Misure contrattilità isolati su muscoli papillari per le inchieste sui Cardiac inotropo nei topi

Riepilogo

Murine sinistra muscolo papillare ventricolare può essere usato per studiare la contrattilità cardiaca in vitro. Questo articolo descrive in dettaglio l'isolamento e protocolli sperimentali per studiare le caratteristiche contrattili cardiaci.

Abstract

Muscoli papillari isolati dai cuori adulte di topo possono essere utilizzati per studiare la contrattilità cardiaca durante le diverse condizioni patologiche / fisiologiche. Le caratteristiche contrattili possono essere valutate in maniera indipendente da influenze esterne, quali tono vascolare o lo stato neuroumorale. Raffigura un approccio scientifico tra le misurazioni di cellule singole con isolate miociti cardiaci e studi in vivo, come l'ecocardiografia. Così, preparazioni muscolo papillare servire come un modello eccellente per studiare la fisiologia cardiaca / patofisiologia e può essere utilizzato per le indagini come la modulazione da agenti farmacologici o l'esplorazione di modelli animali transgenici. Qui, descriviamo un metodo per isolare l'anteriore sinistra muscolo papillare murino di indagare la contrattilità cardiaca in un setup bagno di organo. A differenza di un preparato striscia muscolare isolato dalla parete ventricolare, il muscolo papillare può essere preparato in toto senza danneggiare il muscolo tissuuna e severamente. Il setup bagno organo è composto da diversi elettrodi attrezzate camere a bagno d'organo a temperatura controllata, gasati e. Il muscolo papillare isolato è fissato nella camera bagno di organo e stimolato elettricamente. La forza di contrazione evocata viene registrata utilizzando un trasduttore di pressione e parametri quali contrazione forza ampiezza e contraggono la cinetica vengono analizzati. Diversi protocolli sperimentali possono essere eseguite per indagare la contrattilità e calcio-dipendente dalla frequenza e curve dose-risposta di agenti contrattili come catecolamine o altri farmaci. Inoltre, le condizioni patologiche come l'ischemia acuta possono essere simulati.

Introduzione

L'indagine di proteine ​​come canali ionici che si riferiscono loro ruolo per la contrattilità cardiaca è essenziale per scoprire differenti meccanismi patogenetici e di stabilire nuove strategie terapeutiche per le malattie cardiache come l'ischemia e insufficienza cardiaca.

Funzione contrattile dei cardiomiociti mammiferi è noto per essere modulata da vari canali ionici, trasportatori e altre proteine. Potenziale d'azione evocato attivazione di tensione dipendente sarcolemmal tipo L di Ca ²⁺ canali porta a Ca ²⁺ afflusso dallo spazio extracellulare e successivamente ^Ca2 + indotta rilascio di Ca ²⁺ (CICR) ^1, che innesca la contrazione cellulare ^2. Ca ²⁺ -Segnalazione gioca un ruolo centrale nella contrattilità cardiaca e l'adattamento allo stress fisiologico o patologico. Catecolamine attivano i recettori beta-adrenergici cardiaci, stimolando così ciclasi (AC) che sintetizza cAMP. L'attivazione, Protein chinasi A (PKA) fosforila diverse proteine ​​associate intracellulari e di membrana come L-tipo Ca ²⁺ canali, fosfolambano e recettori rianodinici conseguente modifica di Ca ²⁺ transitori e cardiaco contrattilità ^1,3,4. cAMP è degradata dalla fosfodiesterasi (PDE). L'attivazione dei recettori Gs-accoppiati diversi beta-adrenergici porta anche ad accumulo di cAMP.

La tecnica di misurazione contrattilità in isolati strisce muscolari ventricolare è ben definito per le più grandi mammiferi ^5-8. Sulla base della possibilità di gene targeting in topi è importante stabilire metodi per analizzare murino fisiologia cardiaca. Tuttavia, i dati esistenti sulle proprietà fisiologiche di preparati muscolari isolate in topi variano a seconda delle condizioni sperimentali ^9-12.

Il metodo descritto è utilizzato per analizzare contrattilità cardiaca ventricolare sinistra pre muscolo papillareparations in vitro. Investigation della contrattilità cardiaca viene eseguita in assenza di influenze modificanti contrattilità cardiaca in vivo, come la pressione sanguigna, stimolazione neuroumorale e stress fisico o metabolica. Il tasso di battito della preparazione contraente muscolo può essere rigorosamente definito e cambiato arbitrariamente. Twitch forza può essere analizzato nel contesto di stimoli specifici come concentrazione di calcio, battendo frequenza o temperatura. Inoltre, questo metodo può essere usato per studiare diversi componenti della via di segnalazione e di confrontare funzione cardiaca di modelli murini geneticamente modificati controllando condizioni sperimentali sopra menzionati.

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Protocollo

NOTA: I passaggi fondamentali della procedura di isolamento sono mostrati in Figura 1 Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio nel seguente protocollo.. Isolamento del muscolo papillare, il montaggio in organo da camera bagno, acquisizione e l'analisi viene effettuata in un lasso di tempo consecutivo e obbligatoria.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legislazione tedesca in materia di protezione degli animali e sono state approvate dal Consiglio di esame etico dell'Università di Heidelberg.

1. Preparazione di Instrumentation

1. Per contrattilità misurazioni utilizzare un setup vasca organo multichambered. Componenti di un ex vivo contrattilità configurazione bagno organo sono mostrati nella Figura 2.
   NOTA: Per minimizzare la quantità di tempo tra la preparazione del muscolo papillare e l'inizio del protocollo sperimentale, impostare attrezzature e preparare buffer prima di raccogliere tissue.This sperimentali provides la maggior quantità di tempo che il tessuto rimane vitale per condurre esperimenti.
2. Avviare computer e apparecchiature di acquisizione dati. Attivare bagno organo di calore (preimpostato a 32 ° C) e lasciare unità alla temperatura preimpostata.
3. Preparare l'apparecchiatura di acquisizione. Iniziare la registrazione dei dati come indicato nel manuale del software.
4. Controllare e condurre calibrazione (se necessario) su ciascun canale e azzerare tutti i canali di standardizzare il segnale elettrico fornito dal rispettivo trasduttore di forza (associato a quel canale) a 2 g forza fornita da un peso certificata.
5. Accendere approvvigionamento di gas (95% O _2/5% di CO ₂₎ alle camere bagno organo. Continuamente gas tutte le camere durante l'intero misure di protocollo.

2. Preparazione di Tamponi e soluzioni fisiologiche

1. Preparare una soluzione tampone Krebs-Henseleit per raggiungere concentrazioni finali di 119 mM NaCl; 25 NaHCO _MM 3; 4.6 mM KCl; 11MM glucosio; 1 mM Na-pyruvate; 1.5 mM CaCl _2; 1.64 mM MgSO _4; 1.18 mM KH ₂ PO ₄ e regolare il pH a 7,4 (vedi Tabella 1 soluzione fisiologica).
2. Preparare una soluzione tampone a parte Krebs-Henseleit da utilizzare durante l'isolamento come descritto al punto 2.1 con l'aggiunta di monoxime 30MM 2,3-butanedione (BDM) e 50 IE Eparina / ml. Raffreddare la soluzione a 4 ° C (vedere Tabella 1 Preparazione Soluzione). Per la simulazione ischemia, ischemia preparare soluzione come descritto nella Tabella 1.
3. Per il protocollo del Ca ^{2 + -} contrattilità dipendente, aggiungere Ca ²⁺ alla soluzione tampone Krebs-Henseleit a concentrazione finale richiesta.
   NOTA: preparare queste soluzioni direttamente prima del suo utilizzo e Gass con CarboGen per evitare la precipitazione di Carbonato di Calcio. Soluzione Preriscaldare a 32 ° C prima dell'uso.

3. Preparazione del Gassing Tube e dissezione del piatto utilizzata durante il Excision Procedure papillare

1. Collegare un gas morbidocantare tubo (diametro esterno 2-4 mm) per il collegamento del gas (ossigeno al 100%, CarboGen alternativamente) con l'esperto di lavoro.
2. Creare un anello chiuso del tubo gassazione raccordo all'interno del piatto dissezione. Forare il tubo di gassificazione più volte che una ebollizione continua è assicurata. Questo tubo gassazione può essere utilizzato più volte.
3. Preparare piatto dissezione con un elastomero di silicone nella parte inferiore (0,5 cm), in modo che i perni possono essere bloccati in esso. Questo piatto può essere utilizzato più volte.

4. Isolamento dei anteriore sinistra Muscolo papillare da topi

NOTA: Prima di iniziare l'isolamento del muscolo papillare, controllare che le linee di gas sono chiare di blocchi.

1. Preparare configurazione vasca organo come menzionato nella sezione del protocollo 1-3 prima di iniziare la preparazione dei muscoli papillari. Preparare tutte le soluzioni al giorno dell'esperimento.
2. Sacrifica il mouse (circa 8-12 settimane) da cervicale dislocazione According per linee guida istituzionali di lavoro di esperti e.
3. Fissare l'animale in posizione supina fissando zampe anteriori e posteriori zampe su una tavola di dissezione, aprire il torace laterali su entrambi i lati tagliando attraverso le costole con forbici ossee affilate, poi tagliare la membrana con un taglio trasversale. Rimuovere il pericardio. Ora cuore e l'aorta sono accessibili.
4. Fissare il cuore con una pinza smussato sul tronco vascolare vicino al cuore e separare il cuore rapidamente con le forbici dai polmoni e il tessuto circostante.
5. Trasferire il cuore pulsante di una capsula di Petri riempite con una soluzione preparazione raffreddata gasati con l'ossigeno (punto 2.2). Lasciare che il cuore a battere e stimolare le contrazioni del cuore dolcemente via toccando l'apice cardiaco con una pinza.
6. Non appena il cuore è completamente exsanguinous, trasferirlo al piatto dissezione riempito con soluzione di preparazione raffreddata (passo 2.2) e gasati con O _2. Da questo punto in uso uno stereomicroscopio.
7. Fissare il heaRT con un piccolo perno attraverso il ventricolo destro in modo che il cuore è visto dalla dorsale (ventricolo destro si trova sul lato destro dalla vista dell'operatore).
8. Utilizzando le forbici microchirurgiche separano entrambi gli atri a livello atrioventricolare, taglio tessuto connettivo dai ventricoli e scartare. Effettuare un taglio attraverso la parete ventricolare dalla valvola livello AV all'apice del cuore evitando ogni pressione meccanica.
9. Aprire il ventricolo e fissare la parete libera lato sinistro con una pinza, avendo così uno sguardo a due ventricolo muscoli papillari sinistro.
10. Leggermente tagliare il tessuto ventricolare laterali su entrambi i lati del muscolo papillare anteriore sinistra conservando una parte della vela valvolare sulla preparazione muscolo papillare ed evitare di toccare o allungamento del muscolo papillare quanto possibile. Sezionare il restante tessuto della parete ventricolare dal muscolo papillare.
11. Fissare fili di seta (7/0, metrico 0,5) su entrambi i lati della preparazione muscolo papillarearazione, uno sulla vela valvolare ed una sulla parte muscolare. Fissare la preparazione nella camera bagno di organo pieno di soluzione del bagno organo e gasati con CarboGen, la temperatura a 32 ° C viene consigliata.

5. equilibrazione e stimolazione del muscolo papillare

1. Stimolare la preparazione muscolo papillare con impulsi rettangolari (durata di 2 ms e corrente di 100 mA) a frequenza di 1 Hz stimolazione immediatamente dopo il fissaggio nel bagno organo.
2. Assicurare un frequente ricambio della soluzione del bagno di organo, sia dal cambiamento continuo o da frequenti modifica manuale (ogni 5 min) a seconda dell'impostazione del tipo a bagno d'organo utilizzato.
3. Aumentare gradualmente la pretesa fino a forza contrazione massima a raggiunto. Forza contrazione massima viene raggiunta quando l'aumento del precarico non è seguito da un ulteriore aumento nella forza contrazione.
4. Dopo 45-60 minuti di equilibrio, avviare il protocollo sperimentale.

6. Consigliato protocolli sperimentali per misure contrattilità

NOTA: Il protocollo sperimentale descritto di seguito comprende manovre standard per caratterizzare la contrattilità cardiaca in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Nella sezione rappresentante descriviamo questi protocolli in dettaglio anche mostrando i risultati di rappresentanza (vedi anche tabella 2).

1. Registrazione ed analisi dei protocolli sperimentali
   1. Per la registrazione, utilizzare un software adatto con adeguata risoluzione temporale (velocità di acquisizione ≥ 1kHz).
   2. Analizzare parametri tra cui la forza contrazione ampiezza (altezza), il tempo di picco di tensione (TTP) e per metà tempo di rilassamento massimo _(R 50 / tfall, rispettivamente) come indicato nel programma di software (come ad esempio Grafico 5.5 di ADInstruments, vedi Figura 4).

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Risultati

Il protocollo di questo manoscritto per misure contrattilità isolati murini preparazioni muscolo papillare è sintonizzato per condizioni ottimali per ottenere risultati sperimentali riproducibili in condizioni fisiologiche. Per definire le condizioni sperimentali ottimali abbiamo eseguito esperimenti pilota variabili temperatura del bagno d'organo e la concentrazione di calcio extracellulare (vedi anche ^12). Il protocollo qui descritto è stato eseguito con una concentrazione di calcio extracellulare 1,...

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Discussione

In questo manoscritto si descrive un metodo per indagare la contrattilità del muscolo papillare murino in vitro che può essere utilizzato per rispondere ad alcune domande scientifici relativi alla fisiologia del cuore e la patologia nei topi, nonché per sostenere l'analisi delle linee transgeniche e la scoperta di nuovi approcci farmaceutici per il trattamento di disfunzioni cardiache. Illustriamo l'uso di questo metodo per valutare le proprietà fisiologiche, patologiche e farmacologiche di contratt...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335