Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Zusammenfassung

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Zusammenfassung

Neben parenchymal Hepatozyten besteht die Leber von nicht-Parenchymzellen (NPC) nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und hepatischen Sternzellen (HSC). Zweidimensionale (2D) Kultur von primären humanen Hepatozyten (PHH) gilt bis heute als "Goldstandard" betrachtet für in vitro - Untersuchung von Arzneimittelmetabolismus und Hepatotoxizität. Es ist bekannt, dass die 2D-Monokulturen von PHH von Entdifferenzierung und Funktionsverlust leidet. Kürzlich wurde gezeigt, dass hepatische NPC eine zentrale Rolle in der Leber (patho-) Physiologie spielen und die Wartung von PHH Funktionen. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Rekonstruktion von in - vivo - Gewebearchitektur von 3D- und Co-Kultur - Modelle , die Grenzen von 2D - Monokulturen zu überwinden. Vorveröffentlichten wir ein Verfahren menschlichen Leberzellen zu isolieren und untersucht um die Eignung dieser Zellen für ihre Verwendung in Zellkulturen in Experimental Biology and Medicine ^1. Auf Basis des breiten Interesses an dieser tedas Ziel dieses Artikels chnique war ein detaillierteres Protokoll für den Leberzellisolierungsverfahren einschließlich eines Video zu schaffen, das eine einfache Reproduktion dieser Technik ermöglicht.

Menschliche Leberzellen wurden aus menschlichen Lebergewebeproben von chirurgischen Eingriffen einem zweistufigen EGTA / Kollagenase P Perfusionstechnik isoliert. PHH wurden aus dem NPC durch eine anfängliche Zentrifugation bei 50 x g abgetrennt. Dichtegradientenzentrifugation Schritte wurden zur Entfernung von abgestorbenen Zellen verwendet. Einzelne Leberzellpopulationen wurden aus dem angereicherten NPC-Fraktion unter Verwendung von spezifischen Zelleigenschaften und Zellsortierverfahren isoliert. Neben der PHH Isolation konnten wir KC, LEC und HSC für die weitere Kultivierung zu trennen.

Zusammengenommen können die präsentierten Protokoll die Isolierung von PHH und NPC in hoher Qualität und Quantität von einem Spender Gewebeprobe. Der Zugriff auf gereinigte Leberzellpopulationen könnte die Schaffung von in vivo wie menschliche li erlaubenver-Modelle.

Einleitung

Menschliche Lebergewebe ist sehr komplex und besteht aus zwei verschiedenen Zelleinheiten, Parenchymzellen und nicht-parenchymale Zellen (NPC). Parenchymale Leberzellen umfassen Hepatozyten und Cholangiozyten. Hepatozyten repräsentieren 60 bis 70% der gesamten Leberzellen und machen die meisten der metabolischen Leberfunktionen, zB Gallensäure und Komplementfaktor Synthese, Biotransformation und Energiestoffwechsel ^2,3.

Je kleiner NPC Fraktion bildet 30-40% der gesamten Leberzellen. NPC umfassen verschiedene Zellpopulationen, nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und die hepatischen Sternzellen (HSC). Diese heterogene Zellfraktion spielt eine zentrale Rolle in physiologischen Prozessen der Leber. Ferner nehmen NPC akute Leberschäden bei der Vermittlung, zB arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI) sowie bei chronischen Leberverletzungen, wie Zirrhose ^4.

