Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Özet

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Özet

Hücre kültürü, geleneksel hücre biyo materyal yüzeyi ventral reseptörleri kullanarak uygun iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bununla birlikte, in vivo olarak, hücrelerin çoğu tamamen reseptörlerinin bir üç boyutlu (3D) dağılımı ile sonuçlanan hücre dışı matrisin (ECM) ile çevrilidir. Bu sinyal yolları dışında-ve böylece hücre davranış farklılıkları tetikleyebilir.

Bu makale zaten yeni bir malzeme (bir sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan bir 2B yüzeye yapıştırılır hücrelerin dorsal reseptörlerini uyararak standart 2D kültürlere göre önemli değişiklikler tetikler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ventral ve dorsal reseptörlerinin aynı anda uyarma yakın 3D ortamlarda bulunan edilene hücre davranışını değiştirir. Buna ek olarak, bağlı sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hücre / malzeme inte farklı parametrelerin çalışma sağlar çok yönlü bir araçtırkasılma konsantrasyona, örneğin, topoğrafya, sertlik ve hem ventral ve dorsal kenarlarında farklı protein kaplamaları. Sandviç benzeri kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır çünkü nihayet, birkaç analiz prosedürleri zaten 3D sistemleri için gerekli daha karmaşık prosedürleri aşarak, normal olarak kullanılabilir standart 2D kültürler için geliştirilmiş.

Giriş

In vivo hücre mikroçevrelerde çoğu üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip olsa Geleneksel olarak, hücre kültürü, iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bu doğal olmayan 2D ortam düz bir dünya için kendini uyarlama bir yolu olarak, hücre davranış değişiklikleri, tetikler hangi doğrudan etkiler, hücre kaderi ^1,2. Bu nedenle, 2B hücre kültürlerinde elde edilen sonuçlar her zaman in vivo tekrarlanabilir değildir. Bu, herhangi bir boyut bağımlı biyolojik mekanizma ^3,4 içine daha fazla anlayış almak için daha fazla fizyolojik benzeri koşulların sağlanması isteyen yeni alakalı kültür sistemlerinin geliştirilmesi teşvik etmiştir.

2B hücreleri ventral yapışır yüzeylerde oysa, in vivo hücrelerin çoğunluğu tamamen ECM ve çevrili: 2B kültür ve in vivo ortamda 3D arasındaki ana farklardan biri ekstrasellüler matriks (ECM) demirlemiş hücre reseptörlerinin dağılımı Böylece ceII yapışma reseptörlerinin bir 3D dağıtım yoluyla gerçekleşir. Bu sayede, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu gibi önemli işlevleri modüle farklı hücre yapışma sinyal yollarını başlatır. Onların değişkenlik ve karmaşıklık ortak hücre kültürü prosedürlerinin kendi standardizasyon engel olsa son on yılda, pek çok farklı 3D kültür sistemleri, ^5-8 kurulmuştur. Ayrıca 3D sistemler genellikle işlemek ve 2D yüzeylerde mevcut deneysel işlemler kolayca 3D kültürler için kurulmuş olamaz kolay değildir. Buna ek olarak, edebiyat nadiren bu modellerde hücre davranışını doğru anlaşılmasını engelleyen, eşdeğer 2B durumu veya diğer 3D sistemlerle 3D kültürleri karşılaştırır.

Bir kez 2B substrat, dorsal reseptörlerinin uyarılması üzerine yapıştırılır hücrelere sahip - yeni bir malzeme (sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan ile - hücre hem yanıtları 3D ortamlar tetikleyebilir. reaBunun arkasında oğlu dorsal ve ventral reseptörleri yapışır ve sandviç ortamında yaymak için (Şekil 1) ^9,10 hem de eş zamanlı aktivasyonu olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, hücreler 2B kültürleri ^11,12 ile ilgili olarak önemli değişimler geçirirler. Dorsal uyarım önemli hücresel yollardaki değişiklikler tetikler çünkü Böylece, hücre kaderi, çünkü sandviç kültürü montajı esnasında belirlenir. Bu nedenle, hücre kaderi yüksek sandviçe benzer kültürü ¹¹ monte edilir zaman ile tespit edilir.

Nedeniyle sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal tarafı böyle kimya, topoğrafya, sertlik ve protein kaplamalar gibi hücre / malzeme etkileşimleri farklı parametrelerin çalışma sağlayan basit ve çok yönlü bir araçtır. Bu, geniş bir v bağımsız olarak dorsal ve ventral kombinasyonu diğer 3D Systems (Şekil 2) göre çok yönlü bir yüksek derecesiYüzey koşullarının ariety. Buna ek olarak, farklı hücre hatları ve sandviç-benzeri kültür monte farklı zamanlarda olanakları geniş spektrumunu artan incelenebilir.

Sandviçe benzer kültür standart bir protokol kullanılarak aşağıda ayrıntılı olarak, ya sırt alt tabakalar, protein kaplama olarak ventral alt-tabaka ve fibronektin gibi cam lamel gibi asit (PLLA) electrospun elyaflar ya da filmler-L-laktik poli. Sandviç gibi kültürler, sadece hücre tohumlama sonra veya 2B kültür 3 saat sonra monte edilmiştir. Bununla birlikte, diğer malzeme sistemleri ve proteinler kullanılabilir dikkat ediniz; aynı şekilde sandviç benzeri bir kültürü, farklı zaman noktalarında monte edilebilir.

Protokol

Dorsal Yüzeyler 1. Üretimi

1. Çözücü döküm tarafından PLLA düz bir filmin üretimi.
   1. Oda sıcaklığında tam olarak (yaklaşık 3 saat) çözününceye kadar (RT) karıştırılarak% 2 bir çözeltisi, kloroform içinde (ağ / hac) PLLA (100 mi kloroform içinde 2 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışır.
   2. Cam Petri kabı pulları yerleştirin.
      Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm'lik bir iç çapa sahip ve paslanmaz çelik çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin politetrafloroetilen (PTFE) veya cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir.
   3. Yıkayıcı PLLA çözeltisi 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça buharlaşmasına izin verin. Çözücünün düşük buharlaşmasını sağlamak amacıyla, birkaç delik ile alüminyum folyo ile Petri kabı kapatmak.
   4. Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C 'de örnekleri ısıtın.
   5. Numuneler yapmak serin yapalımRT'de wn.
   6. Numuneler (30 dk yaklaşık) soğuduktan sonra, Petri kabındaki · cm su M 18.2 ile kaplayın ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe.
      Not: örnekler tamamen soğuduktan değilse, bunlar · yukarı cm su M 18.2 alıp bir lastik devleti kabul edebilir. Buna ek olarak, daha az 8 dakika boyunca · cm su 18.2 kuluçka uygunsuz dekolmanı ve yıkama ayrıldıktan fazla 8 dakika boyunca neden olabilir.
   7. Bir jilet ile, Petri kabı onları kalkmasına pulları kaldırın.
   8. Cımbız ile yıkama kenarından herhangi bir kusurları çıkarın ve numuneler hava kurumaya bırakın.
   9. PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın.
2. Elektrospinning tarafından PLLA liflerinin üretimi.
   1. Karışması sağlandı göre heksaflorizopropanol içinde bir% 8 çözeltisi (ağırlık / hacim) PLLA (100 mi heksaflorizopropanol içinde 8 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışmatamamen çözülene kadar oda sıcaklığında ing (3 saat, yaklaşık).
   2. Sırasıyla, rastgele ya da düzenli fiber elde etmek için, bir alüminyum levha veya Elektrospinning bir tambur üzerinde, politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır makineleri yerleştirin.
      Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm'lik bir iç çapa sahip kullanımlar politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin, paslanmaz çelik ya da cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. Tambur hizalanmış fiberler elde etmek için 160.7 saniye ^-1 (yarıçap = 7 cm) 'lik bir açısal hızda dönmelidir. Daha yavaş bir hızlı fiber hizalama tetikleyebilir olmayabilir ve daha hızlı kırık lifleri neden olacaktır.
   3. Polimer çözeltisi ile şırınga yükleyin ve şırınga pompası üzerine yerleştirin.
   4. 30 kV voltaj ve 12 cm'lik bir toplayıcı mesafe ile, bir 0.9 ml / saat akış oranı kullanılarak PLLA çözeltisi Electrospin.
   5. Elektrospinning süreci kıç Durdurer 20-30 dk (hücreler aynı anda birkaç lifleri ile etkileşim var çünkü) bir zamanlar iyi bir lif yoğunluğu elde edilir.
   6. Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C 'de örnekleri ısıtın.
   7. PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın.

