Сэндвич-как микросреды, чтобы использовать Cell / Материал взаимодействий

Резюме

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Аннотация

Клеточные культуры традиционно проводится на двумерная (2D) подложки, где клетки придерживаются помощью брюшной рецепторы поверхности биоматериала. Однако в естественных условиях, большинство клеток полностью окружены внеклеточного матрикса (ЕСМ), в результате трехмерного (3D) распределения рецепторов. Это может вызвать различия в за-в сигнальных путей и, таким образом, в поведении клеток.

Эта статья показывает, что стимулирование спинной рецепторы клеток уже придерживались в 2D подложки путем накладывания пленки нового материала (сэндвич-как культура) вызывает значительные изменения в отношении стандартных 2D культур. Кроме того, одновременное возбуждение брюшной и спинной рецепторов сдвигает поведение клеток ближе к найденному в 3D среде. Кроме того, из-за природы системы, сэндвич-культура, как это универсальный инструмент, который позволяет изучение различных параметров в ячейке / материала интеractions, например, топография, жесткость и различные белковые покрытия как на брюшной и спинной сторон. Наконец, так как сэндвич-как культуры на основе 2D субстратах, несколько процедур анализа уже разработаны для стандартных 2D культур можно использовать как обычно, преодолевая более сложные процедуры, необходимые для 3D систем.

Введение

Традиционно, культуры клеток была проведена на би-мерных (2D) подложки, хотя большинство из естественных клеточных в микросреды имеют трехмерную (3D) характер. Это неестественное 2D среда вызывает изменения в поведении клеток как способ самонастройки в плоском мире, которые непосредственно влияет сотовый судьба ^1,2. Следовательно, результаты, полученные на культурах клеток 2D не всегда воспроизводимы в естественных условиях. Это способствовало развитию новых соответствующих систем культивирования, стремящихся обеспечить более физиолого-как условия, чтобы получить более полное представление о любой размерности зависит от биологического механизма ^3,4.

Одним из основных различий между 2D культуры и 3D в естественных условиях окружающей среды распределение клеточных рецепторов на якоре в внеклеточного матрикса (ЕСМ): в то время как на 2D субстраты клетки придерживаться снизу, большинство клеток в естественных условиях полностью окружен ECM и Таким образом, сеLL адгезия происходит через распределение 3D рецепторов. Это вызывает различные пути клеточной адгезии сигнализации, таким образом, модулирующих важные процессы, такие как рост клеток, дифференциации клеток и экспрессии генов. В течение последних десятилетий, много различных систем 3D культуры были созданы ^5-8, хотя их изменчивость и сложность препятствуют их стандартизации в общих процедур клеточных культур. Кроме того 3D системы, как правило, не так легко обрабатывать, и в настоящее время экспериментальные процедуры по 2D субстратам не может быть легко установлено на 3D культур. Кроме того, литература редко сравнивает 3D культур с эквивалентным условием 2D или других 3D систем, препятствующих правильному пониманию поведения клеток в этих моделях.

После того, как имеющие клетки, прилипшие на 2D подложки, возбуждением рецепторов спинных - путем наложения пленки нового материала (сэндвич-как культура) - может вызвать клеточные ответы, так 3D сред. REAсын за это одновременное срабатывание обоих спинных и брюшных рецепторов придерживаться и распространения в окружающей среде сэндвич (рис 1) ^9,10. Как следствие, клетки претерпевают существенных изменений по отношению к 2D культур ^11,12. Таким образом, судьба клеток определяется во время сборки из-за сэндвич культуры, так как спинной стимуляция вызывает изменения в ключевых клеточных путей. Поэтому судьба клеток высоко определяется временем, когда сэндвич-культура, как собранном ^11.

Из-за природы системы, сэндвич-как культура простой и универсальный инструмент, который позволяет изучение различных параметров в ячейки / материальных взаимодействий, таких как химия, топографии, жесткости и белковых покрытий как на брюшной и спинной сторон. Это обеспечивает более высокую степень универсальности по сравнению с другими 3D систем (рисунок 2) в связи с независимой спинной и брюшной сочетания широкого противАриети поверхностных условий. Кроме того, различные клеточные линии и различные времена, чтобы собрать бутерброд, как культура может быть изучена, увеличивая широкий спектр возможностей.

Стандартный протокол сэндвич-как культуры подробно ниже, используя либо поли-L-молочной кислоты (ПЛМК) electrospun волокна или пленки, как спинной субстратов, покровного стекла в качестве подложки брюшной и фибронектина как белка покрытием. Сэндвич-как культуры были собраны сразу после посева клеток или после 3 часов в 2D культуре. Тем не менее, обратите внимание, что могут быть использованы другие материальные системы и белки; Точно так же, как сэндвич-культура может быть собран в различные моменты времени.

протокол

1. Производство Спинной субстратов

1. Производство плоской пленки ПЛМК литьем с растворителем.
   1. Работа в вытяжном шкафу с получением раствора 2% (вес / объем) ПЛМК в хлороформе (2 г ПЛМК в 100 мл хлороформа) с перемешиванием при комнатной температуре (RT) до полного растворения (приблизительно 3 ч).
   2. Поместите шайбы на стеклянной чашке Петри.
      Примечание: Используйте шайбы из нержавеющей стали с внутренним диаметром 10,5 мм (немного меньше, чем диаметр брюшной образец) так, чтобы машина установлена ​​на верхней части брюшной подложки. Другие материалы, такие как политетрафторэтилен (ПТФЭ) или стеклянными шайбами ​​можно использовать также.
   3. Добавить 200 мкл раствора в PLLA шайбы и пусть медленно испаряться в течение 30 мин при комнатной температуре. Для того чтобы обеспечить медленное испарение растворителя, закрыть чашку Петри с алюминиевой фольгой с несколькими отверстиями.
   4. Тепло образцов при 120 ° С в течение 5 мин, чтобы испарить растворитель следы.
   5. Пусть образцы прохладно делатьWn при комнатной температуре.
   6. После образцы охладились (примерно 30 мин), накрыть 18,2 мОм · см воды в чашку Петри и инкубировали в течение 8 минут при комнатной температуре.
      Примечание: Если образцы не полностью остынет, они могут принять до 18,2 МОм · см воды и принять резиновой состояние. Кроме того, инкубирование в 18,2 МОм · см воды менее чем за 8 мин может привести к неправильной отряда, и за более чем 8 мин в отрешенности от шайбы.
   7. С бритвой, вырвать шайбы, чтобы очистить их от чашку Петри.
   8. Удалите все недостатки от края шайбы с помощью пинцета и пусть образцы воздушно-сухой.
   9. Хранить образцы в вакуумном эксикаторе (80 мбар) до дня эксперимента, поскольку ПЛМК является разложению в результате гидролиза.
2. Производство PLLA волокон электропрядения.
   1. Работа в вытяжном шкафу, чтобы приготовить раствор 8% (вес / объем) ПЛМК в гексафторизопропаноле (8 г ПЛМК в 100 мл гексафторизопропаноле) по stirrING в РТ до полного растворения (3 ч приблизительно).
   2. Поместите политетрафторэтилен (ПТФЭ) шайбы на алюминиевом листе или на барабане для электропрядения, чтобы получить случайные или выровненные волокна соответственно.
      Примечание: Использование политетрафторэтилена (ПТФЭ) шайбы с внутренним диаметром 10,5 мм (немного меньше, чем диаметр брюшной образец) так, чтобы машина установлена ​​на верхней части брюшной подложки. Другие материалы, такие как шайбы из нержавеющей стали или стекла могут быть использованы также. Барабан должен вращаться с угловой скоростью 160,7 с ^-1 (радиус = 7 см), чтобы получить выровненные волокна. Медленнее скорость не может вызвать выравнивание волокна и быстрее скорости приведет к сломанной волокон.
   3. Загрузите шприц с раствором полимера и поместить его на шприцевой насос.
   4. Electrospin решение ПЛМК использованием скорости 0,9 мл / ч потока с напряжением 30 кВ и коллектора расстоянии 12 см.
   5. Остановить процесс электропрядения кормеER 20-30 мин, когда хороший плотность волокон достигается (с клетки должны взаимодействовать с несколькими волокон одновременно).
   6. Тепло образцов при 120 ° С в течение 5 мин, чтобы испарить растворитель следы.
   7. Хранить образцы в вакуумном эксикаторе (80 мбар) до дня эксперимента, поскольку ПЛМК является разложению в результате гидролиза.

2. Сэндвич Культура

1. Соберите бутерброд, как когда-то культуру клетки придерживался брюшной 2D подложки.
   1. Работа в капот культуры, чтобы обеспечить стерильные условия и стерилизовать все материалы (покровные стекла, спинной субстраты, пинцет и т.д.) с помощью УФ-облучения в течение 30 мин.
   2. Пальто в брюшной и спинной подложки с фибронектина, чтобы направить конкретный адгезии клеток белка. Чтобы сделать это, инкубировать образцов в 20 мкг / мл фибронектина, растворенных в Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), содержащем Са ²⁺ и Mg ²⁺ (200 мкл / секобильным) в течение 1 ч.
      Примечание: Из-за процесса изготовления, спинной подложки имеют назначенного верхней и нижней стороны, так как растворитель литой пленки и волокна electrospun прикреплен к одной из сторон шайбы. Эта сторона Поэтому одним лицом клетки (рисунок 3).
      1. После белка покрытием, мыть образцы дважды DPBS, чтобы удалить белок в избытке. Тогда не инкубировать образцов в DPBS до их использования в целях предотвращения образцы от попадания сухой, так как это вызывает белка Денатурализация. Используйте DPBS, содержащие Са ²⁺ и Mg ^2+, так как двухвалентных катионов регулируют сворачивание белков.
   3. Семенной клеток на покровные стекла ^13.
      Примечание: В сэндвич-подобный культура основана на 2D субстратах, посева клеток будет выполняться аналогично тому, как на 2D образца. Например, C2C12 миобластов высевают 17500 клеток см ^-1 для дифференциации экспериментов и NIH3T3 фибробластов высевают в 7000 CELLS см ^-1 для изолированных культур для изучения морфологии клеток и адгезии.
   4. Поместите образцы в инкубаторе при 37 ° С с 5% СО ₂ и позволяют клеткам прилипать к брюшной подложки в течение 3 ч.
   5. Поместите брюшной семенами подложки в новой скважины 12 мульти-луночного планшета в (где шайбы подходят).
      Примечание: Сборка сэндвич-как культуру в новой скважины является одним из способов, чтобы избавиться от клеток, которые придерживались на дно и после посева, так как они будут потреблять питательные вещества и выделяют факторы роста и отходов, которые оказывают влияние клетки культивировали в течение сэндвич-подобная система. Это также необходимо для клеточных экстрактов, чтобы лизировать только клетки, культивируемые в сэндвич-среде.
   6. Тщательно и с помощью пинцета, наложение спинной подложку на клетки. Пополнение с среды (1 мл) и инкубируют при 37 ° С с 5% СО _2.
      Примечание: вес шайбы предотвращает спинной субСтрейт из плавающей.
   7. Изменение среды два раза в неделю, как в стандартных 2D культур. Не перемещайте спинной субстрат, так как это может привести к повреждению клеток.
2. Соберите бутерброд, как культуру только после посева клеток.
   1. Работа в капот культуры, чтобы обеспечить стерильные условия и стерилизовать все материалы (покровные стекла, спинной субстраты, пинцет и т.д.) с помощью УФ-облучения в течение 30 мин.
   2. Пальто в брюшной и спинной подложки с фибронектина, чтобы направить конкретный адгезии клеток белка. Чтобы сделать это, инкубировать образцов в 20 мкг / мл фибронектина, растворенных в DPBS, содержащих Ca ²⁺ и Mg ²⁺ (200 мкл / образец) в течение 1 ч.
      1. После белка покрытием, мыть образцы дважды DPBS, чтобы удалить белок в избытке. Тогда не инкубировать образцов в DPBS до их использования в целях предотвращения образцы от попадания сухой, так как это вызывает белка Денатурализация. Используйте DPBS, содержащие Са ²⁺ и Mg 2+ с двухвалентные катионы регулировать сворачивание белков.
   3. Семенной клеток на покровных стеклах в лунку 12-луночного нескольких планшеты (где шайбы подходят). Чтобы сделать это, используйте высококонцентрированные суспензии клеток, чтобы избежать потери клеток после укладки спинной подложку.
   4. Тщательно и с помощью пинцета, наложение спинной подложку на клетки. Пополнение с среды (1 мл) и инкубируют при 37 ° С с 5% СО _2.
      Примечание: масса шайбы предотвращает спинной подложку из плавающей.
   5. Изменение среды два раза в неделю, как в стандартных 2D культур.
      Примечание: Не перемещайте спинной субстрат, так как это может привести к повреждению клеток.

3. Анализ

Примечание: Сэндвич-подобный культуры на основе 2D субстратах, и поэтому может быть широко анализировали с помощью процедур, уже разработанных для стандартных 2D культур. Например, с ПЛМК прозрачна и селLs ограничены для перемещения в плоскости ху, микроскопия сделано как на 2D субстратах. Миграция клеток может быть поэтому анализировали, как для 2D культур, без необходимости отслеживания клетки в оси как для 3D-культур, которые упрощает эксперимент и анализ изображения. Для изучения заживления ран анализа к царапинам анализе читать этот протокол:

1. Исследование миграции клеток (заживление ран анализ) в сэндвич-как и культура.
   1. Работа в капот культуры, чтобы обеспечить стерильные условия и стерилизовать все материалы (покровные стекла, спинной субстраты, пинцет и т.д.) с помощью УФ-облучения в течение 30 мин.
   2. Пальто в брюшной и спинной подложки с фибронектина, чтобы направить конкретный адгезии клеток белка. Чтобы сделать это, инкубировать образцов в 20 мкг / мл фибронектина, растворенных в Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), содержащем Са ²⁺ и Mg ²⁺ в течение 1 часа.
      1. После белка покрытия, мыть образцы дважды DPBSдля того, чтобы удалить белок в избытке. Затем образцы инкубируют не в DPBS до их использования в целях предотвращения попадания образцы сухой, так как это может привести к белка Денатурализация. Используйте DPBS, содержащие Са ²⁺ и Mg ^2+, так как двухвалентных катионов регулируют сворачивание белков.
   3. Семенной клеток на покровные стекла при высокой плотности ^13.
   4. Поместите образцы в инкубаторе при 37 ° С с 5% CO ₂ клетки и позволит достичь слияния.
   5. Используйте пипетки, чтобы не поцарапать клеточный монослой для того, чтобы получить 2 клеточных популяций, разделенных зазором.
   6. Поместите брюшной семенами субстрата в новый хорошо подходит для приобретения покадровой и где спинной субстраты подходят (т.е. 12 мульти-луночного планшета).
   7. Тщательно и с помощью пинцета, наложение спинной подложку на клетки, а затем залить среды (1 мл в течение 12 мульти-луночного планшета).
      Примечание: масса шайбы предотвращает тон спинной подложку из плавающей.
   8. Поместите образец в покадровой микроскоп (задать до 37 ° С и 5% СО ₂₎ и получать изображения закрытия зазора каждые 20 мин.
   9. Анализ закрытия зазора с помощью специального программного обеспечения, такие как плагин MiToBo от ImageJ. ¹⁴

Примечание: Белок и экстракции нуклеиновой кислоты выполняется аналогично тому, как на 2D субстратов. Существует только один дополнительный шаг, который заключается в разборке сэндвич-культуры, как добавить лизирующего буфера непосредственно на клетках с целью повышения эффективности извлечения. Например, для извлечения мРНК:

2. Выписка мРНК из сэндвич-как культур
   1. Подготовьте все буферы из коммерческого набора в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
   2. Возьмите сэндвич-как культуру из инкубатора.
   3. Извлеките культуральной среды из образцов.
   4. Вымойте образцы один раз DPBS содержащий Ca2+ и Mg ²⁺ (1 мл) и снимите весь раствор.
   5. С помощью пинцета, удалить спинной подложку и добавить лизирующего буфера (350 мкл) в брюшной подложки. Перекрытие снова спинной подложки, на вентральной подложки для того, чтобы лизировать клетки и прилипшие к спинной подложки.
   6. Удалить спинной подложку, чтобы изолировать лизиса решение.
   7. Следуйте инструкциям производителя, чтобы получить мРНК.

Примечание: Иммунологический белков также может быть выполнена также на 2D субстратах. Так сэндвич-культуры, как может помешать правильной диффузии антител и буферы, времени инкубации должна быть увеличена. Кроме того, сэндвич может быть разобран перед началом протокола окрашивания, но в этом последнем случае некоторые клетки остаются прикрепленными к спинной подложки и некоторые брюшной подложки.

3. Immunodetect белки внутри сэндвич-как и культура
   1. Промыть образец один раз DPBS и исправить с помощью 4% формальдегида в PBS в течение 20 мин при 4 ° С.
      Примечание: Спинной подложка может быть удалена в процессе фиксации, так что можно избежать проблемы диффузии.
   2. Промыть DPBS (1 мл), а затем проницаемыми с 0,5% Triton X-100 в DPBS (1 мл) в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Блок неспецифические сайты связывания с 1% альбумина в DPBS (1 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре.
   4. Инкубируйте с первичным антителом (2 мкг / мл; 1 мл) в блокирующем растворе в течение 3 ч при комнатной температуре.
   5. Промыть 3 раза в течение 10 мин с DPBS / 0,5% Tween 20 (1 мл).
   6. Инкубируют 2 ч с вторичными антителами (2 мкг / мл) и 1 мкг / мл DAPI в блокирующем растворе (1 мл) при комнатной температуре.
   7. Промыть 3 раза в течение 10 мин в DPBS / 0,5% Tween 20 (1 мл).
   8. Стирать в DPBS.
      Примечание: Образцы могут быть установлены на слайде с Vectashield и запечатаны с лаком для ногтей, когда спинной субстраты удалены перед на иммунологического.
   9. Соблюдайте под флуоресцентным микроСфера, как для стандартных 2D субстратах.

Результаты

Стимулирование рецепторов спинных в сэндвич-как и культура вызывает изменения в морфологии клеток, клеточной адгезии и внутриклеточных сигнальных путей (например, фокальные контакты киназы, ФСП) ^10-12. В качестве примера, фибробласты культивировали в сэндвич-подобные системы...

Обсуждение

В настоящее время, 3D культура важная тема для фармацевтической и биотехнологической промышленности, а также исследования в области клеточной биологии, в том числе рака и стволовых клеток. Как следствие, были разработаны несколько 3D системы культуры. К сожалению, различия между 3D систе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ploy(lactic acid)	NatureWorks	4042D	Reagent
Cover glasses (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Equipment
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagent
Syringe (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Equipment
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000	Equipment
High Voltage DC Power Supply	Glassman High Voltage	Series FC	Equipment
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Equipment
Laminar flow  hood	Telstar	AV30/70	Equipment
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagent
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagent
Inverted microscope	Leica Microsystems	DMI 6000	Equipment
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagent
Albumin	Sigma-Aldrich	A7409	Reagent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagent