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Method Article
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Clonalidad tumor comprensión es fundamental para la comprensión de los mecanismos implicados en la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad. Además, la comprensión de los cambios en la composición clonal que se producen dentro de un tumor en respuesta a ciertos micro-entorno o tratamientos puede conducir al diseño de los enfoques más sofisticados y eficaces para erradicar las células tumorales. Sin embargo, el seguimiento de tumores clonales subpoblaciones ha sido difícil debido a la falta de marcadores distinguibles. Para abordar este problema, un protocolo VDJ-ss fue creado para rastrear los patrones de evolución clonal de linfoma de células grandes B (DLBCL) recaída difusa mediante la explotación de recombinación VDJ e hipermutación somática (SHM), dos características únicas de los linfomas de células B.
En este protocolo, la secuenciación de próxima generación (NGS) bibliotecas con potencial de indexación se construyeron a partir de la cadena pesada de inmunoglobulina amplificado reordenado (CIB) región VDJ de pares de diagnóstico primario y la recaída samp DLBCLles. En promedio se obtuvieron más de medio millón de secuencias VDJ por muestra después de la secuenciación, que contienen tanto VDJ reordenamiento e información SHM. Además, se desarrollaron tuberías bioinformática personalizadas para utilizar plenamente la información de secuencia para la caracterización de CIB-VDJ repertorio dentro de estas muestras. Además, la tubería permite la reconstrucción y la comparación de la arquitectura clonal de los tumores individuales, lo que permite el examen de la heterogeneidad clonal dentro de los tumores de diagnóstico y deducción de los patrones de evolución clonal entre diagnóstico y pares de recaída del tumor. Al aplicar este análisis a varios pares diagnóstico de recaída, descubrimos evidencia clave de que múltiples patrones evolutivos tumorales distintivo podrían llevar a DLBCL recaída. Además, este enfoque se puede ampliar a otros aspectos clínicos, como la identificación de la enfermedad residual mínima, seguimiento de los avances recaída y la respuesta al tratamiento y la investigación de repertorio inmunológicoes en contextos no-Hodgkin.
El cáncer es una enfermedad clonal. Desde hace treinta años, cuando Peter C. Nowell propuso el modelo de evolución clonal del cáncer 1, muchos estudios han tratado de diseccionar poblaciones clonales dentro de las muestras tumorales y reconstruir los patrones de expansión y evolución clonal que subyacen en el proceso de tumorigénesis 2. Recientemente, la secuenciación del genoma ha permitido a los investigadores a tener una mirada profunda a la heterogeneidad clonal y evolución 3,4. Sin embargo, debido a la falta de marcadores tratables en muchos tipos de células, es difícil para inferir la arquitectura clonal precisa y la ruta evolutiva. Afortunadamente hay un marcador clonalidad natural en células B maduras de las que muchas neoplasias linfoides, incluyendo DLBCL, originan. En respuesta a la estimulación antigénica, cada una de las células B puede formar una sola productiva secuencia IgH VDJ uniéndose a un V H (variable), un D (diversidad) y J H (unión) segmento juntos desde un gran número de estos segmentos. Durante este proceso, pequeñas porciones de la secuencia original pueden ser borrados y los nucleótidos no moldeados adicionales pueden añadirse para crear un reordenamiento VDJ único. Este reordenamiento VDJ específico puede ser heredado en toda la progenie de esta célula B, por lo tanto, el etiquetado de las células B individuo maduro y su descendencia 5. Además, SHM se produce en las secuencias VDJ recombinados en la reacción subsiguiente del centro germinal (GC) para introducir mutaciones adicionales para la expansión de la piscina de anticuerpos y la mejora de la afinidad de anticuerpos 6. Por lo tanto, comparando y contrastando los patrones de muestras de linfoma que se han sometido a estos procesos VDJ y SHM, la heterogeneidad intra-tumor podría ser delineado y ruta de evolución clonal de la enfermedad puede ser deducida.
Anteriormente, VDJ reordenamiento y SHM podrían ser identificados por PCR amplificando las regiones recombinados, la clonación de los productos de PCR, y posteriormente secuenciación de Sanger para obtener información de la secuencia. Este enfoque is de bajo rendimiento y bajo rendimiento, la recuperación de sólo una muy pequeña parte de todo el repertorio VDJ recombinado, y dificultando la caracterización de la representación general de la población clonal dentro de una muestra dada. Un enfoque modificado fue creado mediante la generación de bibliotecas de secuenciación NGS indexadas a partir de productos de PCR VDJ y la realización de PE secuenciación pb 2x150 para obtener más de medio millón de secuencias VDJ recombinados por muestra. Además, una canalización personalizada fue desarrollado para llevar a cabo control de calidad (QC), alinear, secuenciación VDJ filtro lee para identificar reordenamientos y SHMS de cada lectura, y llevar a cabo el análisis filogenético en la arquitectura clonal de cada muestra. Además, un nuevo enfoque ha sido establecido para caracterizar adicionalmente los patrones de evolución clonal para las muestras recogidas en diferentes etapas de la enfermedad.
Hemos aplicado esta técnica para las muestras de pacientes con DLBCL. DLBCL es una forma agresiva de linfoma no Hodgkin con recaídas frecuentes en hasta un ªIRD de los pacientes 7. Recaídas DLBCL normalmente ocurren temprano, en un plazo de 2 a 3 años del diagnóstico inicial, aunque algunos no se dan después de 5 años 8. El pronóstico para los pacientes con recidiva es pobre, con sólo el 10% el logro de 3 años la supervivencia libre de progresión, debido a las opciones de tratamiento limitadas. Esta es la base de la urgente necesidad de nuevos enfoques para el tratamiento de la recaída DLBCL 9,10. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con DLBCL recaídas siguen siendo en gran parte desconocido. En particular, el papel de la heterogeneidad clonal el momento del diagnóstico y la evolución clonal durante el desarrollo de recaídas DLBCL son actualmente no caracterizado, por lo que es difícil definir un biomarcador precisa y útil para predecir la recaída. Para abordar estas cuestiones, hemos aplicado nuestro enfoque VDJ-secuenciación de múltiples pares de diagnóstico de recaída primaria pares de muestras DLBCL emparejados. Dos escenarios de evolución clonales distintas de recaída surgieron de la comparación de las arquitecturas clonales entre el diagnóstico y samp recaídales sugiere que múltiples mecanismos moleculares puede estar implicada en DLBCL recaída.
1. VDJ amplificación
1.1) La extracción de ADN a partir de muestras de tumores
1.2) Evaluación de la Calidad de ADN
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 1 (IgVHFR1)
1.3.2) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 2 (IgVHFR2)
1.4) Optimizar VDJ PCR
2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparación y secuenciación
2.1) Preparación Biblioteca
2.1.1) Fin de reparación
2.1.2) A-tizón
2.1.3) Adaptador Ligadura
2.1.4) Los fragmentos de ADN Amplify
2.1.5) Biblioteca de Validación
2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling y secuenciación
Análisis 3. Datos
Nota: Un summario de los guiones bioinformáticos utilizados en esta sección se puede encontrar como un Código Archivo suplementario.
3.1) Alineación y control de calidad
3.2) SHM Perfil de Identificación
3.3) La representación gráfica de los resultados
3.4) La heterogeneidad (entropía) Medición
El procedimiento general de secuenciación VDJ (VDJ-SEC), incluyendo la extracción de ADN, recombina VDJ región de amplificación y purificación, la construcción de bibliotecas de secuenciación, se lee en el procesamiento y el análisis filogenético, está representado en la Figura 1. Rutinariamente de 5-200 g de ADN puede ser recuperada a partir de secciones de tejido sólido congelado o 0,5 a 20 g de ADN a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol. De...
Debido al número casi ilimitado de iteraciones de información de la secuencia codificada por VDJ reordenamiento y SHM en el locus IGH de células B humanas, el examen de todo el repertorio IGH por alto rendimiento en alta secuenciación demostró ser una forma eficaz y completa para delinear clonal y las poblaciones de células B sub-clónicas. Además, esta estrategia se puede utilizar para estudiar la ruta de evolución clonal de desarrollo de células B tumor, remisión y recaída mediante la comparación de las ar...
The authors have no conflicts of interest to disclose.
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
MiSeq | Illumina | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
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