2. Sandviç Kültürü

1. Hücreler ventral 2B yüzeye yapıştırılır kez sandviç gibi kültür birleştirin.
   1. Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek.
   2. Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca içeren ²⁺ ve Mg2 ⁺ (200 ul / sn içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe1 st için) yeterli.
      Not: Çözücü döküm film ve electrospun elyaflar yıkama yanlarından birine bağlanır, çünkü nedeniyle imalat işlemine, sırt alt-tabakalar belirlenmiş bir üst ve alt kenara sahiptir. Bu taraf, bu nedenle hücreleri (Şekil 3) bakan bir tanesidir.
      1. Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri ²⁺ Ca ²⁺ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler.
   3. Camına Tohum hücreleri ¹³ lamelleri.
      Not: sandviçe benzer kültürü 2B alt tabakalar üzerine dayandığı için, hücre ekim Benzer 2B örnek olarak yapılacaktır. Örneğin, C2C12 miyoblast ^cm-1 farklılaşma deneyleri ve NIH3T3 fibroblast için 7000 ° C'de tohumlanır 17.500 hücre düşecek şekilde,arşın cm ^-1 izole kültürleri hücre morfolojisi ve yapışma incelemek için.
   4. % 5 _CO2 37 ° C'de bir kuluçka numuneler ve hücreler 3 saat ventral substrata yapışmasına izin verir.
   5. (Çamaşır uygun yerlerde), bir 12 çok oyuklu bir plakanın yeni bir kuyu ventral tohumlu yerleştirilmesidir.
      Not: Yeni bir kuyuda sandviç gibi kültür Montaj bu besinleri tüketmek ve içinde kültüre hücreleri etkileyen büyüme faktörleri ve atık salgılarlar beri iyi tohumlama sonrası dibine yapıştırılır var hücrelerin kurtulmak için tek yoldur sandviç gibi sistem. Bu aynı zamanda sandviç benzeri ortamında kültüre sadece hücreleri lize amacıyla hücresel çekimi için bir zorunluluktur.
   6. Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
      Not: yıkama ağırlığı dorsal alt önleyecektiryüzen tedir.
   7. Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin. Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin.
2. Sadece hücre tohumlama sonrası sandviç gibi kültür birleştirin.
   1. Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek.
   2. Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Ca ^{+ 2} ve Mg ^{+ 2,} 1 saat boyunca (200 ul / numune) ihtiva eden DPBS içinde eritilmiş fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin.
      1. Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Ca ²⁺ ve Mg içeren Kullanımı DPBS 2+ kadar iki değerlikli katyonlar, protein katlanmasını düzenleyen beri.
   3. (Çamaşır uygun) 12, çok oyuklu bir plaka iyi cam lameller üzerine tohum hücreleri. Bunu yapmak için, dorsal substratı döşeme sonra hücre kaybını önlemek için son derece konsantre hücresel süspansiyon kullanın.
   4. Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
      Not: Yıkama ağırlığı yüzen dorsal alt tabakayı önleyecektir.
   5. Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin.
      Not: Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin.

3. Analiz

Not: Sandviç gibi kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır ve bu nedenle yaygın olarak zaten standart 2D kültürler için geliştirilmiş prosedürler ile analiz edilebilir. Örneğin, beri PLLA şeffaf ve cel olduğunuls xy düzlemi içinde hareket etmek kısıtlanır, mikroskopi 2B yüzeylerde olarak yapılır. Hücre göçü, bu nedenle deneme ve görüntü analizi kolaylaştırır 3D kültürleri için z-ekseni hücreler izleme gerek kalmadan, 2B kültürleri gibi analiz edilebilir. Bir çizik testi ile yara iyileşmesi tahlil incelemek için bu protokolü uygulayın:

1. Sandviç gibi kültür içinde Çalışma hücre göçü (yara iyileşmesi deneyi).
   1. Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek.
   2. Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, 1 saat süre ile Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca ^{+ 2} ve Mg içeren ²⁺ içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin.
      1. Protein Kaplamadan sonra, DPBS ile iki kez numune yıkayınamacıyla fazla proteinin ayrılması için. Daha sonra, protein Doğallıktan neden olabilir, bu, kurutma elde örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri ²⁺ Ca ²⁺ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler.
   3. Yüksek yoğunlukta ¹³ cam lamelleri Tohum hücreleri.
   4. % 5 _CO2 37 ° C'de bir kuluçka numuneler ve hücreler kaynaşmaya elde etmek için izin verir.
   5. Bir boşlukla ayrılan 2 hücre popülasyonlarının almak için hücre tek tabaka kazımak için bir pipet kullanın.
   6. Time-lapse edinimi için yeni bir kuyu uygun ventral numaralı seribaşı substrat yerleştirin ve dorsal yüzeylerde (yani 12 çoklu plaka) uygun yerlerde.
   7. Dikkatli ve bir çift cımbız yardımı ile, hücreler üzerindeki sırt alt tabaka kaplaması ve daha sonra (bir 12 çok-delikli plaka için 1 mi) ortam ile doldurun.
      Not: yıkama ağırlığı önleyecektir tO yüzen alt tabakayı dorsal.
   8. Time-lapse mikroskop örnek yerleştirin (37 ° C olarak ayarlanmış ve% 5 CO ₂₎ ve boşluk kapatma her 20 dk görüntüleri alır.
   9. Böyle ImageJ gelen eklenti MiToBo olarak özel bir yazılım kullanılarak boşluk kapatma analiz edin. ¹⁴

Not: protein ve nükleik asit ekstraksiyon 2B alt tabakalar üzerinde benzer şekilde gerçekleştirilir. Ekstraksiyon verimini artırmak amacıyla hücreleri üzerinde doğrudan lizis tamponu eklemek için sandviç gibi kültür demontaj oluşur tek fazladan bir adım vardır. Örneğin mRNA çıkarımı için:

2. Sandviç gibi Kültürler mRNA Özü
   1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit ile ilgili tüm tamponları hazırlayın.
   2. Inkübatör dışarı sandviç gibi kültür atın.
   3. Örneklerden kültür ortamı çıkarın.
   4. DPBS Ca içeren bir kez numune yıkayın2 + ve Mg2 ⁺ (1 mi) ve bütün çözelti çıkarın.
   5. Bir çift cımbız yardımı ile, sırt alt-tabakanın çıkarın ve ventral substrata liziz tamponu (350 ul) ilave edin. Ayrıca, sırt alt-tabakaya yapışan hücreler lize etmek için yeniden ventral alt-tabaka üzerine sırt alt tabaka kaplaması.
   6. Lizis çözeltisi izole etmek için, dorsal substrat çıkarın.
   7. MRNA almak için üreticinin talimatlarına uyun.

Not: Proteinlerin imüno-da 2 boyutlu yüzeylere olduğu gibi gerçekleştirilebilir. Sandviç gibi kültürler antikorlar ve tampon doğru difüzyon engel olabilir için, inkübasyon süreleri arttırılmalıdır. Ayrıca, sandviç boyama protokolü başlamadan önce demonte edilebilir, ancak bu ikinci durumda bazı hücreler dorsal ve ventral substrat alt tabakaya bazı bağlı kalacaktır.

3. Bir sandviç gibi kültürün içinde Immunodetect proteinler
   1. DPBS ile bir kez örnek yıkayın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit ile sabitlenir.
      Not: Sırt alt-tabaka difüzyon problemleri önlenebilir, böylece sabitleme işlemi esnasında çıkarılabilir.
   2. DPBS (1 mi) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS içinde% 0.5 Triton X-100 (1 mi) ile geçirgenliği.
   3. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DPBS içinde% 1 albümini (1 mi) ile spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder.
   4. Primer antikor ile inkübe (2 ug / ml; 1 mi), oda sıcaklığında 3 saat çözüm engelleme.
   5. DPBS ile 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın.
   6. Oda sıcaklığında çözeltisi (1 mi) bloke sekonder antikor (2 ug / ml) ve 1 ug / ml DAPI ile 2 saat inkübe edin.
   7. DPBS içinde 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın.
   8. DPBS yıkayın.
      Not: Numuneler Vectashield bir slayt üzerine monte edilir ve dorsal yüzeyler önce immunodeteksiyon çıkarıldığında oje ile kapatılabilir.
   9. Floresan mikro altında gözlemleyinstandart 2D yüzeyler gibi kapsamı.

Sonuçlar

sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması, hücre morfolojisi, hücre yapışması ve hücre içi sinyal yolları (örneğin fokal yapışma kinaz, FAK) ^10-12 değişiklikleri tetikler. Diğer 3D kültürler ^15,16 için görüldüğü gibi, bir örnek olarak, sandviç benzeri bir sistem içinde kültürlendi fibroblastlar, 2D göre α ₅ integrin alt birimi aşın.

Hücre kaderi, hidroj eller gibi diğer 3D sistemlerinde o...

Tartışmalar

Günümüzde, 3D kültür kanseri dahil olmak üzere hücre biyolojisinde önemli bir ilaç ve biyoteknolojik sanayi için konu yanı sıra araştırma, ve kök hücre. Bunun bir sonucu olarak çok sayıda 3D kültür sistemleri geliştirilmiştir. Ne yazık ki, 3D sistemleri arasındaki farklılıklar genellikle hücre kader anlayışı engelleyen, farklı hücre davranışı neden olur. Ayrıca, deneysel işlemler genellikle 2B kültür sistemleri gibi basit değildir. Bu nedenle bu bazı sakıncaları çok önemlidir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent