Протокол для изоляции первичных гепатоцитов человека и соответствующие основные популяциями Non-паренхиматозных клеток печени

Резюме

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Аннотация

Помимо паренхимы гепатоцитов, печень состоит из не паренхимных клеток (NPC), а именно Купфера клетки (KC), печень эндотелиальные клетки (LEC) и звездчатые клетки печени (HSC). Двумерная (2D) культуры первичных человеческих гепатоцитов (ФН) до сих пор считается «золотым стандартом» для тестирования в пробирке метаболизма лекарственных средств и гепатотоксичности. Хорошо известно, что 2D монокультуры ФН страдает от дифференцировке и потерей функции. Недавно было показано, что печеночная NPC играют центральную роль в печени (патологической физиологии) и поддержание функций ФН. В настоящее время исследование фокусируется на реконструкции естественных условиях тканевой архитектуры в 3D- и по совместной культуре моделей , чтобы преодолеть ограничения 2D монокультур. Ранее мы опубликовали способ выделения клеток печени человека и исследовали пригодность этих клеток для их использования в культурах клеток в экспериментальной биологии и медицины ^1. На основе широкого интереса к этому тэchnique цель этой статьи заключалась в обеспечении более подробный протокол для процесса выделения клеток печени, включая видео, что позволит легко воспроизведение этой техники.

Клетки печени человека были выделены из образцов ткани печени человека хирургических вмешательств с помощью двухступенчатого EGTA / коллагеназы техники Р перфузионного. PHH были отделены от NPC начальным центрифугированием при 50 х г. были использованы в градиенте плотности стадии центрифугирования для удаления мертвых клеток. популяции клеток печени Индивидуальные были выделены из обогащенном NPC фракции с использованием специфических свойств ячеек и сортировка клеток процедур. Помимо изоляции PHH мы смогли отделить KC, LEC и HSC для дальнейшего выращивания.

Взятые вместе, представленный протокол позволяет изоляции ФН и NPC в высоком качестве и количестве от одного донора образца ткани. Доступ к очищенным популяций клеток печени может позволить создать в естественных условиях , как человека Liвер моделей.

Введение

ткань печени человек очень сложна и состоит из двух различных сущностей клеток, паренхимных клеток и не-паренхиматозных клеток (NPC). клетки печени паренхиматозных включают гепатоциты и холангиоцитов. Гепатоцитов представляют от 60 до 70% от общего количества клеток печени и составляют большую часть метаболических функций печени, например, желчные кислоты и дополняют синтез фактора, биотрансформации и энергетический метаболизм ^2,3.

Чем меньше фракция NPC составляет 30-40% от общего количества клеток печени. NPC включают в себя различные клеточные популяции, а именно клетки Купфера (KC), печеночная эндотелиальные клетки (LEC) и звездчатых клеток печени (HSC). Эта гетерогенная фракция клеток играет центральную роль в физиологических процессах печени. Кроме того, NPC участвует в опосредовании острого повреждения печени, например, вызванный лекарственными средствами поражения печени (ДИЛИ), а также в хронических повреждений печени, такие как цирроз печени ^4.

В последние годы, чУмань клетки печени становятся все более и более важное значение в области исследований и разработки, тестирования на наркотики разработки лекарственных средств и выявление новых биохимических путей, при заболеваниях печени. Для тестирования в пробирке ФН монокультуры по - прежнему считаются «золотым стандартом» ^5. Основное ограничение тока гомотипических моделей печени является дедифференцировка и потеря функции гепатоцитов в течение нескольких дней ^4. Создание 3-мерных технологий (3D) культуры показал , что эти ограничения могут быть компенсированы ^4,6. Тем не менее, даже современные 3D технологии культуры не в состоянии отобразить все режимы гепатотоксических действий ^7. Недостающие популяции NPC в существующих моделях в пробирке рассматриваются как возможная причина этого несоответствия ситуации в естественных условиях. Было показано, что связь между клетками между различными популяциями клеток печени играет центральную роль в гомеостазе физиологическом, но и в pathophysiologic обрабатывает ^8. Поэтому научное внимание уделяет больше и больше на NPC и их межклеточных взаимодействий. Их целенаправленное использование в совместной культуре и тканевой инженерии систем может быть решением для высокого спроса на модели ^8,9 печени в пробирке , которые как можно ближе к ситуации в естественных условиях , как это возможно.

В настоящее время основной задачей является разработка стандартной модели печени совместно культуры человека, которая содержит четко определенные участки ФН и NPC. В результате, методы изоляции для очень гетерогенные клеток печени необходимы, и те должны быть оптимизированы, чтобы получить чистые популяции клеток. В то время как стандартные протоколы для PHH изоляции существуют ^10, стандартизированная изоляция человека NPC еще находится в стадии разработки. Большинство опубликованных протоколов изоляции NPC основаны на экспериментах с клетками нечеловеческих ^11,12. Лишь немногие публикации описывают процесс изоляции человека NPC и наиболее охватывает толькометоды выделения одной ячейки типа ^11-16. Наиболее важные клеточные характеристики, которые были впряженные для разделения клеток являются размер, плотность, поведение привязанности, и экспрессии поверхностных белков. На основе этих характеристик мы разработали упрощенную протокол для выделения ФН, KC, LEC и HSC, которая была опубликована ранее в экспериментальной биологии и медицины ^1. Из-за широкого интереса к этой технике, цель этой статьи заключалась в обеспечении более подробный протокол для процесса выделения клеток печени, включая видео, которое позволит воспроизводить технику более легко. Протокол также включает в себя методы контроля качества для оценки урожайности и жизнеспособности, а также для выявления и оценки степени чистоты с использованием специфических immunostainings.

протокол

Примечание: Все клетки были выделены из резецированным неопухолевой человеческой ткани печени, которая осталась после частичной резекции печени с первичными или вторичными опухолей печени. Информированное согласие пациентов было получено в соответствии с этическими принципами Шарите - Universitätsmedizin Берлин.

1. Подготовка материалов и решений

1. Стерилизовать все инструменты и материалы заранее, чтобы избежать бактериального загрязнения в процессе выделения.
2. Готовят растворы , необходимые для перфузии образца ткани печени, процессе выделения гепатоцитов и не-паренхиматозных клеток печени и культивирование первичных клеток печени человека в соответствии с таблицами 1 и 2, за исключением переваривания раствором , который получают свеже Перед использованием. Все растворы можно хранить при температуре 4 ° С, и рекомендуется использовать их в течение 4-х недель после приготовления.
3. стерилизоватьвсе решения с использованием бутылки 0,22 мкм верхний фильтр.

2. Подготовка Perfusion оборудования

1. Установить оборудование для перфузии и переваривания образца ткани печени , как показано на рисунке 1А.
2. Отрегулируйте температуру водяной бане до 39 ° С для обеспечения оптимальной активности P коллагеназы в течение перфузии и пищеварения.

3. Кровоснабжение и переваривание ткани печени образца (1,5 ч)

1. Выберите образец ткани с капсулы интактной Глиссон в из резекцию ткани печени. При резке образца ткани, попытаться получить небольшую режущую поверхность с хорошими видимых сосудов. Избегайте теплых раз с ишемией по транспортировке и обращению образца ткани печени на льду до перфузии.
2. Возьмите вес ткани в стерильных условиях и поместить образец ткани печени в чашке Петри в ламинарном потоке воздуха. Очистите поверхность образца ткани со стерильным компрессом от повторногокровь и остальной ее промывать набор с помощью полой иглы 1x-перфузии решение, которое я, чтобы убедиться, что все канюлю были проницаемыми.
3. Используйте клей ткани, чтобы исправить маслины канюли в некоторых крупных кровеносных сосудов. В зависимости от размера образца ткани печени, и количество сосудов на поверхности, используют канюлю набор с 3-х до 8 канюль. Проверьте перфузию и проверить на герметичность. Закройте все кровеносные сосуды, которые просачиваются ясный 1x перфузии-решение, которое я, с клеем ткани.
4. Поместите каннюлирован образец ткани печени в воронку Бюхнера на его перфорированного фильтра диска (рис 1А).
5. Установка скорости потока перистальтического насоса от 7,5 мл / мин и 14,6 мл / мин, в зависимости от количества используемых канюль и на сопротивление ткани печени. Регулировка скорости потока каждый раз, чтобы убедиться, что в настоящее время существует, но медленно перфузия. Заливать ткани, пока вся кровь не смывается, но по крайней мере, 20 мин. Обратите внимание на ткани становятся ярче в районах с хорошими perfusiна.
   Примечание: В некоторых случаях может оказаться необходимым, чтобы зажать один из канюль с пластиковыми зажимами или увеличить внутреннее давление в зоне путем мягко толкая шпателем против капсулы печени, для оптимизации перфузию. Полное изменение цвета в виде светло-желтого до светло-коричневого цвета указывает на хорошую перфузию.
6. Изменение перфузионной жидкости к перевариванию-раствора , содержащего коллагеназы P (таблица 1).
7. Перестановка установки (рисунок 1А) для стадии пищеварения. Поэтому выполнить круговой поток Пищеварение-раствора согласно фигуре 1В до 15 мин.
   Примечание: Очень важно, чтобы немедленно остановить перфузии, когда образец ткани печени достаточно переваривается. Хорошее пищеварение можно наблюдать, когда ткань не проявляет никаких признаков эластичности по оценке содержания капсулы деформаций, когда она выталкивается с помощью шпателя.

4. Выделение гепатоцитов (1 час)

1. Tурну перистальтический насос и поместить образец ткани печени в стеклянной посуде. Промыть наружную поверхность образца ткани охлажденным льдом Стоп-раствор (таблица 1). Удалите канюль из образца ткани печени. Используйте скальпель, чтобы открыть образец ткани печени, путем надреза в середине области, где были прикреплены Канюли. Держите уход, что капсула Glisson's остается неповрежденным.
2. Промыть внутреннюю часть образца ткани, а затем покрывают образец цельной ткани ледяным Стоп-раствор. Встряхните ткань осторожно, чтобы освободить клетки из ткани.
3. Сбор клеточной суспензии и фильтруют ее через воронку (взгляд пластиковой воронки выровненной с марлевым компрессом) в 50 мл пластиковых труб. Добавить еще Стоп-раствор для образца ткани печени до конечного объема 500 мл не расходуется.
4. Центрифуга клеточной суспензии при 50 мкг, 5 мин, 4 ° C. Соберите супернатант для последующего без паренхимы выделения клеток. Промыть осадок клеток с PBS (рис 2А).
5. Центрифуга клеточной суспензии снова при 50 мкг, 5 мин, 4 ° C. Соберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в гепатоцитов инкубационной среде (таблица 2, рис 2B).
6. Определить количество клеток и их жизнеспособность в полученной суспензии клеток с использованием окрашивания трипановым синим. Количество живых и мертвых клеток в счетной камере Neubauer. Подсчитайте количество клеток, жизнеспособность и выход ФН, используя приведенные ниже формулы.
   
   выход (подсчитывали клетки) = подсчитаны клетки х коэффициент разбавления х объем клеточной суспензии (мл) х 10000
   
   выход (гепатоциты / (г печени образец ткани)) = (выход (гепатоциты / (мл среды)) х Объем клеточной суспензии (мл)) / (вес образца ткани печени (г))
   
   Жизнеспособность (%) = 100% х (число живых клеток) / (общее число клеток)

5. Очистка гепатоцитов (1 час)

Примечание: Эта стадия очистки рекомендуется, если жизнеспособностьниже, чем на 70%.

1. Выполните все шаги на льду. Готовят градиент плотности на 25% путем смешивания 5 мл раствора в градиенте плотности и 15 мл PBS для центрифугирования в градиенте плотности.
2. Поместите максимум 50 Mio клеток в общей сложности из гепатоцитов богатых клеточной суспензии осторожно и медленно на вершине 25% слоя с градиентом плотности , чтобы гарантировать , что четкое разделение обоих слоев достигается (фиг.2С). Поместите пробирки осторожно в центрифугу и центрифугируют при 1250 х г , 20 мин, 4 ° C без тормоза (рис 2D).
3. Аспирируйте оставшейся суспензии клеток и мертвых клеток в интерфазе. В зависимости от содержания жира можно также аспирация плотности градиентной раствора.
   Примечание: PHH с низким содержанием липидов образуют плотный осадок и градиент плотности пунктируются полностью. PHH с высоким содержанием липидов образуют более диффузный гранулы и много жизнеспособных клеток может оставаться в растворе в градиенте плотности над осадком.
4. Повторное приостановить гепатоцитов окатышей с PBS и центрифугировать снова при 50 мкг, 5 мин, 4 ° C. Бассейн гранулы, мыть снова PBS и повторно приостанавливать очищенный PHH в гепатоцитов инкубационной среде. Выполнение подсчета клеток, как описано на стадии 4.6.

6. Выращивание гепатоцитов

1. Готовят блюда клеточной культуры для посева ФН путем покрытия их с внеклеточного матрикса, например, крысы хвост коллагена (коллаген типа I). Подготовьте крысиный хвост коллагена в соответствии с протоколом , установленным Rajan и др. ¹⁷
2. Развести крысиного хвоста коллагена маточного раствора 1: 200 в PBS. Передача 100 мкл / см ² раствор крысиного хвоста коллагена в блюда культуры, следя за тем, что покрыта вся поверхность. Инкубируйте пластмасс клеточной культуры в течение 20 мин при комнатной температуре. Аспирируйте оставшуюся крысиный хвост раствора коллагена.
3. Семенной 15 х 10 ⁴ гепатоциты / см ² в гепатоцитов инкубационной среде на культуре disheы покрыты крысиный хвост коллагена. Культивировать клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение по меньшей мере 4 ч. Через 4 часа гепатоциты присоединились, и среда может быть изменена.
4. Выполнение исследований в зависимости от экспериментальной установки. Время культуры 48 часов рекомендуется, чтобы позволить клеткам восстановиться от процесса выделения.

7. Выделение клеток печени Non-паренхимы (1,5-2 ч)

1. Центрифуга собранный супернатант (шаг 4,5 и 4,6) при 72 мкг, 5 мин, 4 ° C, чтобы устранить оставшиеся эритроцитах и ​​гепатоцитах. Объединяют супернатанты и центрифугировать их дважды, чтобы получить две клеточные гранулы: 300 XG, 5 мин, 4 ° С для осаждения HSC, LEC и частично KC и 650 мкг, 7 мин, 4 ° С для осаждения оставшегося KC.
2. Бассейн как гранулы и повторно приостанавливать их в HBSS. Приготовьте 25% и градиенты 50% плотности путем смешивания раствора с градиентом плотности и PBS для градиента плотности Центробежнаяugation (25% раствор градиента плотности: 5 мл плотности раствора градиент и 15 мл PBS, 50% -ный раствор градиента плотности: раствор градиента плотности 10 мл и 10 мл PBS, смотри Рисунок 2). Поместите 25% раствор градиента плотности тщательно поверх слоя раствора в градиенте плотности на 50%.
3. Помещенный подвеску NPC осторожно и медленно поверх слоя раствора в градиенте плотности на 25% таким образом, что четкое разделение обоих слоев достигается.
4. Центрифуга клеточной суспензии на градиенте плотности при 1800 х г , 20 мин, 4 ° C без тормоза (рисунок 2.2).
5. Отберите мертвые клетки и клеточные осколки от самого верхнего слоя. NPC находятся в интерфазе между слоем с градиентом плотности на 25% и 50% (рисунок 2). Сбор NPC, моют их с HBSS и центрифуге суспензии клеток, применяя описанный выше двойной стадии центрифугирования (этап 7.2.).

8. Разделение клеток Купфера (ПриверженностьРазделение Шаг) (1 час)

1. Выполнить подсчет клеток для KC во фракции NPC, как описано на стадии 4.6. (Для появления KC в суспензии рис 3B). Центрифуга фракция NPC , с описанной выше двойной стадии центрифугирования (этап 7.2) и ресуспендируйте NPC в Купфера посева клеток среду (таблица 2).
2. Семя KC фракцию , содержащую на пластиковой емкости для культивирования клеток при плотности 5 × 10 ⁵ KC / см ^2. Инкубацию культуры KC в течение 20 мин в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО _2. Первичный КЦ прилипать на клеточной культуре пластмасс в течение короткого периода времени (рисунок 2.3).
3. Соберите супернатант, содержащий не приклеенный NPC, состоящие в основном из LEC и ГСК. Объединяют супернатанты для последующего разделения LEC (смотри раздел 9) и HSC (смотрите раздел 10). Промыть прилипшие KC с HBSS и культивируют их в купферовских среде для культивирования клеток (таблица 2) при 37 ° C, 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе.

9. Разделение эндотелиальных клеток (1,5 ч)

1. Центрифуга собранный супернатант (шаг 8,5.) При 300 х г, 5 мин, 4 ° C. Вымойте гранул с PBS. После центрифугирования при 300 х г, 5 мин, 4 ° С вновь приостановить клетки в звездчатых Cell / эндотелиальной среде разделения клеток и выполнять подсчет клеток для всех остальных клеток, как описано на стадии 4.6.
2. Повторное приостановить 1 × 10 ⁷ Mio клеток в 1 мл Stellate клеток / Эндотелиальная среднего разделения клеток, добавляют 20 мкл блокирующего раствора из MACS-KIT и 20 мкл CD31 микрошарики для иммунноокрашивания и инкубировать полученную суспензию в течение 15 мин при 4 ° C температура (Рисунок 2.4).
3. Отдельные LEC из ГСК , как описано в протоколе постав для магнитно - активированной клеточной сортировки системы MACS (рисунок 2.5). Элюции магнитно-удерживаемой CD31-положительных LEC и приостановить их в звездчатые CELL / эндотелиальной клеточной культуральной среды (таблица 2).
4. Выполните ячейку подсчета для LEC, как описано в пункте 4.6. Семенной LEC при плотности 1,25 х 10 ⁵ клеток / см ² в культуре клеток сосудов , покрытых коллагеном хвоста крыс (этап 6.1). Выращивают клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в увлажненном инкубаторе.

10. Разделение звездчатых клеток (0,5 ч)

1. Немеченому HSC проходят колонны разделения во время процедуры MACS. Собирают фракцию HSC (см шаг 9.5, рисунок 2.5). Выполнение подсчета клеток, как описано на стадии 4.6.
2. Семенной ГСК с плотностью 5 х 10 ⁴ клеток / см ² в культуре клеток сосудов , покрытых крысиного хвоста коллагена (этап 6.1) в звездчатые Cell / эндотелиальных клеток культуральной среды (таблица 2) и культивируют их при температуре 37 ° С, 5% СО ₂ в увлажненном инкубаторе.

Таблица 1: Перфузия и решение изоляции.

Таблица 2: Культура и изолирующие средства массовой информации.

Результаты

Разделение в паренхимы и не паренхимы фракции, с использованием центрифугирования в градиенте плотности в качестве очищающей процедуры в сочетании с использованием свойств адгезии и MACS приводит к успешному PHH и NPC изоляции. PHH и NPC могут быть выделены в высоком качеств...

Обсуждение

Опубликованный протокол описывает метод для выделения чистого ФН и NPC, а именно KC, HSC и LEC, одновременно с высоким качеством и чистотой из того же образца ткани печени человека. Большинство публикаций , посвященных клеток печени выделениями охватывают только один из этих клеточных попул?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G