de gradiente de densidade de 25% para assegurar que uma clara separação de ambas as camadas é conseguida (Figura 2C). Colocar os tubos cuidadosamente para a centrífuga e centrifugar a 1250 x g, 20 min, 4 ° C sem travagem (Figura 2D).
3. Aspirar a suspensão de células remanescente e as células mortas na interfase. Dependendo do um teor de matéria gorda também pode aspirar o gradiente de densidade-solução.
   Nota: PHH, com baixo teor de lípido formar um sedimento denso e o gradiente de densidade pode ser completamente aspirados. PHH com elevado teor de lípidos formam um sedimento mais difusa e uma grande quantidade de células viáveis ​​podem permanecer na solução de gradiente de densidade acima do sedimento.
4. Re-suspender as pelotas de hepatócitos com PBS e centrifugar novamente a 50 x g, 5 min, 4 ° C. Reúnem-se os aglomerados, lavar novamente com PBS e re-suspender purificada PHH em meio Hepatócito incubação. Efectuar a contagem das células, como descrito no passo 4.6.

6. A cultura de hepatócitos

1. Prepare os pratos de cultura de células para a semeadura do PHH revestindo-os com uma matriz extracelular, por exemplo, colagénio de cauda de rato (colagénio do tipo I). Prepare o colagénio da cauda de rato de acordo com o protocolo estabelecido por Rajan et al. ¹⁷
2. Dilui-se a solução de colagénio da cauda de rato a 1: 200 em PBS. Transferência / cm solução de 100 ul ² rat colagénio de cauda nas placas de cultura, tomando cuidado para que toda a superfície é coberta. Incubar os plásticos de cultura de células durante 20 minutos à temperatura ambiente. Aspirar a restante solução de colagénio de cauda de rato.
3. Semente de 15 x 10 ⁴ hepatócitos / cm ² em meio de incubação em Hepatócito dishe culturas revestidos com colagénio de cauda de rato. Cultivar as células numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante pelo menos 4 h. Após 4 h os hepatócitos aderiram e a forma pode ser alterada.
4. Realizar pesquisas, dependendo da configuração experimental. Um tempo de cultura de 48 horas é recomendado para permitir que as células para recuperar do processo de isolamento.

7. O isolamento das células do fígado não-parenquimatosas (1,5-2 h)

1. Centrifugar o sobrenadante recolhido (passo 4,5 e 4,6) a 72 x g, 5 min, 4 ° C para eliminar os eritrócitos e hepatócitos remanescentes. Reúnem-se os sobrenadantes e centrifuga-se duas vezes para obter dois sedimentos celulares: 300 xg, 5 min, 4 ° C durante a sedimentação de HSC, LEC e, em parte, KC e 650 xg, 7 min, 4 ° C durante a sedimentação do restante KC.
2. Piscina ambos os pellets e re-suspendê-las em HBSS. Prepare um 25% e um gradiente de densidade de 50% de mistura de solução de gradiente de densidade e PBS para Centrif gradiente de densidadeugation (25% de solução de gradiente de densidade: 5 ml de solução de gradiente de densidade e 15 ml de PBS, solução de gradiente de densidade de 50%: solução de gradiente de densidade de 10 ml e 10 ml de PBS, ver Figura 2). Coloque a solução com gradiente de densidade de 25% cuidadosamente no topo da camada de solução de gradiente de densidade de 50%.
3. Coloque a suspensão NPC cuidadosamente e lentamente na parte superior da camada de solução de gradiente de densidade de 25% de uma forma que é conseguida uma clara separação das duas camadas.
4. Centrifugar a suspensão de células em gradiente de densidade a 1800 xg, 20 min, 4 ° C sem travagem (Figura 2.2).
5. Aspirar as células mortas e detritos celulares a partir da camada superior. A APN estão localizadas na interface entre a camada de gradiente de densidade de 25% e 50% (Figura 2). Recolhe NPC, lavá-las com HBSS e centrifugar a suspensão de células a aplicação do passo de centrifugação acima descrito dupla (passo 7.2.).

8. Separação de células de Kupffer (AderênciaSeparação Passo) (1 h)

1. Executar uma contagem de células para o KC na fracção NPC tal como descrito na etapa 4.6. (Para aparecimento de KC em suspensão ver Figura 3B). Centrifugar a fracção NPC com o passo de centrifugação dupla acima descrito (passo 7.2) e re-suspender o NPC na Kupffer celular meio de sementeira (Tabela 2).
2. Semente da fracção contendo KC em vasos de cultura de células de plástico a uma densidade de 5 x 10 ⁵ KC / cm ^2. Incubam-se as culturas KC durante 20 min numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO _2. KC primária aderir em plásticos de cultura de células dentro de um curto período de tempo (Figura 2.3).
3. Recolher o sobrenadante contendo não aderiu NPC, que consiste principalmente de LEC e HSC. Reúnem-se os sobrenadantes para a separação posterior do LEC (ver secção 9) e HSC (ver secção 10). Lava-se a KC aderente com HBSS e cultivar-los em Kupffer meio de cultura celular (Tabela 2), a 37 ° C, 5% de CO_2, num incubador humidificado.

9. Separação de Células Endoteliais (1,5 h)

1. Centrifugar o sobrenadante recolhido (passo 8.5.) A 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lava-se a pelete com PBS. Após centrifugação a 300 xg, 5 min, 4 ° C, re-suspender as células em Stellate celular / meio de separação celular endotelial e executar uma contagem de células para todas as células restantes como descrito no passo 4.6.
2. Re-suspender a 1 x 10 ⁷ células Mio em 1 ml Stellate Celulares / meio de separação celular endotelial, adicionar 20 ul de solução bloqueadora do MACS-Kit e 20 ul da CD31 micro esferas de imunomarcação e incubar a suspensão resultante durante 15 min a 4 ° C de temperatura (Figura 2.4).
3. LEC independente de HSC, tal como descrito no protocolo MANUFACTURER'S para o sistema de separação de células activadas magneticamente MACS (Figura 2.5). Eluir LEC CD31-positivo magneticamente retida e suspendê-las em C StellateEll / meio de cultura de células endoteliais (Tabela 2).
4. Efectuar a contagem de células para LEC tal como descrito na etapa 4.6. LEC semente em uma densidade de 1,25 x 10 ⁵ células / ^cm2 em vasos de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato (ver passo 6.1). Cultivar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 num incubador humidificado.

10. Separação de células estreladas (0,5 h)

1. Unlabeled HSC passar a coluna de separação durante o procedimento MACS. Recolher a fracção HSC (veja o passo 9.5, Figura 2.5). Efectuar a contagem das células, como descrito no passo 4.6.
2. HSC de sementes com uma densidade de 5 x 10 ⁴ células / ^cm2 em vasos de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato (ver passo 6.1) em Stellate celular / meio de cultura de células endoteliais (Tabela 2) e cultivam-los a 37 ° C, 5% _CO2 numa incubadora humidif içada.

Tabela 1: perfusão e solução de isolamento.

Tabela 2: Cultura e isolamento de meios de comunicação.

Resultados

A separação em uma fracção parenquimal e não-parenquimatosas, utilizando gradiente de densidade de centrifugação como um procedimento de limpeza combinada com a utilização de propriedades de aderência e MACS leva a PHH bem sucedida e isolamento NPC. PHH e NPC pode ser isolado em alta qualidade e de quantidade. A Figura 1 mostra a configuração representativa do equipamento para a perfusão do fígado e digestão. 10% de FCS foi adicionado à colagenase P conte...

Discussão

O protocolo publicado descreve uma técnica para isolar pura PHH e NPC, nomeadamente KC, HSC e LEC, ao mesmo tempo de alta qualidade e pureza a partir de uma mesma amostra de tecido de fígado humano. A maioria das publicações que tratam de isolamentos de células hepáticas cobrir apenas uma dessas populações de células ^18-20 e procedimentos de isolamento realizados com o tecido humano são raros (revisado por Damm et al.) ^21. Adaptação de métodos estabelecidos com tecido animal <...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G