Mesures de contractilité des muscles papillaires isolés sur pour l'Investigation des inotropie cardiaque chez la souris

Résumé

Murine ventriculaire gauche muscle papillaire peut être utilisée pour étudier la contractilité cardiaque in vitro. Cet article décrit en détail l'isolement et des protocoles expérimentaux pour étudier les caractéristiques contractiles cardiaques.

Résumé

Muscle papillaire isolé de coeurs de souris adultes peut être utilisée pour étudier la contractilité cardiaque au cours des différentes physiologiques / conditions pathologiques. Les caractéristiques contractiles peuvent être évaluées indépendamment des influences externes telles que le tonus vasculaire ou le statut neurohumoral. Il représente une approche scientifique entre des mesures de cellules individuelles avec les myocytes cardiaques isolés et dans les études in vivo comme l'échocardiographie. Ainsi, des préparations de muscle papillaire servent comme un excellent modèle pour l'étude de la physiologie cardiaque / physiopathologie et peut être utilisé pour des enquêtes comme la modulation par des agents pharmacologiques ou l'exploration des modèles animaux transgéniques. Ici, nous décrivons un procédé pour isoler le muscle papillaire antérieur gauche de souris pour étudier la contractilité cardiaque dans une installation de bain d'organe. Contrairement à la préparation d'une bande de muscle isolé de la paroi ventriculaire, le muscle papillaire peut être préparé in toto sans endommager le tissu musculairee sévèrement. La configuration du bain d'organe se compose de plusieurs chambres de bain d'organe électrodes-équipée, gazés et à température contrôlée. Le muscle papillaire isolé est fixé dans la chambre de bain d'organe et stimulé électriquement. La force de contraction évoquée est enregistrée en utilisant un transducteur et des paramètres tels que la pression se contracter amplitude de la force et de contraction cinétique sont analysés. Différents protocoles expérimentaux peuvent être réalisées pour étudier le calcium et dépendant de la fréquence ainsi que la contractilité courbes dose-réponse des agents contractiles tels que les catecholamines ou d'autres produits pharmaceutiques. En outre, des conditions pathologiques comme l'ischémie aiguë peuvent être simulées.

Introduction

L'enquête de protéines comme les canaux ioniques référence leur rôle pour la contractilité cardiaque est essentiel de découvrir différents mécanismes pathologiques et d'établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies cardiaques telles que l'ischémie et de l'insuffisance cardiaque.

La fonction contractile des cardiomyocytes de mammifères est connue pour être modulée par divers canaux ioniques, les transporteurs et d'autres protéines. Potentiel d'action activation de sarcolemmique de type L dépendant de la tension évoquée ^canaux Ca2 + conduit à ^influx de Ca 2+ de l'espace extracellulaire et par la suite à Ca ²⁺ induite par Ca ²⁺ de presse (CICR) ^1, ce qui déclenche la contraction cellulaire ^2. Ca ²⁺ -signaling joue un rôle central dans la contractilité cardiaque et l'adaptation au stress physiologique ou pathologique. Catécholamines activent les récepteurs ß-adrénergiques cardiaques, stimulant ainsi l'adénylcyclase (AC) qui synthétise l'AMPc. Étant activé, protein kinase A (PKA) phosphoryle différentes protéines associées intracellulaires et membranaires comme de type L ^canaux Ca 2+, phospholamban et récepteurs de la ryanodine résultant dans la modification de Ca ^{2 + transitoires} et la contractilité cardiaque ^1,3,4. cAMP est dégradée par la phosphodiesterase (PDE). L'activation des récepteurs couplés à Gs autres que les ß-adrénergiques conduit également à l'accumulation de AMPc.

La technique des mesures de contractilité dans des bandes isolées musculaires ventriculaires est bien établie pour les grandes espèces de mammifères ^5-8. Sur la base de la possibilité de ciblage de gène chez la souris, il est important d'établir des méthodes pour analyser la physiologie cardiaque murin. Cependant, les données existantes sur les propriétés physiologiques des préparations musculaires isolées chez des souris diffèrent en fonction des conditions expérimentales ^9-12.

Le procédé décrit est utilisé pour analyser la contractilité cardiaque ventriculaire gauche papillaire de pré musculaireparations in vitro. Etude de la contractilité cardiaque est réalisé en l'absence d'influences modifiant la contractilité cardiaque in vivo, comme la pression sanguine, la stimulation neuro-humoral et le stress physique ou métabolique. Le taux de la préparation traitance musculaire battant peut être rigoureusement défini et modifiées arbitrairement. Twitch force peut être analysée dans le contexte des stimuli spécifiques tels que la concentration de calcium, le battement de fréquence ou de la température. En outre, cette méthode peut être utilisée pour étudier les différents composants de la voie de signalisation et de comparer la performance cardiaque de modèles de souris génétiquement modifiées par le contrôle des conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.

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Protocole

REMARQUE: Les étapes de base de la procédure d'isolement sont présentées sur la figure 1 Toutes les étapes sont décrites en détail dans le protocole suivant.. Isolement du muscle papillaire, le montage dans la chambre de bain d'organe, l'acquisition et l'analyse est effectuée dans un laps de temps consécutif et obligatoire.

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la législation allemande sur la protection des animaux et ont été approuvés par le Conseil de l'Université de Heidelberg examen éthique.

1. Préparation du Instrumentation

1. Pour la contractilité mesures utilisent une configuration à plusieurs chambres de bain d'organe. Les composants d'une installation de bain d'organe ex vivo de la contractilité sont présentés sur la figure 2.
   NOTE: Pour minimiser la quantité de temps entre la préparation du muscle papillaire et le début du protocole expérimental, mis en place l'équipement et préparer des tampons avant de recueillir tissue.This expérimentales provides la plus grande quantité de temps que le tissu reste viable pour mener des expériences.
2. Démarrez l'équipement informatique et l'acquisition de données. Allumez bain d'organe thermique (préréglé à 32 ° C) et de permettre aux unités de température préréglée.
3. Préparer le matériel d'acquisition. Commencer l'enregistrement des données, comme mentionné dans le manuel du logiciel.
4. Vérifier et procéder à l'étalonnage (si nécessaire) sur chaque canal et tous les canaux zéro pour normaliser le signal électrique fourni par le transducteur de force respective (associé à ce canal) à une 2-g force fournie par un poids certifié.
5. Ouvrir l'alimentation de gaz (95% _d'O 2/5% de CO ₂₎ à des chambres de bain d'organes. De gaz sans interruption toutes les chambres pendant les mesures de protocole entières.

2. Préparation des tampons et des solutions physiologiques

1. Préparer une solution de tampon de Krebs-Henseleit à parvenir à des concentrations finales de 119 mM de NaCl; 25 mM de NaHCO _3; KCl 4,6 mM; Glucose 11mm; 1 mM de Na-pyruvate; 1,5 mM de CaCl _2; 1,64 mM _MgSO4; MM KH 1.18 _{2 PO 4} et ajuster le pH à 7,4 (voir le tableau 1 solution physiologique).
2. Préparer une solution tampon de Krebs-Henseleit séparée à utiliser lors de l'isolement comme décrit dans l'étape 2.1 avec supplémentaire monoxime 30 mM 2,3-Butanedione (BDM) et 50 IE héparine / ml. Refroidir à la solution à 4 ° C (voir tableau 1 Préparation de solution). Pour la simulation de l'ischémie, l'ischémie-préparer une solution comme décrit dans le Tableau 1.
3. Pour le protocole du Ca ^{2 + -} dépendante de la contractilité, ^Ca2 + ajouter à la solution de tampon de Krebs-Henseleit à la concentration finale requise.
   REMARQUE: préparer ces solutions directement avant son utilisation et Gass avec carbogène pour éviter la précipitation du carbonate de calcium. Préchauffer la solution à 32 ° C avant utilisation.

3. Préparation du tube et Dissection gazage vaisselle utilisée au cours de la procédure Excision papillaire

1. Branchez un gaz doucechanter tube (diamètre extérieur de 2-4 mm) pour le raccordement de gaz (100% d'oxygène, carbogène alternativement) avec un expert de travail.
2. Créer un anneau fermé du tube de gazage montage à l'intérieur du plat de dissection. Perforer le tube de gazage à plusieurs reprises que un bouillonnement continue est assurée. Ce tube de gazage peut être utilisé plusieurs fois.
3. Préparer plat de dissection avec un élastomère de silicone en bas (0,5 cm d'épaisseur), de sorte que les repères peuvent être bloqués dedans. Ce plat peut être utilisé plusieurs fois.

4. Isolement de gauche antérieur muscle papillaire de souris

REMARQUE: Avant de commencer l'isolement du muscle papillaire, vérifiez que les conduites de gaz sont clairement des blocages.

1. Préparer la configuration du bain organe tel que mentionné dans la section 3.1 de protocole avant de commencer la préparation des muscles papillaires. Préparer des solutions à tous les jours de l'expérience.
2. Sacrifiez la souris (âgé d'environ 8-12 semaines) par dislocation cervicale according de travail d'experts et des directives institutionnelles.
3. Fix l'animal en position dorsale en fixant les pattes de devant et postérieurs pattes sur une planche de dissection, ouvrez le latéral du thorax des deux côtés en coupant à travers les côtes avec des ciseaux d'os pointus, puis couper la membrane avec une coupe transversale. Retirer le péricarde. Maintenant, le coeur et l'aorte sont accessibles.
4. Fixer le coeur avec le forceps émoussé sur le tronc vasculaire à proximité du cœur et de séparer le cœur rapidement avec des ciseaux dans les poumons et les tissus environnants.
5. Transférer le cœur battant d'une boîte de Pétri remplie de solution de préparation refroidie gazés avec l'oxygène (étape 2.2). Laisser le coeur à battre et stimuler les contractions cardiaques doucement par l'intermédiaire de toucher la pointe du cœur avec une pince.
6. Dès le cœur est complètement exsangue, le transférer vers le plat de dissection rempli de solution de préparation refroidi (étape 2.2) et gazés avec O _2. De cette étape sur l'utilisation d'un stéréomicroscope.
7. Fixer la HEAtempérature ambiante avec une petite aiguille à travers le ventricule droit afin que le cœur est vu de dorsale (ventricule droit est situé sur le côté droit de la vue de l'opérateur).
8. L'aide de ciseaux de microchirurgie séparent les deux oreillettes sur le niveau auriculo-ventriculaire, couper le tissu reliant des ventricules et les jeter. Effectuer une coupe à travers la paroi ventriculaire de la valve niveau AV à la pointe du cœur en évitant toute pression mécanique.
9. Ouvrez le ventricule et fixer la paroi libre du côté gauche avec une pince, ayant ainsi un regard à la fois de gauche muscles papillaires ventriculaires.
10. Légèrement couper le latéral du tissu ventriculaire sur les deux côtés du muscle papillaire antérieur gauche en préservant une partie de la voile valvulaire sur la préparation de muscle papillaire et éviter de toucher ou de l'étirement du muscle papillaire autant que possible. Disséquer le reste tissu de la paroi ventriculaire du muscle papillaire.
11. Joindre des fils de soie (7/0, métrique 0,5) sur les deux côtés de la préparation de muscle papillairearation, l'un sur la voile valvulaire et l'autre sur la partie musculaire. Fixer la préparation dans la chambre de bain d'organe rempli de solution de bain d'organe et gazés avec du carbogène, en tant que température de 32 ° C est recommandée.

5. équilibration et la stimulation du muscle papillaire

1. Stimuler la préparation de muscle papillaire avec des impulsions rectangulaires (durée de 2 ms et courant de 100 mA) à la fréquence de stimulation de 1 Hz immédiatement après la fixation dans le bain d'organe.
2. Assurer un changement fréquent de la solution de bain d'organe, soit par le changement continu ou par le changement d'emploi fréquents (toutes les 5 min) en fonction de la configuration du type de bain d'organe utilisé.
3. Augmentez progressivement la prétention jusqu'à ce qu'une force de contraction maximale dans atteint. Force de contraction maximale est atteinte lorsque l'augmentation de la prétention est pas suivie d'une autre augmentation de la force de la secousse.
4. Après 45-60 minutes d'équilibration, démarrer le protocole expérimental.

6. Suggérée protocoles expérimentaux pour les mesures de contractilité

REMARQUE: Le protocole expérimental décrit ci-dessous comprend manœuvres standards pour caractériser la contractilité cardiaque dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Dans la section représentant nous décrivons ces protocoles en détail montrant également des résultats représentatifs (voir également le tableau 2).

1. L'enregistrement et l'analyse des protocoles expérimentaux
   1. Pour l'enregistrement, utilisez un logiciel approprié avec une résolution temporelle adéquate (≥ taux d'acquisition de 1 kHz).
   2. Analyser les paramètres y compris la force de la secousse d'amplitude (hauteur), temps au pic de tension (TTP) et la moitié maximal temps de relaxation (R ₅₀ / TFall, respectivement), comme mentionné dans le programme de logiciel (comme par exemple le graphique 5.5 de ADInstruments, voir la figure 4).

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Résultats

Le protocole de ce manuscrit pour les mesures de contractilité murins isolés de préparations de muscle papillaire est accordé sur les conditions optimales pour obtenir des résultats expérimentaux reproductibles dans des conditions physiologiques. Pour définir les conditions expérimentales optimales nous avons effectué des expériences pilotes variant la température du bain d'organe et de la concentration de calcium extracellulaire (voir aussi ^12). Le protocole décrit ici a été réalisée avec...

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour enquêter sur la contractilité du muscle papillaire murin in vitro qui peut être utilisée pour répondre à plusieurs questions scientifiques liées à la physiologie du cœur et de la pathologie chez la souris ainsi que pour soutenir l'analyse des lignées transgéniques et la découverte de nouvelles approches pharmaceutiques pour traiter les dysfonctionnements cardiaques. Nous illustrons l'utilisation de cette méthode pour évaluer les proprié...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335