In den letzten Jahren hUman Leberzellen haben sich mehr und mehr wesentlich in Forschung und Entwicklung von Drogentests, Arzneimittelentwicklung und Identifizierung von neuen biochemischen Wege bei Lebererkrankungen werden. Für in - vitro - Tests PHH Monokulturen sind immer noch als der "Goldstandard" ⁵ betrachtet. Die Hauptbeschränkung der gegenwärtigen homotypische Leber Modelle Dedifferenzierung , und Funktionsverlust der Hepatozyten innerhalb weniger Tage ^4. Die Einrichtung von 3-dimensionalen (3D) Kulturverfahren hat gezeigt , dass diese Einschränkungen ^4,6 ausgeglichen werden können. Aber auch moderne 3D - Kulturtechniken sind nicht in der Lage , alle hepatotoxischer Modi der Aktionen ⁷ angezeigt werden soll . Fehlende NPC Populationen in den bestehenden in vitro - Modelle werden als möglicher Grund für diese Diskrepanz auf die in vivo Situation diskutiert. Es hat sich gezeigt, dass die Zell-Zell Kommunikation eine zentrale Rolle zwischen den verschiedenen Leberzellpopulationen gezeigt in physiologischen Homöostase spielt, sondern auch in pathophysiologic verarbeitet ^8. Deshalb ist die wissenschaftliche Aufmerksamkeit konzentriert sich mehr und mehr auf NPC und ihre Zell-Zell-Interaktionen. Ihre gezielte Einsatz in Co-Kultur und Tissue Engineering Systeme könnte eine Lösung für die hohe Nachfrage von in - vitro - Leber - Modelle ^8,9 sein , die so nahe an die in - vivo - Situation wie möglich.

Derzeit ist die größte Herausforderung ist die Entwicklung eines standardisierten humanen Leber Co-Kultur-Modell, das klar definierte Abschnitte von PHH und NPC enthält. In der Folge Isolationstechniken für die sehr heterogene Leberzellen benötigt werden und diejenigen müssen optimiert werden, um reine Zellpopulationen zu gewinnen. Während standardisierte Protokolle für die Isolierung PHH ¹⁰ vorhanden ist , ist die standardisierte Isolierung menschlicher NPC noch in der Entwicklung. Die meisten veröffentlichten NPC Isolation Protokolle basieren auf Experimenten mit nicht-menschlichen Zellen ^11,12. Nur wenige Publikationen beschreiben die Isolierung Prozess der menschlichen NPC und die meisten decken nurVerfahren zur Isolierung von einem Zelltyp ^11-16. Die wichtigsten Zelleigenschaften, die für die Zellseparation genutzt wurden, sind Größe, Dichte, Bindungsverhalten und der Expression von Oberflächenproteinen. Auf der Grundlage dieser Eigenschaften entwickelten wir ein vereinfachtes Protokoll PHH, KC, LEC und HSC zu isolieren, die zuvor ¹ in Experimental Biology and Medicine veröffentlicht wurde. Aufgrund des breiten Interesses an dieser Technik war es das Ziel dieses Artikels ein detaillierteres Protokoll für die Leberzellisolierungsverfahren, um ein Video mit, die die Technik leichter reproduzieren können. Das Protokoll enthält auch Qualitätskontrollverfahren zur Ermittlung der Ausbeute und Lebensfähigkeit sowie zur Identifikation und Reinheits Auswertung unter Verwendung von spezifischen Immunfärbungen.

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Protokoll

Anmerkung: Alle Zellen von resezierten nicht-tumorösen menschlichen Lebergewebe isoliert wurden, die nach partieller Leberresektion mit primären oder sekundären Lebertumoren geblieben. Universitätsmedizin Berlin - Einverständniserklärung der Patienten wurde nach den ethischen Richtlinien der Charité erhalten.

1. Herstellung von Materialien und Lösungen

1. Sterilisieren alle Instrumente und die Materialien im Voraus eine bakterielle Kontamination während des Isolationsprozesses zu vermeiden.
2. Herstellung der Lösungen für die Perfusion der Leber Gewebeprobe erforderlich, den Isolationsprozess der Hepatozyten und nicht-parenchymalen Leberzellen und die Kultivierung von primären humanen Leberzellen gemäß den Tabellen 1 und 2, mit Ausnahme der Digestion-Lösung , die frisch zubereitet Vor dem Benutzen. Alle Lösungen können bei 4 ° C gelagert werden, und es wird empfohlen, sie innerhalb von 4 Wochen nach der Herstellung zu verwenden.
3. SterilisierenAlle Lösungen, die eine 0,22 um Flaschenaufsatz-Filter.

2. Herstellung von Perfusionsausrüstung

1. Stellen Sie die Ausrüstung für die Perfusion und die Verdauung der Leber Gewebeprobe, wie in 1A gezeigt.
2. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 39 ° C optimal Kollagenase P-Aktivität während der Perfusion und die Verdauung zu gewährleisten.

3. Perfusion und Verdauung der Leber Gewebeprobe (1,5 h)

1. Wählen Sie eine Gewebeprobe mit einem intakten Glisson-Kapsel aus dem Lebergewebe reseziert. Wenn die Gewebeprobe schneiden, versuchen, eine kleine Schnittfläche mit gut sichtbaren Gefäße zu erhalten. Vermeiden Sie warme Ischämie mal durch den Transport und die Handhabung der Lebergewebeprobe auf Eis, bis die Perfusion.
2. Nehmen Sie das Gewebegewicht unter sterilen Bedingungen und legen Sie die Lebergewebeprobe in einer Petrischale im laminaren Luftstrom. Säubern Sie die Oberfläche der Gewebeprobe mit einer sterilen Kompresse aus reRest Blut und bündig ich die Kanüle Set mit 1x Perfusions-Lösung, um sicherzustellen, dass alle Kanüle durchlässig waren.
3. Verwenden Sie Gewebekleber die Oliven der Kanülen in einigen größeren Blutgefäße zu reparieren. Je nach der Größe der Lebergewebeprobe und die Anzahl der Gefäße auf der Oberfläche, mit einem Kanülensatz mit 3 bis 8 Kanülen. Testen Sie die Perfusion und prüfen Sie auf Leckagen. Schließen Sie alle Blutgefäße, die ich klar 1x Perfusions-Lösung auslaufen, mit Gewebekleber.
4. Legen Sie die Kanüle eingeführt Lebergewebeprobe in den Büchner - Trichter auf dem perforierten Filterscheibe (1A).
5. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit der peristaltischen Pumpe zwischen 7,5 ml / min und 14,6 ml / min auf der Anzahl der Kanülen Abhängigkeit verwendet und auf den Widerstand des Lebergewebes. Anpassen der Durchflussrate jedes Mal um sicherzustellen, dass ein Strom, aber langsame Perfusion ist. Perfuse das Gewebe, bis das gesamte Blut gespült wird, aber mindestens 20 min. Beobachten Sie das Gewebe heller in Gebieten mit guter perfusiauf.
   Anmerkung: In einigen Fällen kann es erforderlich sein, eine der Kanülen festzuklemmen mit Kunststoffklammern oder um den Innendruck eines Bereichs zu erhöhen, indem sanft mit einem Spatel gegen die Leberkapsel drückt, die Perfusion zu optimieren. Eine komplette Farbwechsel zu einem hellgelben bis leicht bräunliche Farbe zeigt eine gute Perfusion.
6. Ändern , um die Perfusionsflüssigkeit zur Digestion-Lösung , die Kollagenase P (Tabelle 1).
7. Ordnen Sie das Setup (Abbildung 1A) für die Verdauung Schritt. Deshalb eine kreisförmige Strömung des Verdaus-Lösung durchzuführen gemäß 1B für bis zu 15 min.
   Hinweis: Es ist wichtig, die Durchblutung sofort zu stoppen, wenn die Lebergewebeprobe ausreichend verdaut wird. Eine gute Verdauung kann beobachtet werden, wenn das Gewebe zeigt keine Anzeichen einer Elastizität durch Aufrechterhaltung der Kapsel Deformationen beurteilt als, wenn sie mit einem Spatel eingeschoben wird.

4. Isolierung von Hepatozyten (1 h)

1. TUrne die peristaltische Pumpe ab und legen Sie die Lebergewebeprobe in einer Glasschale. Spülen Sie die Außenseite der Gewebeprobe mit eiskaltem Stopp-Lösung (Tabelle 1). Entfernen Sie die Kanülen aus der Leber Gewebeprobe. Verwenden eines Skalpells die Leber Gewebeprobe zu öffnen, indem sie in der Mitte des Bereichs, wo die Einschneiden Kanülen angebracht wurden. Halten Sie darauf, dass die Glisson's Kapsel intakt bleibt.
2. Spülen Sie die Innenseite der Gewebeprobe und dann decken die gesamte Gewebeprobe mit eiskaltem Stopp-Lösung. Schütteln, um das Gewebe sanft um die Zellen zu lösen aus dem Gewebe.
3. Sammeln Sie die Zellsuspension und filtern sie durch einen Blick Trichter (Plastiktrichter mit Gazekompresse ausgekleidet) in 50 ml Plastikröhrchen. Noch ein Stop-Lösung zur Leber Gewebeprobe, bis ein Endvolumen von 500 ml verbraucht wird.
4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand für eine spätere nicht Parenchymzelle Isolation. Waschen des Zellpellets mit PBS (2A).
5. Zentrifugieren der Zellsuspension wieder bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und resuspendiere das Pellet in Hepatocyte Incubation Medium (Tabelle 2, 2B).
6. Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit in der resultierenden Zellsuspension unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung. Zählen Sie die lebenden und toten Zellen in einer Neubauer-Zählkammer. Berechnen Sie die Zellzahl, die Lebensfähigkeit und den Ertrag von PHH unter die Formeln.
   
   Ausbeute (gezählten Zellen) = gezählten Zellen x Verdünnungsfaktor x Volumen der Zellsuspension (ml) x 10.000
   
   Ausbeute (Hepatozyten / (g Lebergewebeprobe)) = (Ausbeute (Hepatozyten / (ml Medium)) x Volumen der Zellsuspension (ml)) / (Gewicht der Lebergewebeprobe (g))
   
   Lebensfähigkeit (%) = 100% x (Anzahl der lebenden Zellen) / (Gesamtzellzahl)

5. Reinigung von Hepatozyten (1 h)

Hinweis: Diese Reinigungsstufe wird empfohlen, wenn die Lebensfähigkeitist niedriger als 70%.

1. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis. Bereiten Sie eine 25% Dichtegradienten durch Mischen von 5 ml Dichtegradient-Lösung und 15 ml PBS für Dichtegradientenzentrifugation.
2. Setzen Sie ein Maximum von 50 Mio Zellen insgesamt aus der Hepatozyten - reichen Zellsuspension vorsichtig und langsam auf dem 25% Dichtegradienten Schicht , um sicherzustellen , dass eine klare Trennung der beiden Schichten erreicht (Abbildung 2C). Setzen Sie die Rohre sorgfältig in die Zentrifuge und Zentrifuge bei 1250 · g, 20 min, 4 ° C ohne Bremse (2D).
3. Saugen Sie das restliche Zellsuspension und die toten Zellen in der Zwischenphase. Je nach Fettgehalt könnte man auch die Dichtegradient-Lösung anzusaugen.
   Hinweis: PHH mit niedrigem Fettgehalt ein dichtes Pellet-Form und der Dichtegradient vollständig abgesaugt werden. PHH mit hohem Fettgehalt ein diffuser Pellet und eine Menge an lebenden Zellen bilden sich in der Dichtegradientenlösung über dem Pellet verbleiben.
4. Re-suspend die Hepatozyten-Pellets mit PBS und Zentrifuge wieder bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Pool, die Pellets, waschen wieder mit PBS und erneut zu suspendieren gereinigte PHH in Hepatozyten Inkubationsmedium. Führen Zellzählung als 4.6 in Schritt beschrieben.

6. Der Anbau von Hepatozyten

1. Vorbereitung der Zellkulturschalen für die Aussaat von PHH, indem sie mit einer extrazellulären Matrix Beschichtung, beispielsweise Rattenschwanz-Kollagen (Kollagen-Typ I). Bereiten Sie die Rattenschwanz - Kollagen nach dem Protokoll von Rajan etabliert et al. ¹⁷
2. Verdünnen Sie die Rattenschwanz-Kollagen-Stammlösung 1: 200 in PBS. Transfer 100 ul / cm ² Rattenschwanz Kollagen - Lösung in den Kulturschalen, wobei darauf geachtet , dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren der Zellkultur Kunststoffe für 20 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das restliche Rattenschwanz-Kollagen-Lösung.
3. Seed 15 x 10 ⁴ Hepatozyten / cm ² in Hepatozyten Inkubationsmedium auf Kultur dishes mit Rattenschwanz Kollagen beschichtet. Kultivieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC, 5% CO ₂ für mindestens 4 Stunden. Nach 4 Stunden wurden die Hepatozyten eingehalten und das Medium verändert werden kann.
4. Führen Untersuchungen je nach Versuchsaufbau. Eine Kultivierungszeit von 48 h wird empfohlen, damit die Zellen aus dem Isolationsprozess zu erholen.

7. Isolierung von Nicht-parenchymale Leberzellen (1,5-2 h)

1. Zentrifuge der gesammelte Überstand (Schritt 4.5 und 4.6) bei 72 × g, 5 min, 4 ° C, um die verbleibenden Erythrozyten und Hepatozyten zu beseitigen. Pool der Überstände und Zentrifuge sie zweimal zwei Zellpellets zu gewinnen: 300 · g, 5 min, 4 ° C für die Sedimentation von HSC, LEC und zum Teil KC und 650 · g, 7 Minuten, 4 ° C für die Sedimentation des verbleibenden KC.
2. Pool beide Pellets und resuspendieren sie in HBSS. Bereiten Sie eine 25% und eine Dichte von 50% Gradienten durch Mischen von Dichtegradient-Lösung und PBS für Dichtegradienten Zentri- fugalkrugation (25% Dichtegradient - Lösung: 5 ml Dichtegradient - Lösung und 15 ml PBS, 50% Dichtegradient - Lösung: 10 ml Dichtegradient - Lösung und 10 ml PBS, siehe Abbildung 2). Legen Sie die 25% Dichtegradientenlösung vorsichtig auf der Oberseite der 50% Dichtegradientenlösung Schicht.
3. Setzen Sie den NPC Suspension vorsichtig und langsam auf dem 25% Dichtegradientenlösung Schicht in einer Weise, dass eine klare Trennung der beiden Schichten erreicht wird.
4. Centrifuge die Zellsuspension auf dem Dichtegradienten bei 1.800 × g, 20 min, 4 ° C ohne Bremse (Abbildung 2.2).
5. Aspirat tote Zellen und Zellbruchstücke aus der obersten Schicht. Der NPC werden in der Interphase zwischen 25% und 50% Dichtegradienten Schicht (2) angeordnet ist . Sammeln NPC, waschen Sie sie mit HBSS und Zentrifuge der Zellsuspension die oben beschriebene Doppel Zentrifugationsschritt Anwendung (Schritt 7.2.).

8. Die Trennung von Kupffer-Zellen (AdherenceTrennungsschritt) (1 h)

1. Durchführen einer Zellzahl für die KC in der Fraktion NPC wie in Schritt 4.6 beschrieben. (Bei Auftreten von KC in Suspension siehe 3B). Zentrifuge der NPC - Fraktion mit der oben beschriebenen Doppel Zentrifugationsschritt (Schritt 7.2) und resuspendieren die NPC in Kupffer Zellaussaat - Medium (Tabelle 2).
2. Samen der KC enthaltenden Fraktion auf Kunststoff - Zellkulturgefäßen bei einer Dichte von 5 x 10 ⁵ KC / cm ^2. Inkubieren der KC Kulturen für 20 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2. Primäre KC innerhalb einer kurzen Zeitdauer (Figur 2.3) auf Zellkultur - Kunststoff anhaften.
3. Die überstehende Flüssigkeit nicht eingehalten NPC enthält, die hauptsächlich aus LEC und HSC. Pool der Überstände für eine spätere Trennung von LEC (siehe Abschnitt 9) und HSC (siehe Abschnitt 10). Waschen Sie die anhaftende KC mit HBSS und kultivieren sie in Kupffer Zellkulturmedium (Tabelle 2) bei 37 ° C, 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator.

9. Trennung von Endothelial Cells (1,5 h)

1. Zentrifugieren der Überstand gesammelt (Schritt 8.5.) Bei 300 xg, 5 min, 4 ° C. Waschen Sie das Pellet mit PBS. Nach Zentrifugation bei 300 xg, 5 min, 4 ° C erneut suspendieren der Zellen in Sternzellen / Endothelial Zellseparationsmedium und einer Zellzahl für alle verbleibenden Zellen durchführen, wie in Schritt 4.6 beschrieben.
2. Re-suspend 1 x 10 ⁷ Mio Zellen in 1 ml Sternzellen / Endothelial Zellseparationsmedium, 20 ul hinzufügen Blocking Solution aus der MACS-KIT und 20 ul der CD31 - Mikrokorn für Immunmarkierung und Inkubation der erhaltenen Suspension für 15 min bei 4 ° C Temperatur (Abbildung 2.4).
3. Separate LEC von HSC wie im Herstellerprotokoll für die magnetisch aktivierten Zellsortiersystem MACS (Abbildung 2.5) beschrieben. Eluieren magnetisch gehalten CD31-positive LEC und suspendieren sie in Sternförmige Cell / Endothelial Zellkulturmedium (Tabelle 2).
4. Führen Zelle für LEC Zählen, wie in Schritt 4.6 beschrieben. Seed LEC in einer Dichte von 1,25 x 10 ⁵ Zellen / cm ² in Zellkulturgefäße , beschichtet mit Rattenschwanz - Kollagen (siehe Schritt 6.1). Kultivieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.

10. Die Trennung von Sternzellen (0,5 Stunden)

1. Unbeschriftet HSC passieren die Trennsäule während des MACS Verfahren. Sammeln Sie die HSC - Fraktion (siehe Schritt 9.5, Abbildung 2.5). Führen Zellzählung als 4.6 in Schritt beschrieben.
2. Seed HSC mit einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / cm ² in Zellkulturgefäße , beschichtet mit Rattenschwanz - Kollagen (siehe Schritt 6.1) in Sternzellen / Endothelial Zellkulturmedium (Tabelle 2) und kultivieren sie bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.

Tabelle 1: Perfusion und Isolationslösung.

Tabelle 2: Kultur und Isolation Medien.

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Ergebnisse

Die Trennung in eine parenchymalen und nicht-parenchymalen Fraktion Gradientenzentrifugation als Clean-up-Verfahren unter Verwendung von Dichte mit der Verwendung von Adhärenz kombinierten Eigenschaften und MACS führt zu erfolgreichen PHH und NPC Isolation. PHH und NPC befindet sich in der hohen Qualität und Quantität isoliert werden. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Einrichtung der Ausrüstung für die Leberperfusion und Verdauung. 10% FCS wurde der Kollagenase...

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Diskussion

Die veröffentlichten Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung reiner PHH und NPC, nämlich KC, HSC und LEC, gleichzeitig in hoher Qualität und Reinheit aus der gleichen Probe von menschlichem Lebergewebe. Die Mehrzahl der Publikationen mit Leberzellisolationen Umgang decken nur eine dieser Zellpopulationen ^18-20 und Isolierungsverfahren mit menschlichem Gewebe durchgeführt sind selten (rezensiert von Damm et al.) ^21. Anpassung von Methoden mit tierischem Gewebe etabliert (zB...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G