Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Resumen

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Resumen

El cultivo celular se ha llevado a cabo tradicionalmente en sustratos bi-dimensional (2D) donde las células se adhieren utilizando receptores ventral a la superficie del biomaterial. Sin embargo, en vivo, la mayoría de las células están completamente rodeados por la matriz extracelular (ECM), lo que resulta en un (3D) la distribución tridimensional de los receptores. Esto puede provocar diferencias en el exterior, en las vías de señalización y por lo tanto en el comportamiento celular.

Este artículo muestra que la estimulación de los receptores de las células dorsales ya adheridos a un sustrato 2D superponiendo una película de un nuevo material (una cultura de sándwich) provoca cambios importantes con respecto a las culturas 2D estándar. Además, la excitación simultánea de los receptores de ventral y dorsal se desplaza el comportamiento celular más cerca de la que se encuentra en entornos 3D. Además, debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en células / material de interacciones, por ejemplo, la topografía, la rigidez y diferentes recubrimientos de proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Por último, dado que las culturas-sándwich como se basan en sustratos 2D, varios procedimientos de análisis ya desarrollados por las culturas 2D estándar se puede utilizar normalmente, la superación de los procedimientos más complejos necesarios para sistemas 3D.

Introducción

Tradicionalmente, el cultivo celular se ha llevado a cabo en sustratos bidimensionales (2D), aunque la mayoría de los microambientes celulares in vivo tienen una naturaleza tridimensional (3D). Este entorno 2D antinatural desencadena cambios en el comportamiento celular como una forma de auto-adaptación a un mundo plano, lo que afecta directamente el destino celular ^1,2. Por lo tanto, los resultados obtenidos en cultivos de células 2D no siempre son reproducibles in vivo. Esto ha favorecido el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo relevantes que buscan ofrecer condiciones más fisiológicas similares a obtener más conocimientos sobre cualquier mecanismo biológico ^{3,4-dimensión} dependiente.

Una de las principales diferencias entre la cultura 2D y 3D en el entorno vivo es la distribución de receptores de las células ancladas a la matriz extracelular (ECM): mientras que en sustratos 2D células se adhieren ventralmente, la mayoría de las células in vivo son completamente rodeado por el ECM y por tanto, cell adhesión se produce a través de una distribución 3D de los receptores. Esto desencadena diferentes vías de señalización que modulan la adhesión celular así los procesos importantes tales como el crecimiento celular, la diferenciación celular y la expresión génica. Durante las últimas décadas, muchos sistemas de cultivo 3D diferentes se han establecido ^5-8, aunque su variabilidad y complejidad dificultan su estandarización en los procedimientos de cultivo celular común. Por otra parte los sistemas 3D no suelen ser fáciles de manejar y procedimientos experimentales actuales sobre sustratos 2D no se pueden establecer fácilmente por las culturas 3D. Además, la literatura raramente compara culturas 3D con la condición 2D equivalente u otros sistemas 3D, lo que dificulta la comprensión adecuada de comportamiento celular en estos modelos.

Una vez que tiene las células adheridas sobre un sustrato de 2D, la excitación de los receptores de dorsales - por superposición de una película de un nuevo material (cultivo de sándwich) - pueden desencadenar respuestas de las células por igual entornos 3D. El reahijo detrás de esto es la activación simultánea de ambos dorsal y ventral receptores de adherirse y propagación en el medio ambiente sándwich (Figura 1) ^9,10. Como consecuencia, las células sufren cambios importantes con respecto a las culturas 2D ^11,12. Por lo tanto, el destino celular se determina durante el montaje debido a la cultura de sándwich, ya que la estimulación dorsal provoca cambios en las vías celulares clave. Por lo tanto, el destino de la célula está altamente determinada por el tiempo cuando la cultura de sándwich se ensambla ^11.

Debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta sencilla y versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en las interacciones célula / materiales tales como revestimientos de química, topografía, rigidez y proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Esto ofrece un mayor grado de versatilidad en comparación con otros sistemas 3D (Figura 2) debido a la dorsal independiente y combinación ventral de una amplia variedad de condiciones de la superficie. Además, diferentes líneas celulares y diferentes momentos para ensamblar la cultura de sándwich pueden ser estudiados, aumentando el ancho espectro de posibilidades.

Un protocolo estándar de la cultura-sándwich como se detalla a continuación utilizando poli-L-láctico (PLLA) electrospun fibras o películas como sustratos dorsales, cubreobjetos de vidrio como sustrato ventral y fibronectina como recubrimiento de proteína. Culturas de sándwich se reunieron poco después de la siembra de células o después de 3 horas de la cultura 2D. Sin embargo, tenga en cuenta que otros sistemas materiales y proteínas podrían utilizarse; Del mismo modo la cultura de sándwich puede ser montado en diferentes puntos temporales.

Protocolo

1. Producción de dorsales Sustratos

1. La producción de una película plana de PLLA por colada solvente.
   1. El trabajo en una campana de humos para preparar una solución de 2% (w / v) PLLA en cloroformo (2 g PLLA en 100 ml de cloroformo) por agitación a temperatura ambiente (RT) hasta que se disuelva completamente (3 hr aproximadamente).
   2. Coloque las arandelas en una placa de Petri de vidrio.
      Nota: Use arandelas de acero inoxidable con un diámetro interior de 10,5 mm (ligeramente menor que el diámetro de la muestra ventral) de manera que la arandela se coloca en la parte superior del sustrato ventral. Otros materiales tales como politetrafluoroetileno (PTFE) o arandelas de vidrio podrían ser utilizados también.
   3. Añadir 200 l de la solución de PLLA en la lavadora y dejar evaporar lentamente durante 30 min a TA. Con el fin de permitir la evaporación lenta del disolvente, cerrar la placa de Petri con papel de aluminio con unos pocos agujeros.
   4. Calentar las muestras a 120 ° C durante 5 min con el fin de evaporar trazas de disolvente.
   5. Deje que las muestras refrescan hacerwn a TA.
   6. Una vez que las muestras se hayan enfriado (30 min aproximadamente), cubrir con 18,2 mO · cm de agua en la placa de Petri y se incuba durante 8 min a TA.
      Nota: Si las muestras no están completamente enfrían, pueden tardar hasta 18,2 mO · cm de agua y adoptar un estado gomoso. Además, la incubación en 18,2 mO · cm de agua durante menos de 8 min puede resultar en el desprendimiento inadecuada, y durante más de 8 min en el desprendimiento de la lavadora.
   7. Con una hoja de afeitar, levante las arandelas de pelarlos la placa de Petri.
   8. Retire cualquier imperfección desde el borde de la lavadora con pinzas y dejar que las muestras de aire seco.
   9. Almacenar las muestras en un desecador de vacío (80 mbar) hasta el día del experimento porque PLLA es degradable por hidrólisis.
2. Producción de fibras de PLLA por electrospinning.
   1. El trabajo en una campana de humos para preparar una solución de 8% (w / v) PLLA en hexafluoroisopropanol (8 g PLLA en 100 ml hexafluoroisopropanol) por stirrción a temperatura ambiente hasta que se disuelva completamente (3 horas aproximadamente).
   2. Coloque el politetrafluoroetileno (PTFE) arandelas en una lámina de aluminio o en un tambor para el electrospinning el fin de obtener fibras aleatorias o alineados respectivamente.
      Nota: El uso de politetrafluoroetileno (PTFE) arandelas con un diámetro interior de 10,5 mm (ligeramente menor que el diámetro de la muestra ventral) de manera que la arandela se coloca en la parte superior del sustrato ventral. Otros materiales tales como arandelas de acero inoxidable o de vidrio podrían ser utilizados también. El tambor debe girar a una velocidad angular de 160.7 seg ^-1 (radio = 7 cm) con el fin de obtener fibras alineadas. Una velocidad más lenta podría no activar la alineación de la fibra y una mayor velocidad se traducirá en fibras rotas.
   3. Cargue la jeringa con la solución de polímero y colocarlo en la bomba de jeringa.
   4. Electrospin la solución de PLLA utilizando una tasa de flujo de 0,9 ml / hr con una tensión de 30 kV y una distancia de colector de 12 cm.
   5. Detener el proceso de electrospinning popaer 20-30 min, una vez que se logra una buena densidad de fibra (ya que las células tienen que interactuar con varias fibras simultáneamente).
   6. Calentar las muestras a 120 ° C durante 5 min con el fin de evaporar trazas de disolvente.
   7. Almacenar las muestras en un desecador de vacío (80 mbar) hasta el día del experimento porque PLLA es degradable por hidrólisis.

2. Sandwich Cultura

1. Montar la cultura de sándwich, una vez las células se adhieren al sustrato 2D ventral.
   1. Trabajo en una campana de cultivo para garantizar condiciones de esterilidad y esterilizar todos los materiales (cubreobjetos de vidrio, sustratos dorsales, pinzas, etc.) por la exposición UV durante 30 minutos.
   2. Escudo con el fin sustrato ventral y dorsal con fibronectina dirigir adhesión específica de proteínas de la célula. Para ello, se incuban las muestras en 20 g / ml de fibronectina disueltos en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) que contiene Ca ²⁺ y Mg ²⁺ (200 l / samplio) durante 1 hr.
      Nota: Debido al proceso de fabricación, los sustratos dorsales tienen unos lados superior e inferior designadas porque la película y electrospun fibras de disolvente fundido unidos a uno de los lados de la lavadora. Por tanto, este lado es la que da las células (Figura 3).
      1. Después de que el recubrimiento de proteína, lavar las muestras dos veces con DPBS con el fin de eliminar la proteína en exceso. Entonces incubar muestras en DPBS hasta su uso a fin de evitar muestras de conseguir seco ya que esto provoca desnaturalización de proteínas. Use DPBS que contenía Ca ²⁺ y Mg ²⁺ desde cationes divalentes regulan el plegamiento de proteínas.
   3. Células de semillas en el cristal cubreobjetos ^13.
      Nota: Como la cultura de sándwich se basa en sustratos 2D, la siembra de células se realizará de manera similar como en una muestra 2D. Por ejemplo, C2C12 mioblastos se sembraron a 17.500 células cm ^-1 para los experimentos de diferenciación y NIH3T3 fibroblastos se sembraron en 7000 canas cm ^-1 para cultivos aislados para estudiar la morfología celular y la adhesión.
   4. Colocar las muestras en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ y permiten que las células se adhieran al sustrato ventral durante 3 h.
   5. Coloque el sustrato cabeza de serie ventral en un nuevo pocillo de una placa de 12 pocillos múltiples (donde arandelas encajar).
      Nota: Montaje de la cultura de sándwich en un nuevo pozo es una forma de deshacerse de las células que se han adherido a la parte inferior del pozo después de la siembra, ya que estos consumen nutrientes y secretar factores de crecimiento y de residuos que influyen en células cultivadas dentro de la de sándwich sistema. Esta es también una necesidad para extracciones celulares con el fin de lisar sólo las células cultivadas en el medio ambiente de sándwich.
   6. Con cuidado y con la ayuda de un par de pinzas, superponer el sustrato dorsal sobre las células. Vuelva a llenar con medio (1 ml) y se incuba a 37 ° C con 5% de CO _2.
      Nota: El peso de la lavadora evitará que el sub dorsaltrar desde flotante.
   7. Cambie el medio dos veces por semana como en las culturas 2D estándar. No mueva el sustrato dorsal ya que esto podría resultar en el daño celular.
2. Montar la cultura de sándwich justo después de la siembra de células.
   1. Trabajo en una campana de cultivo para garantizar condiciones de esterilidad y esterilizar todos los materiales (cubreobjetos de vidrio, sustratos dorsales, pinzas, etc.) por la exposición UV durante 30 minutos.
   2. Escudo con el fin sustrato ventral y dorsal con fibronectina dirigir adhesión específica de proteínas de la célula. Para ello, incubar las muestras en 20 g / ml de fibronectina disueltos en DPBS que contenía Ca ²⁺ y Mg ²⁺ (200 l / muestra) durante 1 hora.
      1. Después de que el recubrimiento de proteína, lavar las muestras dos veces con DPBS con el fin de eliminar la proteína en exceso. Entonces incubar muestras en DPBS hasta su uso a fin de evitar muestras de conseguir seco ya que esto provoca desnaturalización de proteínas. Use DPBS que contenía Ca ²⁺ y Mg 2+ desde cationes divalentes regulan el plegamiento de proteínas.
   3. Células de semillas sobre cubreobjetos de vidrio en un pocillo de una placa de 12 pocillos múltiples (donde arandelas encajar). Para ello, utilice una suspensión celular de alta concentración para evitar la pérdida de células después de la colocación del sustrato dorsal.
   4. Con cuidado y con la ayuda de un par de pinzas, superponer el sustrato dorsal sobre las células. Vuelva a llenar con medio (1 ml) y se incuba a 37 ° C con 5% de CO _2.
      Nota: El peso de la lavadora evitará que el sustrato dorsal de flotante.
   5. Cambie el medio dos veces por semana como en las culturas 2D estándar.
      Nota: No mueva el sustrato dorsal ya que esto podría resultar en el daño celular.

3. Análisis

Nota: Las culturas de sándwich se basan en sustratos 2D, y así se pueden comúnmente analizadas por procedimientos ya desarrollados por las culturas 2D estándar. Por ejemplo, desde PLLA es transparente y cells están obligados a moverse dentro del plano xy, la microscopía se realiza como sobre sustratos de 2D. La migración celular se puede por lo tanto analizarse como para cultivos 2D, sin la necesidad de rastrear células en el eje z como para cultivos en 3D, lo que simplifica el análisis experimento y la imagen. Para estudiar el ensayo de la curación de la herida mediante un ensayo cero sigue este protocolo:

1. Estudio migración celular (ensayo de la curación de la herida) dentro de la cultura de sándwich.
   1. Trabajo en una campana de cultivo para garantizar condiciones de esterilidad y esterilizar todos los materiales (cubreobjetos de vidrio, sustratos dorsales, pinzas, etc.) por la exposición UV durante 30 minutos.
   2. Escudo con el fin sustrato ventral y dorsal con fibronectina dirigir adhesión específica de proteínas de la célula. Para ello, se incuban las muestras en 20 g / ml de fibronectina disueltos en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) que contiene Ca ²⁺ y Mg ²⁺ para 1 hr.
      1. Después de que el recubrimiento de proteína, lavar las muestras dos veces con DPBScon el fin de eliminar la proteína en exceso. Entonces incubar muestras en DPBS hasta su uso a fin de evitar muestras de conseguir seco ya que esto podría causar la desnaturalización de proteínas. Use DPBS que contenía Ca ²⁺ y Mg ²⁺ desde cationes divalentes regulan el plegamiento de proteínas.
   3. Células de semillas en los cubreobjetos de vidrio en una alta densidad de ^13.
   4. Colocar las muestras en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ y permiten a las células para lograr la confluencia.
   5. Utilice una punta de pipeta para rascarse la monocapa de células con el fin de obtener 2 poblaciones celulares separadas por un espacio.
   6. Coloque el sustrato cabeza de serie ventral en un nuevo pozo adecuado para la adquisición de lapso de tiempo y donde sustratos dorsales se ajustan (es decir, 12 placa de múltiples pocillos).
   7. Con cuidado y con la ayuda de un par de pinzas, superponer el sustrato dorsal en las células y luego rellenar con medio (1 ml para una placa de 12 pocillos múltiples).
      Nota: El peso de la lavadora evitará tél dorsal sustrato a partir flotante.
   8. Coloque la muestra en el microscopio de lapso de tiempo (establecido en 37 ° C y 5% de CO ₂₎ y tomar imágenes de la reducción de distancias cada 20 minutos.
   9. Analizar la reducción de distancias en el uso de software específico, como el MiToBo plugin desde ImageJ. ¹⁴

Nota: Las proteínas y extracción de ácidos nucleicos se lleva a cabo de manera similar como en sustratos de 2D. Sólo hay un paso adicional que consiste en desmontar la cultura de sándwich para añadir el tampón de lisis directamente sobre las células con el fin de aumentar la eficiencia de la extracción. Por ejemplo, para la extracción de mRNA:

2. Extracto de ARNm de las Culturas-Sandwich como
   1. Preparar todos los tampones del kit comercial según las instrucciones del fabricante.
   2. Tome la cultura de sándwich fuera de la incubadora.
   3. Retire el medio de cultivo de las muestras.
   4. Lavar las muestras una vez con DPBS que contenía Ca2+ y Mg ²⁺ (1 ml) y quitar toda la solución.
   5. Con la ayuda de un par de pinzas, retire el sustrato dorsal y añadir el tampón de lisis (350 l) al sustrato ventral. Superposición de nuevo el sustrato dorsal ventral sobre el sustrato con el fin de lisar las células adheridas al sustrato dorsal.
   6. Retire el sustrato dorsal para aislar la solución de lisis.
   7. Siga las instrucciones del fabricante para obtener el ARNm.

Nota: La inmunodetección de las proteínas se puede también realizar como sobre sustratos de 2D. Desde culturas-sándwich como podrían obstaculizar la correcta difusión de los anticuerpos y tampones, los tiempos de incubación debe ser aumentada. Además, el sándwich se puede desmontar antes de iniciar el protocolo de tinción pero en este último caso algunas células permanecerá unido al sustrato dorsal y algunos al sustrato ventral.

3. Proteínas Immunodetect dentro de una cultura de sándwich
   1. Lavar la muestra una vez con DPBS y fijar con formaldehído al 4% en PBS durante 20 min a 4 ° C.
      Nota: sustrato Dorsal puede ser removido durante el proceso de fijación de modo que se evitan los problemas de difusión.
   2. Enjuague con DPBS (1 ml) y luego permeabilizar con 0,5% Triton X-100 en DPBS (1 ml) durante 5 min a TA.
   3. Bloquear los sitios de unión no específica con 1% de albúmina en DPBS (1 ml) durante 30 min a TA.
   4. Incubar con el anticuerpo primario (2 mg / ml; 1 ml) en solución de bloqueo durante 3 h a RT.
   5. Lavar 3 veces durante 10 min con DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml).
   6. Incubar 2 h con anticuerpos secundarios (2 g / ml) y 1 mg / ml DAPI en solución de bloqueo (1 ml) a TA.
   7. Lavar 3 veces durante 10 min en DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml).
   8. Lave en DPBS.
      Nota: Las muestras se pueden montar en una diapositiva con Vectashield y sellados con esmalte de uñas cuando sustratos dorsales se retiran antes de la inmunodetección.
   9. Observe bajo la micro fluorescenciaalcance como para sustratos de 2D estándar.

Resultados

La estimulación de los receptores dorsales dentro de la cultura de sándwich provoca cambios en la morfología celular, la adhesión celular y las vías de señalización intracelular (por ejemplo, quinasa de adhesión focal, FAK) ^10-12. Como un ejemplo, fibroblastos cultivados dentro del sistema de sándwich sobreexpresa la integrina subunidad α ₅ en comparación con el 2D, como se ha observado para otros cultivos 3D ^15,16.

Destino celular es alta...

Discusión

Hoy en día, la cultura 3D es un tema importante para la industria farmacéutica y biotecnológica, así como la investigación en biología celular, incluyendo el cáncer y células madre. Como consecuencia de ello se han desarrollado varios sistemas de cultivo 3D. Desafortunadamente, las diferencias entre los sistemas 3D suelen dar lugar a un comportamiento celda diferente, lo que dificulta la comprensión del destino celular. Además, los procedimientos experimentales no suelen ser tan sencillo como para los sistemas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent