Contractilidad Mediciones en músculos papilares aislados para la Investigación de Cardíaca inotropía en ratones

Resumen

Músculo papilar ventricular izquierdo murino se puede utilizar para investigar la contractilidad cardíaca in vitro. En este artículo se describe en detalle el aislamiento y los protocolos experimentales para estudiar las características contráctiles cardiacas.

Resumen

Del músculo papilar aislado a partir de corazones de ratón adulto se puede utilizar para estudiar la contractilidad cardíaca durante las diferentes fisiológicas / condiciones patológicas. Las características contráctiles se pueden evaluar de manera independiente de las influencias externas, como el tono vascular o el estado neurohormonal. Representa un enfoque científico entre las mediciones de células individuales con miocitos cardíacos aislados y los estudios in vivo, como la ecocardiografía. Por lo tanto, preparaciones de músculo papilar sirven como un excelente modelo para estudiar la fisiología cardiaca / fisiopatología y puede ser utilizado para investigaciones como la modulación por agentes farmacológicos o la exploración de modelos de animales transgénicos. Aquí se describe un método para aislar el músculo papilar anterior izquierda murino para investigar la contractilidad cardíaca en una configuración de baño de órganos. En contraste con una preparación tira de músculo aislado de la pared ventricular, el músculo papilar se puede preparar in toto sin dañar el músculo tissue severamente. La configuración de baño de órganos consiste en varias cámaras de baño de órganos de electrodos equipado con control de temperatura, gaseados y. El músculo papilar aislado se fija en la cámara de baño de órganos y estimuló eléctricamente. La fuerza de contracción evocada se registra utilizando un transductor de presión y parámetros tales como contracción fuerza de la amplitud y la contracción se analizan cinética. Diferentes protocolos experimentales se pueden realizar para investigar el calcio y la contractilidad dependiente de la frecuencia, así como curvas dosis-respuesta de los agentes contráctiles tales como catecolaminas u otros productos farmacéuticos. Además, las condiciones patológicas como la isquemia aguda pueden ser simulados.

Introducción

La investigación de las proteínas como los canales iónicos referencia su papel de la contractilidad cardíaca es esencial para descubrir diferentes mecanismos patogénicos y establecer nuevas estrategias terapéuticas para las enfermedades cardiacas como la isquemia y la insuficiencia cardíaca.

La función contráctil de los cardiomiocitos de mamífero se sabe que está modulada por diversos canales iónicos, transportadores y otras proteínas. Potencial de acción evocados activación de tensión depende del sarcolema de tipo L de Ca ^{2 + canales} conduce a Ca ^{2 + afluencia} desde el espacio extracelular y posteriormente a Ca ^{2 + inducida por} Ca ^{2 + liberación} (CICR) ^1, lo que desencadena la contracción celular ^2. Ca ^{2 + -señalización} juega un papel central en la contractilidad cardíaca y la adaptación al estrés fisiológico o patológico. Las catecolaminas activan los receptores beta-adrenérgicos cardíacos, estimulando así la adenilciclasa (AC) que sintetiza cAMP. Al estar activada, protein quinasa A (PKA) fosforila diferentes intracelulares y de membrana proteínas asociadas como de tipo L de Ca ^{2 + canales,} fosfolamban y receptores de rianodina que resulta en la modificación de Ca ^{2 + transitorios} y ^1,3,4 contractilidad cardíaca. cAMP se degrada por la fosfodiesterasa (PDE). La activación de los receptores acoplados a Gs distintos de beta-adrenoceptores también conduce a la acumulación de cAMP.

La técnica de las mediciones de contractilidad en tiras de músculo ventricular aislado está bien establecido para las especies de mamíferos más grandes ^5-8. En base a la posibilidad de orientación de genes en ratones es importante establecer métodos para analizar la fisiología cardiaca murino. Sin embargo, los datos existentes sobre las propiedades fisiológicas de las preparaciones musculares aisladas en ratones difieren dependiendo de las condiciones experimentales ^9-12.

El método descrito se utiliza para analizar la contractilidad cardíaca de pre músculo papilar ventricular izquierdoprepara- in vitro. Investigación de la contractilidad cardiaca se lleva a cabo en ausencia de influencias que modifican la contractilidad cardiaca in vivo, como la presión arterial, la estimulación neurohumoral y estrés físico o metabólico. La tasa de latidos de la preparación muscular contratación puede ser rigurosamente definido y cambió arbitrariamente. Twitch fuerza puede ser analizado en el contexto de estímulos específicos tales como la concentración de calcio, superando la frecuencia o la temperatura. Además, este método puede ser utilizado para investigar diferentes componentes de la vía de señalización y para comparar el rendimiento cardíaco de modelos de ratones modificados genéticamente mediante el control de las condiciones experimentales mencionadas anteriormente.

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Protocolo

NOTA: Los pasos básicos del procedimiento de aislamiento se muestra en la Figura 1 Todas las etapas se describen en detalle en el siguiente protocolo.. El aislamiento del músculo papilar, de montaje en cámara de baño de órganos, la adquisición y el análisis se realiza en un plazo de tiempo consecutivo y obligatoria.

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la legislación alemana sobre protección de los animales y fueron aprobadas por la Junta de Revisión Ética de la Universidad de Heidelberg.

1. Preparación de Instrumentación

1. Para la contractilidad mediciones utilizan una configuración de baño de órganos multicompartimentalizado. Componentes de una instalación de la contractilidad ex vivo baño de órganos se muestran en la Figura 2.
   NOTA: Para reducir al mínimo la cantidad de tiempo entre la preparación del músculo papilar y el comienzo del protocolo experimental, configurar equipos y preparar tampones antes de recoger tissue.This experimentales provides la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos.
2. Poner en marcha los equipos informáticos y adquisición de datos. Encienda el calor baño de órganos (preajustado a 32 ° C) y permitir que las unidades a temperatura preestablecida.
3. Preparar el equipo de adquisición. Iniciar la grabación de datos como se menciona en el manual del software.
4. Comprobar y realizar la calibración (si es necesario) en cada canal y poner a cero todos los canales de normalizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva (asociado a ese canal) a una fuerza de 2 g suministrado por un peso certificado.
5. Abra el suministro de gas (95% O _2/5% de CO ₂₎ a las cámaras de baño de órganos. Gas continuamente todas las cámaras durante todo el protocolo de mediciones.

2. Preparación de tampones y soluciones fisiológicas

1. Preparar una solución de tampón de Krebs-Henseleit para lograr concentraciones finales de NaCl 119 mM; 25 mM NaHCO _3; KCl 4,6 mM; Glucosa 11 mM; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl _2; 1,64 mM _MgSO4; 1,18 mM KH ₂ PO ₄ y ajustar el pH a 7,4 (véase la Tabla 1 solución fisiológica).
2. Prepare la solución tampón de Krebs-Henseleit separado para utilizar durante el aislamiento como se describe en el paso 2.1 con adicional monoxima 30 mM 2,3 butanodiona (BDM) y 50 IE de heparina / ml. Solución Enfriar a 4 ° C (ver Tabla 1 solución de Preparación). Para la simulación isquemia, isquemia preparar-solución como se describe en la Tabla 1.
3. Para el protocolo del Ca ^{2 + -} contractilidad dependiente, añadir Ca ^{2 +} a la solución de tampón de Krebs-Henseleit a una concentración final requerida.
   NOTA: preparar estas soluciones directamente antes de su uso y Gass con carbógeno para evitar la precipitación de carbonato cálcico. Precalentar la solución a 32 ° C antes de usar.

3. Preparación del Tubo y Disección gasificación de vajilla utilizada durante el procedimiento de escisión papilar

1. Conecte un gas suavecantar tubo (diámetro externo de 2.4 mm) para la conexión de gas (oxígeno al 100%, carbógeno alternativamente) con trabajo de expertos.
2. Crear un anillo cerrado del tubo de gasificación apropiado en el interior del plato de disección. Perforar el tubo de gasificación varias veces que un burbujeo continuo está asegurada. Este tubo de gasificación se puede utilizar varias veces.
3. Preparar plato de disección con un elastómero de silicona en la parte inferior (0,5 cm de espesor), de modo que los pines se pueden pegar en ella. Este plato se puede utilizar varias veces.

4. Aislamiento del anterior izquierda papilar muscular de ratones

NOTA: Antes de comenzar el aislamiento del músculo papilar, compruebe que las líneas de gas están libres de obstrucciones.

1. Preparar configuración baño de órganos como se menciona en la sección de protocolo desde 1 hasta 3 antes de iniciar la preparación de los músculos papilares. Preparar todas las soluciones en el día de la prueba.
2. Sacrificar el ratón (aproximadamente 8-12 semanas de edad) por accordi dislocación cervicalng de trabajo de expertos y las directrices institucionales.
3. Fijar el animal en posición dorsal mediante la fijación de las patas delanteras y traseras patas en una tabla de disección, abrir el tórax lateral en ambos lados por el corte a través de las costillas con unas tijeras afiladas de hueso, luego se corta el diafragma con un corte transversal. Retire el pericardio. Ahora el corazón y la aorta son accesibles.
4. Fijar el corazón con unas pinzas romas en el tronco vascular cerca del corazón y separar el corazón rápidamente con las tijeras de los pulmones y el tejido circundante.
5. Transferir el corazón que late a un plato de Petri llena con una solución de preparación enfriado gaseados con oxígeno (paso 2.2). Deje que el corazón lata y estimular las contracciones del corazón suavemente a través de tocar el vértice cardiaco con fórceps.
6. Tan pronto el corazón es completamente exsanguinous, la transferencia a la placa de disección lleno de solución preparación enfriada (paso 2.2) y gaseados con O _2. A partir de este paso en el uso de un microscopio estereoscópico.
7. Fijar el heata con una aguja pequeña a través del ventrículo derecho para que el corazón se ve desde dorsal (ventrículo derecho se encuentra en la parte derecha de la vista del operador).
8. Usando tijeras de microcirugía separan ambas aurículas en el nivel auriculoventricular, corte la conexión de tejido de los ventrículos y descartan. Realizar un corte a través de la pared ventricular desde el nivel de la válvula AV a la punta del corazón evitando cualquier presión mecánica.
9. Abra el ventrículo y fijar la pared libre del lado izquierdo con una pinza, teniendo así un vistazo a ambos músculos papilares del ventrículo izquierdo.
10. Ligeramente cortar el tejido ventricular lateral en ambos lados del músculo papilar anterior izquierda conservando una parte de la vela valvular en la preparación del músculo papilar y evitar tocar o estirar el músculo papilar tanto como sea posible. Diseccionar el tejido de la pared ventricular restante del músculo papilar.
11. Adjuntar hilos de seda (7/0, métrica 0,5) en ambos lados de la preparación del músculo papilarprepa-, uno en la vela valvular y uno en la parte muscular. Fijar la preparación en la cámara de baño de órganos lleno de solución del baño de órganos y gaseados con carbógeno, como se sugiere la temperatura de 32 ° C.

5. Equilibrio y estimulación del músculo papilar

1. Estimular la preparación músculo papilar con pulsos rectangulares (duración de 2 ms y corriente de 100 mA) en la frecuencia de estimulación de 1 Hz inmediatamente después de la fijación en el baño de órganos.
2. Asegurar un cambio frecuente de la solución del baño de órganos, ya sea por el cambio continuo o por el cambio manual de frecuente (cada 5 min) de acuerdo con la configuración del tipo de baño de órganos utilizado.
3. Poco a poco aumentar la pretensión hasta que la fuerza de contracción máxima en llegar. Fuerza de contracción máxima se alcanza cuando el aumento de la pretensión no es seguido por un aumento adicional en la fuerza de contracción.
4. Después de 45-60 min de equilibración, comenzar el protocolo experimental.

6. Sugerido protocolos experimentales para Medidas contractilidad

NOTA: El protocolo experimental descrito a continuación comprende maniobras estándar para caracterizar la contractilidad cardíaca bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. En la sección representativa describimos estos protocolos en detalle que también muestra resultados representativos (véase también el cuadro 2).

1. Grabación y análisis de los protocolos experimentales
   1. Para la grabación, utilice un software adecuado con resolución temporal adecuada (velocidad de adquisición ≥ 1 kHz).
   2. Analizar parámetros incluyendo la fuerza de contracción de amplitud (altura), tiempo hasta el pico de tensión (TTP) y la mitad del tiempo de relajación máxima (R ₅₀ / TFall, respectivamente) como se menciona en el programa de software (como ejemplo gráfico 5.5 de ADInstruments, véase la Figura 4).

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Resultados

El protocolo de este manuscrito para las mediciones de contractilidad del músculo papilar murinos preparaciones aisladas se sintoniza en condiciones óptimas para lograr resultados experimentales reproducibles en condiciones fisiológicas. Para definir las condiciones experimentales óptimas hemos realizado experimentos piloto variables temperatura del baño de órganos y la concentración de calcio extracelular (véase también ^12). El protocolo aquí descrito se realizó con una concentración de calcio ex...

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Discusión

En este manuscrito se describe un método para investigar la contractilidad del músculo papilar murino in vitro que puede ser usado para responder a varias preguntas científicas relacionadas con la fisiología del corazón y de la patología en ratones así como para apoyar el análisis de las líneas transgénicas y el descubrimiento de nuevos enfoques farmacéuticos para el tratamiento de disfunciones cardíacas. Se ilustra el uso de este método para evaluar las propiedades fisiológicas, patológicas y fa...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335