Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Resumo

Músculo papilar do ventrículo esquerdo de murino pode ser usado para investigar in vitro a contractilidade cardíaca. Este artigo descreve em detalhes o isolamento e protocolos experimentais para estudar características contráteis cardíacas.

Resumo

Músculo papilar isolado a partir de corações de rato adulto pode ser utilizado para estudar a contractilidade cardíaca durante as diferentes condições patológicas / fisiológicas. As características contráteis pode ser avaliado de forma independente de influências externas, tais como tônus ​​vascular ou o estado neuro-humorais. Descreve uma abordagem científica entre as medições de células individuais com os miócitos cardíacos isolados e estudos in vivo, como a ecocardiografia. Assim, preparações de músculo papilar servir como um excelente modelo para estudar a fisiologia cardíaca / fisiopatologia e pode ser utilizado para investigações como a modulação por agentes farmacológicos ou a exploração de modelos animais transgénicos. Aqui, nós descrevemos um método de isolamento do músculo papilar anterior esquerda murino para investigar a contractilidade cardíaca num banho de órgãos de configuração. Em contraste com a preparação de uma tira de músculo isolado a partir da parede ventricular, o músculo papilar podem ser preparados in toto sem danificar o músculo tissuum e severamente. A configuração banho de órgão é composto por várias câmaras de banho equipada órgão eletrodos, gaseados e com temperatura controlada. O músculo papilar isolado é fixo na câmara de banho de órgãos e estimulado eletricamente. A força de contração evocada é gravada usando um transdutor de pressão e parâmetros, tais como contração amplitude da força e contração muscular cinética são analisados. Diferentes protocolos experimentais podem ser realizadas para investigar o cálcio e contractilidade dependente da frequência, bem como as curvas de dose-resposta de agentes contrácteis, tais como catecolaminas e outros produtos farmacêuticos. Além disso, condições patológicas, como isquemia aguda pode ser simulado.

Introdução

A investigação de proteínas de canais iônicos, como referem o seu papel para a contratilidade cardíaca é essencial para descobrir diferentes pathomechanisms e estabelecer novas estratégias terapêuticas para doenças cardíacas como isquemia e insuficiência cardíaca.

Função contrátil de cardiomiócitos de mamíferos é conhecido por ser modulada por vários canais iônicos, transportadores e outras proteínas. Potencial de ação evocava a ativação de tensão dependente sarcolemal L-tipo ^canais de Ca2 + leva a ^influxo de Ca2 + do espaço extracelular e, posteriormente, ^ao Ca2 + induzida por ^Ca2 + release (CICR) ^1, o que desencadeia a contração celular ^2. Ca ²⁺ -signaling desempenha um papel central na contratilidade cardíaca e adaptação ao estresse fisiológico ou patológico. Catecolaminas ativar receptores beta-adrenérgicos cardíacos, estimulando assim adenililciclase (AC), que sintetiza cAMP. Sendo ativado, proteiN cinase A (PKA) fosforila diferentes proteínas associadas intracelulares e de membrana de tipo L como ^canais de Ca2 +, e receptores de rianodina fosfolambam, resultando em modificação de transientes ^de Ca 2+ e ^1,3,4 contractilidade cardíaca. O AMPc é degradada pela fosfodiesterase (PDE). A activação dos outros do que os receptores beta-adrenérgicos Gs-acoplado também conduz à acumulação de cAMP.

A técnica das medições de contratilidade em tiras isoladas de músculo ventricular está bem estabelecida para espécies de mamíferos maiores ^5-8. Com base na possibilidade de direccionamento de genes em ratinhos é importante para estabelecer métodos para analisar fisiologia cardíaca murino. No entanto, os dados existentes sobre as propriedades fisiológicas das preparações musculares isoladas em camundongos diferem dependendo das condições experimentais ^9-12.

O método descrito é usado para analisar a contractilidade cardíaca de pré músculo papilar do ventrículo esquerdoparações in vitro. Investigação da contractilidade cardíaca é realizada na ausência de influências que modificam a contractilidade cardíaca in vivo, como a pressão sanguínea, a estimulação neuro-humoral e stress físico ou metabólica. A taxa de batimento da preparação muscular contratação pode ser rigorosamente definido e alterado arbitrariamente. Força de contração pode ser analisado no contexto de estímulos específicos, tais como a concentração de cálcio, batendo frequência ou temperatura. Além disso, este método pode ser usado para investigar diferentes componentes da via de sinalização e para comparar o desempenho cardíaco de modelos de ratinho geneticamente modificadas controlando as condições experimentais mencionadas acima.

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Protocolo

NOTA: As etapas básicas do processo de isolamento são mostrados na Figura 1 Todos os passos são descritos em pormenor no seguinte protocolo.. Isolamento dos músculos papilares, montagem no órgão câmara de banho, aquisição e análise é realizada em uma escala de tempo consecutivo e obrigatória.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a legislação alemã sobre a protecção dos animais e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Heidelberg.

1. Preparação de Instrumentação

1. Para contratilidade medições usar uma configuração banho de órgãos com cavidades múltiplas. Componentes de uma contractilidade configuração banho de órgãos ex vivo são mostrados na Figura 2.
   NOTA: Para minimizar a quantidade de tempo entre a preparação do músculo papilar eo início do protocolo experimental, criado equipamentos e preparar buffers antes da recolha tissue.This experimentais provides a maior quantidade de tempo que o tecido permanece viável para conduzir experiências.
2. Inicie o computador e aquisição de dados equipamento. Ligue banho de órgãos de calor (predefinido para 32 ° C) e as unidades a temperatura predefinida permitir.
3. Prepare o equipamento de aquisição. Iniciar a gravação de dados, como mencionado no manual do software.
4. Verificar e realizar a calibração (se necessário) em cada canal e zero todos os canais para padronizar o sinal eléctrico fornecido a partir do transdutor de força respectivo (associado com aquele canal) a uma força de 2-G fornecida por um peso certificada.
5. Ligue o fornecimento de gás _(95% de O2 / 5% de CO ₂₎ para câmaras de banho de órgãos. Continuamente gás, todas as câmaras durante as medições de protocolo inteiras.

2. Preparação de tampões e soluções fisiológicas

1. Prepara-se uma solução tampão de Krebs-Henseleit a alcançar concentrações finais de 119 mM de NaCl; MM NaHCO 25 _3; KCl 4,6 mM; Glucose 11mm; 1 mM de Na-Pyruvate; 1,5 _mM de CaCl2; 1,64 _mM de MgSO4; 1,18 mM de KH _{2 PO 4} e ajustar o pH para 7,4 (ver Tabela 1 solução fisiológica).
2. Preparar a solução tampão de Krebs-Henseleit separado para usar durante o isolamento conforme descrito no passo 2.1 com monoxime adicional 30 mM 2,3-butanodiona (BDM) e 50 IE de heparina / ml. Arrefecer a solução a 4 ° C (ver Tabela 1 Preparação de Solução). Para simulação de isquemia, isquemia preparar-solução, tal como descrito na Tabela 1.
3. Para o protocolo de Ca ^{2 + -} contractilidade dependente, adicionar Ca ²⁺ para a solução tampão de Krebs-Henseleit a concentração final requerida.
   NOTA: preparar essas soluções diretamente antes de seu uso e gass com carbogênio para evitar a precipitação de Calciumcarbonate. Pré-aquecer solução a 32 ° C antes de usar.

3. Preparação do tubo e Dissection Dish gasificação usado durante a Excisão Processo Papillary

1. Conecte um gás suavecantar tubo (diâmetro externo 2-4 mm) para a ligação do gás (oxigênio a 100%, carbogénio alternativamente) com peritos que trabalham.
2. Criar um anel fechado do tubo gaseamento encaixe dentro do prato dissecção. Perfurar o tubo de gaseamento várias vezes que um borbulhar contínua está assegurada. Este tubo de gaseamento pode ser utilizado várias vezes.
3. Prepare dissecção prato com um elastómero de silicone na parte inferior (0,5 cm de espessura), de modo que os pinos podem ser preso nele. Este prato pode ser utilizado várias vezes.

4. Isolamento de Anterior Esquerda Músculo Papilar de murganhos

NOTA: Antes de iniciar o isolamento do músculo papilar, verifique se as linhas de gás são livre de bloqueios.

1. Prepare configuração banho de órgãos tal como mencionado na secção protocolo 1-3 antes de iniciar a preparação dos músculos papilares. Preparar todas as soluções, no dia da experiência.
2. Sacrifique o mouse (cerca de 8-12 semanas de idade) por deslocamento cervical according de trabalho especializada e diretrizes institucionais.
3. Corrigir o animal em decúbito dorsal, fixando as patas dianteiras e traseiras patas em uma placa de dissecação, abrir a lateral do tórax de ambos os lados, cortando através das costelas com uma tesoura afiada do osso, em seguida, corte o diafragma com um corte transversal. Remover o pericárdio. Agora, o coração e a aorta são acessíveis.
4. Fixar o coração com uma pinça sem corte no truncus vascular perto do coração e separar o coração rapidamente com tesouras dos pulmões e do tecido circundante.
5. Transferir o coração batendo para uma placa de Petri com solução de preparação arrefecida gaseados com oxigénio (passo 2.2). Permitir que o coração a bater e estimular contrações do coração suavemente através de tocar o ápice cardíaco com uma pinça.
6. Assim o coração está completamente exsanguinous, transferi-lo para o prato dissecção preenchido com solução preparação arrefecida (passo 2.2) e gaseificada _com O2. A partir deste passo sobre o uso de um microscópio estereoscópico.
7. Fixar o heart com um pequeno pino através do ventrículo direito, de modo que o coração é visto a partir dorsal (ventrículo direito está situado no lado direito do ponto de vista do operador).
8. Usando uma tesoura de microcirurgia separar ambos os átrios no nível atrioventricular, corte de ligação do tecido dos ventrículos e descarte. Realizar um corte através da parede do ventrículo-válvula de nível AV ao vértice do coração evitando qualquer pressão mecânica.
9. Abra o ventrículo e fixar a parede livre do lado esquerdo com uma pinça, tendo assim um olhar para ambos os músculos papilares do ventrículo esquerdo.
10. Ligeiramente cortar o tecido ventricular lateral, em ambos os lados do músculo papilar anterior esquerda preservando uma parte da vela valvular na preparação muscular papilar e evitar tocar ou alongamento do músculo papilar, tanto quanto possível. Dissecar o tecido da parede ventricular remanescente do músculo papilar.
11. Anexar fios de seda (7/0, métrica 0,5) em ambos os lados do prep músculo papilarprepara-, um na vela valvular e um na parte muscular. Fixar a preparação na câmara de banho de órgãos cheio com solução de banho de órgãos e gaseificada com carbogénio, como a temperatura de 32 ° C é sugerida.

5. Equilíbrio e estimulação do músculo papilar

1. Estimular a preparação do músculo papilar com pulsos retangulares (duração de 2 ms e corrente de 100 mA) a freqüência de estimulação de 1 Hz imediatamente após a fixação no banho de órgãos.
2. Certifique-se de uma mudança frequente da solução de banho de órgãos, seja por mudança contínua ou por alteração manual freqüentes (a cada 5 min) de acordo com a configuração do tipo banho de órgãos utilizados.
3. Aumentar gradualmente até que a pretensão força de contração máxima em alcançado. Força de contração máxima é alcançada quando o aumento da pré-tensão não é seguido por um aumento adicional da força de contração.
4. Após 45-60 min de equilibração, iniciar o protocolo experimental.

6. Sugestão de protocolos experimentais para medições da contractilidade

NOTA: O protocolo experimental descrito abaixo compreende manobras padrão para caracterizar a contratilidade cardíaca em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Na seção representante descrevemos esses protocolos em detalhe também mostra resultados representativos (ver também Quadro 2).

1. A gravação ea análise dos protocolos experimentais
   1. Para gravar, utilize um software adequado, com resolução temporal adequada (taxa de aquisição ≥ 1 kHz).
   2. Analisar parâmetros, incluindo a amplitude da força de contração (altura), tempo para o pico de tensão (TTP) e metade do tempo de relaxamento máximo _(R50 / TFall, respectivamente) como mencionado no programa de software (como exemplo 5.5 Gráfico de ADInstruments, ver Figura 4).

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Resultados

O protocolo deste manuscrito para medições de contratilidade de murino isolados preparações de músculos papilares está sintonizado com as condições ideais para atingir resultados experimentais reprodutíveis em condições fisiológicas. Para definir as condições experimentais ótimas, realizamos experimentos-piloto variando temperatura do banho de órgãos e concentração de cálcio extracelular (ver também ^12). O protocolo aqui descrito foi realizado com uma concentração extracelular de cálci...

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Discussão

Neste manuscrito nós descrevemos um método para investigar a contratilidade do músculo papilar murino in vitro que pode ser usada para responder a várias questões científicas relacionadas com a fisiologia do coração e patologia em ratos, bem como para apoiar a análise de linhagens transgênicas e da descoberta de novas abordagens farmacêuticas para o tratamento de disfunções cardíacas. Nós ilustram a utilização deste método para avaliar as propriedades fisiológicas, patológicas e farmacológi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335