Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Résumé

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Résumé

La culture cellulaire a été traditionnellement effectuée sur bidimensionnel (2D) substrats où les cellules adhèrent utilisant des récepteurs à la surface ventrale biomatériau. Toutefois in vivo, la plupart des cellules sont complètement entourés par la matrice extracellulaire (ECM), ce qui entraîne une tridimensionnel (3D) distribution des récepteurs. Ceci peut déclencher des différences de l'extérieur, dans les voies de signalisation et donc dans le comportement des cellules.

Cet article montre que la stimulation des récepteurs dorsales de cellules déjà adhéré à un substrat 2D en superposant un film d'un nouveau matériau (une culture de sandwich) déclenche des changements importants en ce qui concerne les cultures 2D standard. En outre, l'excitation simultanée des récepteurs ventrales et dorsales décale le comportement des cellules plus proche de celle trouvée dans les environnements 3D. En outre, en raison de la nature du système, une culture en sandwich est un outil polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres de cellule / matériau interactions, par exemple, la topographie, la raideur et différents revêtements de protéines à la fois les côtés ventrales et dorsales. Enfin, depuis les cultures sandwich-like sont basés sur des substrats 2D, plusieurs procédures d'analyse déjà développés pour des cultures 2D standard peut être utilisé normalement, surmonter des procédures plus complexes nécessaires pour les systèmes 3D.

Introduction

Traditionnellement, la culture cellulaire a été réalisée sur bidimensionnels (2D) des substrats, si la plupart des micro-environnements cellulaires in vivo ont un (3D) nature tridimensionnelle. Cet environnement 2D contre nature provoque des changements dans le comportement des cellules comme un moyen d'auto-adaptation à un monde plat, ce qui influe directement sur ​​le destin des cellules ^1,2. Par conséquent, les résultats obtenus sur les cultures de cellules 2D ne sont pas toujours reproductible in vivo. Cela a encouragé le développement de nouveaux systèmes de culture pertinentes qui cherchent à offrir des conditions plus physiologiques semblables pour obtenir de nouvelles informations sur un mécanisme biologique de dimension ^{3,4-dépendante.}

L'une des principales différences entre la culture 2D et le 3D dans un environnement in vivo est la distribution des récepteurs de cellules ancrées sur la matrice extracellulaire (ECM): tandis que sur 2D substrats cellules adhèrent ventralement, la majorité des cellules in vivo est complètement entourée par l'ECM et donc CEll adhérence se produit à travers une distribution 3D des récepteurs. Cela déclenche différentes voies de signalisation de l'adhérence cellulaire modulant ainsi les processus importants tels que la croissance cellulaire, la différenciation cellulaire et l'expression des gènes. Durant les dernières décennies, de nombreux systèmes de culture 3D différents ont été établis ^5-8, mais leur variabilité et la complexité entravent leur normalisation dans les procédures de culture cellulaire commune. En outre les systèmes 3D ne sont généralement pas faciles à manipuler et procédures expérimentales actuelles sur des substrats 2D ne peuvent être facilement établis pour les cultures 3D. En outre, la littérature compare rarement cultures 3D avec la condition de 2D équivalent ou des autres systèmes 3D, ce qui entrave la bonne compréhension du comportement des cellules dans ces modèles.

Une fois que les cellules ayant adhéré à un substrat en 2D, l'excitation des récepteurs dorsales - en superposant un film d'un nouveau matériau (culture en sandwich) - peuvent déclencher des réponses des cellules aussi bien des environnements 3D. Le reafils derrière cela est l'activation simultanée de deux récepteurs dorsale et ventrale à adhérer et la propagation dans l'environnement sandwich (Figure 1) ^9,10. En conséquence, les cellules subissent des changements importants en ce qui concerne les cultures 2D ^11,12. Ainsi, le devenir des cellules est déterminée lors de l'assemblage du fait de la culture en sandwich, étant donné que la stimulation dorsale déclenche les changements dans les voies cellulaires clés. Par conséquent, le destin des cellules est fortement déterminée par le moment où la culture en sandwich ¹¹ est assemblé.

En raison de la nature du système, une culture en sandwich est un outil simple et polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres dans les interactions cellule / matérielles telles que la chimie, de la topographie, de rigidité et de protéines revêtements à la fois les côtés ventrales et dorsales. Cela offre un degré de polyvalence plus élevé par rapport à d'autres systèmes 3D (figure 2) en raison de la dorsale indépendante et la combinaison ventrale d'un large variété des conditions de surface. En outre, différentes lignées cellulaires et à des moments différents assembler la culture en sandwich peuvent être étudiés, ce qui augmente le large spectre de possibilités.

Un protocole standard de la culture en sandwich est détaillée ci-dessous en utilisant soit de poly-L-lactique (PLLA) des fibres ou des films en tant que substrats électrofilées dorsales, lamelle de verre comme substrat ventral et de la fibronectine comme protéine de revêtement. cultures de sandwich ont été assemblés juste après l'ensemencement des cellules ou après 3 h de culture 2D. Toutefois, notez que d'autres systèmes de matériaux et des protéines pourraient être utilisés; De même, la culture en sandwich peut être assemblé à différents points dans le temps.

Protocole

1. La production de substrats dorsales

1. Production d'un film plat de PLLA par coulée au solvant.
   1. Travailler dans une hotte de laboratoire pour préparer une solution de 2% (p / v) dans du chloroforme PLLA (PLLA 2 g dans 100 ml de chloroforme) par agitation à la température ambiante (TA) jusqu'à dissolution complète (environ 3 heures).
   2. Placez les rondelles sur une boîte de Pétri en verre.
      Note: utiliser des rondelles en acier inoxydable avec un diamètre intérieur de 10,5 mm (un peu plus petit que le diamètre de l'échantillon ventral) de sorte que la rondelle est placée sur le dessus du substrat ventral. D'autres matériaux tels que le polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou des rondelles de verre peuvent être utilisés aussi bien.
   3. Ajouter 200 ul de la solution de PLLA dans la machine à laver et à faire évaporer lentement pendant 30 min à température ambiante. Afin de permettre l'évaporation lente du solvant, fermez la boîte de Pétri avec du papier d'aluminium avec quelques trous.
   4. Chauffer les échantillons à 120 ° C pendant 5 minutes afin d'évaporer les traces de solvant.
   5. Laissez échantillons EPO neWN à la température ambiante.
   6. Une fois les échantillons ont refroidi (30 min environ), couvrir avec 18,2 MQ · cm d'eau dans la boîte de Pétri et incuber pendant 8 min à température ambiante.
      Remarque: Si les échantillons ne sont pas complètement refroidies, elles peuvent prendre jusqu'à 18,2 MQ · cm d'eau et d'adopter un état caoutchouteux. En outre, l'incubation à 18,2 MQ · cm d'eau pendant moins de 8 min peut conduire à une mauvaise séparation, et pendant plus de 8 min dans le détachement de la laveuse.
   7. Avec une lame de rasoir, fouiller les rondelles de les décoller de la boîte de Pétri.
   8. Retirez toutes les imperfections du bord de la rondelle avec des pincettes et laisser les échantillons d'air sec.
   9. Stocker les échantillons dans un dessiccateur sous vide (80 mbar) jusqu'à ce que le jour de l'expérience car PLLA est dégradable par hydrolyse.
2. Production de fibres de PLLA par électrofilage.
   1. Travailler dans une hotte de laboratoire pour préparer une solution de 8% (p / v) dans l'hexafluoroisopropanol PLLA (PLLA 8 g dans 100 ml d'hexafluoroisopropanol) par stirrment à la température ambiante jusqu'à dissolution complète (3 h environ).
   2. Placez le polytétrafluoroéthylène (PTFE) rondelles sur une feuille d'aluminium ou sur un tambour pour le électrofilature afin d'obtenir des fibres aléatoires ou alignés respectivement.
      Remarque: L'utilisation de polytétrafluoroéthylène (PTFE) un lave-linge avec un diamètre intérieur de 10,5 mm (un peu plus petit que le diamètre de l'échantillon ventral) de sorte que la rondelle est placée sur le dessus du substrat ventral. D'autres matériaux tels que l'acier inoxydable ou de verre rondelles peuvent être utilisés aussi bien. Le tambour doit tourner à une vitesse angulaire de 160,7 sec ^-1 (rayon = 7 cm) afin d'obtenir des fibres alignées. Une vitesse plus lente peut pas déclencher l'alignement des fibres et une plus grande vitesse se traduira par des fibres cassées.
   3. Charger la seringue avec la solution de polymère et le placer sur la pompe à seringue.
   4. Electrospin la solution PLLA en utilisant un débit de 0,9 ml / h avec une tension de 30 kV et une distance de collecteur de 12 cm.
   5. Arrêtez l'arrière de processus de électrofilatureer 20 à 30 min, une fois une bonne densité de fibres est réalisé (car les cellules doivent interagir avec plusieurs fibres simultanément).
   6. Chauffer les échantillons à 120 ° C pendant 5 minutes afin d'évaporer les traces de solvant.
   7. Stocker les échantillons dans un dessiccateur sous vide (80 mbar) jusqu'à ce que le jour de l'expérience car PLLA est dégradable par hydrolyse.

2. Sandwich Culture

1. Monter la culture en sandwich une fois que les cellules adhèrent au substrat en 2D ventral.
   1. Travailler dans une hotte de culture afin d'assurer des conditions stériles et stériliser tous les matériaux (lamelles de verre, les substrats dorsales, pinces, etc.) par l'exposition aux UV pendant 30 minutes.
   2. Enduire le substrat ventral et dorsal avec la fibronectine dans le but de diriger l'adhérence cellule-spécifique de protéines. Pour ce faire, incuber les échantillons à 20 pg / ml de fibronectine dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), contenant Ca ²⁺ et Mg ²⁺ par Dulbecco (200 pl / sample) pendant 1 heure.
      Remarque: En raison du procédé de fabrication, les substrats ont une dorsales côtés supérieur et inférieur désignées parce que les solvants coulé films et fibres électrofilées attachés à l'un des côtés de la rondelle. Cette face est donc l'une en face des cellules (figure 3).
      1. Après séchage du dépôt de protéine, laver les échantillons deux fois avec du DPBS pour éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter des échantillons de se sécher, car cela génère protéines dénaturalisation. Utilisez DPBS contenant Ca ²⁺ et Mg ²⁺ depuis cations bivalents régulent le repliement des protéines.
   3. cellules de semences sur le verre des lamelles ^13.
      Remarque: Comme la culture en sandwich est basée sur des substrats 2D, l'ensemencement des cellules sera réalisée de façon similaire comme sur un échantillon 2D. Par exemple, C2C12 myoblastes sont ensemencées à 17 500 cellules cm ^-1 pour expériences de différenciation et NIH3T3 fibroblastes sont ensemencés à 7000 cElls cm ^-1 pour les cultures isolées pour étudier la morphologie des cellules et l'adhérence.
   4. Placer les échantillons dans une étuve à 37 ° C avec 5% de CO ₂ et permettent aux cellules d'adhérer au substrat ventral pendant 3 heures.
   5. Placez le substrat ensemencé ventrale dans un nouveau puits d'une plaque 12 puits multiples (où rondelles Fit).
      Remarque: Montage de la culture en sandwich dans un nouveau puits est une façon de se débarrasser des cellules qui ont adhéré au fond du puits après l'ensemencement puisque ceux-ci consomment des nutriments et sécrètent des facteurs de croissance et des déchets qui influencent cellules cultivées dans le sandwich système. Ceci est également une nécessité pour des extractions cellulaires afin de lyser les cellules cultivées seulement dans le milieu de sandwich.
   6. Et avec précaution à l'aide d'une paire de pinces, recouvrir le substrat dorsal sur les cellules. Recharge avec le milieu (1 ml) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO _2.
      Remarque: Le poids de la rondelle empêche le dorsal soustrer de flotter.
   7. Changer le support deux fois par semaine que dans les cultures 2D standard. Ne pas déplacer le substrat dorsale car cela pourrait entraîner des dommages aux cellules.
2. Assemblez la culture en sandwich juste après l'ensemencement des cellules.
   1. Travailler dans une hotte de culture afin d'assurer des conditions stériles et stériliser tous les matériaux (lamelles de verre, les substrats dorsales, pinces, etc.) par l'exposition aux UV pendant 30 minutes.
   2. Enduire le substrat ventral et dorsal avec la fibronectine dans le but de diriger l'adhérence cellule-spécifique de protéines. Pour ce faire, incuber les échantillons à 20 pg / ml de fibronectine dissoute dans du DPBS contenant du Ca ²⁺ et Mg ²⁺ (200 ul / échantillon) pendant 1 heure.
      1. Après séchage du dépôt de protéine, laver les échantillons deux fois avec du DPBS pour éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter des échantillons de se sécher, car cela génère protéines dénaturalisation. Utilisation du DPBS contenant du Ca ²⁺ et Mg 2+ depuis cations bivalents régulent le repliement des protéines.
   3. cellules de semences sur des lamelles de verre dans un puits d'une plaque 12 puits multiples (où rondelles Fit). Pour ce faire, utilisez une suspension cellulaire très concentré pour éviter la perte de cellules après la pose du substrat dorsale.
   4. Et avec précaution à l'aide d'une paire de pinces, recouvrir le substrat dorsal sur les cellules. Recharge avec le milieu (1 ml) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO _2.
      Remarque: Le poids de la rondelle empêche le substrat dorsal de flotter.
   5. Changer le support deux fois par semaine que dans les cultures 2D standard.
      Note: Ne pas déplacer le substrat dorsale car cela pourrait entraîner des dommages aux cellules.

3. Analyse

Remarque: Les cultures de sandwich sont basés sur des substrats en 2D, et ainsi peuvent être analysées par des procédés communément déjà développés pour les cultures 2D standard. Par exemple, étant donné que le PLLA est transparent et cells sont contraints de se déplacer dans le plan xy, la microscopie est effectuée sur des substrats en 2D. La migration cellulaire peut donc être analysé comme pour les cultures 2D, sans qu'il soit nécessaire de suivre dans les cellules de l'axe z comme des cultures 3D, ce qui simplifie l'analyse de l'expérience et de l'image. Pour étudier le dosage de cicatrisation par un essai de zéro suivre ce protocole:

1. Etude de la migration cellulaire (test de guérison de la plaie) dans la culture en sandwich.
   1. Travailler dans une hotte de culture afin d'assurer des conditions stériles et stériliser tous les matériaux (lamelles de verre, les substrats dorsales, pinces, etc.) par l'exposition aux UV pendant 30 minutes.
   2. Enduire le substrat ventral et dorsal avec la fibronectine dans le but de diriger l'adhérence cellule-spécifique de protéines. Pour ce faire, incuber les échantillons à 20 pg / ml de fibronectine dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), contenant Ca ²⁺ et Mg ²⁺ par Dulbecco pendant 1 heure.
      1. Après le revêtement de protéines, laver les échantillons deux fois avec DPBSafin d'éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter de se sécher les échantillons car cela pourrait causer des protéines dénaturalisation. Utilisez DPBS contenant Ca ²⁺ et Mg ²⁺ depuis cations bivalents régulent le repliement des protéines.
   3. cellules de semences sur les lamelles de verre à haute densité ^13.
   4. Placer les échantillons dans une étuve à 37 ° C avec 5% de CO ₂ et permettent aux cellules pour atteindre la confluence.
   5. Utiliser un embout de pipette pour rayer la monocouche cellulaire afin d'obtenir deux populations de cellules séparées par un espace.
   6. Placez le substrat ensemencé ventrale dans un nouveau puits approprié pour l'acquisition time-lapse et où substrats dorsales intègrent (soit 12 plaque multi-puits).
   7. Avec soin et avec l'aide d'une paire de pinces, superposer le substrat dorsal sur les cellules, puis remplir avec le milieu (1 ml pour une plaque 12 multi-puits).
      Remarque: Le poids de la rondelle empêchera til dorsale substrat de flotter.
   8. Placer l'échantillon dans le microscope time-lapse (fixé à 37 ° C et 5% de CO ₂₎ et de prendre des images de la fermeture de l'écart toutes les 20 min.
   9. Analyser la fermeture de l'écart à l'aide de logiciels spécifiques comme le MiToBo de plugin à partir de ImageJ. ¹⁴

Remarque: Les protéines et extraction d'acide nucléique est effectuée de manière similaire comme sur des substrats 2D. Il n'y a qu'une étape supplémentaire qui consiste à démonter la culture en sandwich d'ajouter le tampon de lyse directement sur les cellules afin d'augmenter le rendement d'extraction. Par exemple, pour l'extraction de l'ARNm:

2. Extrait de l'ARNm à partir de cultures de sandwich
   1. Préparer tous les tampons du kit commercial selon les instructions du fabricant.
   2. Prendre la culture en sandwich à partir de l'incubateur.
   3. Retirez le support de culture à partir des échantillons.
   4. Laver les échantillons une fois avec DPBS contenant Ca2+ et Mg ²⁺ (1 ml) et enlever toute la solution.
   5. Avec l'aide d'une paire de pinces, enlever le substrat dorsal et ajouter le tampon de lyse (350 ul) sur le substrat ventral. Superposition de nouveau le substrat dorsal ventral sur le substrat afin de lyser les cellules qui adhèrent également au substrat dorsal.
   6. Enlever le substrat dorsal pour isoler la solution de lyse.
   7. Suivez les instructions du fabricant pour obtenir l'ARNm.

Remarque: immunodétection des protéines peut également être effectuée sur des substrats en tant que 2D. Depuis cultures sandwich-like pourraient entraver la diffusion correcte des anticorps et des tampons, des temps d'incubation devraient être augmentés. En outre, le sandwich peut être démonté avant de démarrer le protocole de coloration mais dans ce dernier cas, certaines cellules restera attaché au substrat dorsal et d'autres sur le substrat ventral.

3. Protéines Immunodetect sein d'une culture de sandwich
   1. Laver l'échantillon une fois avec DPBS et fixer avec 4% de formaldéhyde dans du PBS pendant 20 min à 4 ° C.
      Remarque: substrat dorsal peut être enlevé pendant le processus de fixation de sorte que les problèmes de diffusion sont évités.
   2. Rincer avec du DPBS (1 ml), puis perméabiliser avec 0,5% de Triton X-100 dans du DPBS (1 ml) pendant 5 min à température ambiante.
   3. Bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 1% d'albumine dans du DPBS (1 ml) pendant 30 min à température ambiante.
   4. Incuber avec l'anticorps primaire (2 ug / ml; 1 ml) dans une solution de blocage pendant 3 heures à température ambiante.
   5. Laver trois fois pendant 10 minutes avec du DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml).
   6. Incuber 2 h avec des anticorps secondaires (2 ug / ml) et 1 ug / ml de DAPI dans une solution de blocage (1 ml) à température ambiante.
   7. Laver trois fois pendant 10 minutes dans du DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml).
   8. Laver dans du DPBS.
      Note: Les échantillons peuvent être montés sur une diapositive avec Vectashield et scellés avec du vernis à ongles quand substrats dorsales sont retirés avant l'immunodétection.
   9. Observer sous la fluorescence de micro-champ d'application que pour des substrats 2D standard.

Résultats

La stimulation des récepteurs dorsales dans la culture en sandwich déclenche des changements dans la morphologie cellulaire, l'adhésion cellulaire et des voies de signalisation intracellulaires (par exemple, l'adhérence focale kinase, FAK) ^12/10. A titre d'exemple, des fibroblastes en culture dans le système sandwich surexprimés la sous-unité α de l'intégrine ₅ par rapport au 2D, comme on l'observe pour d'autres cultures 3D ^15,16.

Discussion

De nos jours, la culture 3D est un sujet important pour l'industrie pharmaceutique et biotechnologique ainsi que la recherche en biologie cellulaire, y compris le cancer et les cellules souches. En conséquence, plusieurs systèmes de culture en 3D ont été développés. Malheureusement, les différences entre les systèmes 3D se traduisent habituellement par le comportement des cellules différentes, ce qui entrave la compréhension du destin cellulaire. En outre, les procédures expérimentales sont généralemen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent