VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B

Resumen

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Resumen

Clonalidad tumor comprensión es fundamental para la comprensión de los mecanismos implicados en la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad. Además, la comprensión de los cambios en la composición clonal que se producen dentro de un tumor en respuesta a ciertos micro-entorno o tratamientos puede conducir al diseño de los enfoques más sofisticados y eficaces para erradicar las células tumorales. Sin embargo, el seguimiento de tumores clonales subpoblaciones ha sido difícil debido a la falta de marcadores distinguibles. Para abordar este problema, un protocolo VDJ-ss fue creado para rastrear los patrones de evolución clonal de linfoma de células grandes B (DLBCL) recaída difusa mediante la explotación de recombinación VDJ e hipermutación somática (SHM), dos características únicas de los linfomas de células B.

En este protocolo, la secuenciación de próxima generación (NGS) bibliotecas con potencial de indexación se construyeron a partir de la cadena pesada de inmunoglobulina amplificado reordenado (CIB) región VDJ de pares de diagnóstico primario y la recaída samp DLBCLles. En promedio se obtuvieron más de medio millón de secuencias VDJ por muestra después de la secuenciación, que contienen tanto VDJ reordenamiento e información SHM. Además, se desarrollaron tuberías bioinformática personalizadas para utilizar plenamente la información de secuencia para la caracterización de CIB-VDJ repertorio dentro de estas muestras. Además, la tubería permite la reconstrucción y la comparación de la arquitectura clonal de los tumores individuales, lo que permite el examen de la heterogeneidad clonal dentro de los tumores de diagnóstico y deducción de los patrones de evolución clonal entre diagnóstico y pares de recaída del tumor. Al aplicar este análisis a varios pares diagnóstico de recaída, descubrimos evidencia clave de que múltiples patrones evolutivos tumorales distintivo podrían llevar a DLBCL recaída. Además, este enfoque se puede ampliar a otros aspectos clínicos, como la identificación de la enfermedad residual mínima, seguimiento de los avances recaída y la respuesta al tratamiento y la investigación de repertorio inmunológicoes en contextos no-Hodgkin.

Introducción

El cáncer es una enfermedad clonal. Desde hace treinta años, cuando Peter C. Nowell propuso el modelo de evolución clonal del cáncer ^1, muchos estudios han tratado de diseccionar poblaciones clonales dentro de las muestras tumorales y reconstruir los patrones de expansión y evolución clonal que subyacen en el proceso de tumorigénesis ^2. Recientemente, la secuenciación del genoma ha permitido a los investigadores a tener una mirada profunda a la heterogeneidad clonal y evolución ^3,4. Sin embargo, debido a la falta de marcadores tratables en muchos tipos de células, es difícil para inferir la arquitectura clonal precisa y la ruta evolutiva. Afortunadamente hay un marcador clonalidad natural en células B maduras de las que muchas neoplasias linfoides, incluyendo DLBCL, originan. En respuesta a la estimulación antigénica, cada una de las células B puede formar una sola productiva secuencia IgH VDJ uniéndose a un V _H (variable), un D (diversidad) y J _H (unión) segmento juntos desde un gran número de estos segmentos. Durante este proceso, pequeñas porciones de la secuencia original pueden ser borrados y los nucleótidos no moldeados adicionales pueden añadirse para crear un reordenamiento VDJ único. Este reordenamiento VDJ específico puede ser heredado en toda la progenie de esta célula B, por lo tanto, el etiquetado de las células B individuo maduro y su descendencia ^5. Además, SHM se produce en las secuencias VDJ recombinados en la reacción subsiguiente del centro germinal (GC) para introducir mutaciones adicionales para la expansión de la piscina de anticuerpos y la mejora de la afinidad de anticuerpos ^6. Por lo tanto, comparando y contrastando los patrones de muestras de linfoma que se han sometido a estos procesos VDJ y SHM, la heterogeneidad intra-tumor podría ser delineado y ruta de evolución clonal de la enfermedad puede ser deducida.

Anteriormente, VDJ reordenamiento y SHM podrían ser identificados por PCR amplificando las regiones recombinados, la clonación de los productos de PCR, y posteriormente secuenciación de Sanger para obtener información de la secuencia. Este enfoque is de bajo rendimiento y bajo rendimiento, la recuperación de sólo una muy pequeña parte de todo el repertorio VDJ recombinado, y dificultando la caracterización de la representación general de la población clonal dentro de una muestra dada. Un enfoque modificado fue creado mediante la generación de bibliotecas de secuenciación NGS indexadas a partir de productos de PCR VDJ y la realización de PE secuenciación pb 2x150 para obtener más de medio millón de secuencias VDJ recombinados por muestra. Además, una canalización personalizada fue desarrollado para llevar a cabo control de calidad (QC), alinear, secuenciación VDJ filtro lee para identificar reordenamientos y SHMS de cada lectura, y llevar a cabo el análisis filogenético en la arquitectura clonal de cada muestra. Además, un nuevo enfoque ha sido establecido para caracterizar adicionalmente los patrones de evolución clonal para las muestras recogidas en diferentes etapas de la enfermedad.

Hemos aplicado esta técnica para las muestras de pacientes con DLBCL. DLBCL es una forma agresiva de linfoma no Hodgkin con recaídas frecuentes en hasta un ªIRD de los pacientes ^7. Recaídas DLBCL normalmente ocurren temprano, en un plazo de 2 a 3 años del diagnóstico inicial, aunque algunos no se dan después de 5 ^años 8. El pronóstico para los pacientes con recidiva es pobre, con sólo el 10% el logro de 3 años la supervivencia libre de progresión, debido a las opciones de tratamiento limitadas. Esta es la base de la urgente necesidad de nuevos enfoques para el tratamiento de la recaída DLBCL ^9,10. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con DLBCL recaídas siguen siendo en gran parte desconocido. En particular, el papel de la heterogeneidad clonal el momento del diagnóstico y la evolución clonal durante el desarrollo de recaídas DLBCL son actualmente no caracterizado, por lo que es difícil definir un biomarcador precisa y útil para predecir la recaída. Para abordar estas cuestiones, hemos aplicado nuestro enfoque VDJ-secuenciación de múltiples pares de diagnóstico de recaída primaria pares de muestras DLBCL emparejados. Dos escenarios de evolución clonales distintas de recaída surgieron de la comparación de las arquitecturas clonales entre el diagnóstico y samp recaídales sugiere que múltiples mecanismos moleculares puede estar implicada en DLBCL recaída.

Protocolo

1. VDJ amplificación

1.1) La extracción de ADN a partir de muestras de tumores

1. Extraer el ADN de las secciones delgadas (10 a 20 micras) de OCT tejidos normales o malignas incrustados congelados.
   1. Digerir 10-30 secciones delgadas de tejido embebido cortada por un micrótomo criostato en 4 ml de tampón de lisis nucleico (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na ₂ EDTA) con proteinasa K (0,5 mg / ml, concentración final ) y 0,625% SDS en un tubo de centrífuga de 15 ml en un baño de 37 ° C el agua durante la noche.
   2. Añadir 1 ml de NaCl saturado (5 M) a la mezcla de digestión y agitar vigorosamente durante 15 s.
   3. Centrifugar a 1100 xg durante 15 min a temperatura ambiente.
   4. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml y añadir dos volúmenes de etanol al 100%.
   5. Mezclar invirtiendo el tubo 6-8 veces. Centrifugar a 5000 xg durante 60 min a 4 ° C para recoger el ADN precipitado.
   6. Lavar el sedimento de ADN dos veces con etanol 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min cada vez para recoger el sedimento.
   7. Disolver el ADN en tampón TE de 100-400 l a temperatura ambiente en un agitador durante toda la noche. El rendimiento de ADN es de 5 a 200 g (concentración final de 50-500 entre ng / l), dependiendo del tamaño del tejido
2. Extraer el ADN de las secciones delgadas (10-20 M) de, incorporado (FFPE) tejido normal o maligno en parafina fijado con formalina.
   1. Incubar las secciones de parafina en 1 ml de xileno dos veces a temperatura ambiente durante 10 min cada vez en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para de-paraffinize. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Incubar las secciones en etanol al 1% dos veces 100 ml a temperatura ambiente, 10 minutos cada vez para eliminar residuos xilenos. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. La parafina se disuelve completamente en este punto y sólo la sección de tejido restante.
   3. Seque las secciones en sala de temperatura durante 10-15 min.
   4. Hacer una solución 0,5 mg / ml de proteinasa K con tampón de PCR 1X (diluido a partir de 10x tampón de PCR con agua libre de nucleasa). Añadir la solución de proteinasa K a las muestras en un volumen final de de 50-100 l e incubar durante la noche a 37 ° C.
   5. Calentar las muestras a 95 ° C durante 10 min para inactivar la proteinasa K.
      Nota: En este paso, se disuelve ADN de la muestra en el tampón de PCR y se puede utilizar en los pasos 1.2 y 1.3 directamente. El rendimiento de ADN es de 0,5 a 20 g (concentración final de 10-200 entre ng / l) en función del tamaño del tejido.

1.2) Evaluación de la Calidad de ADN

1. Mezclar 0,25 l de ADN polimerasa Taq con 45 l de mezcla maestra del kit escalera comercial en un tubo de PCR.
2. Añadir 5 l de ADN preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en el tubo de PCR y mezcle bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces.
3. Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C.
4. Preparar un gel de agarosa al 2% en TBE (Tris / borato / EDTA).
5. Mezclar 20 l de reacción de PCR con 4 l de colorante de carga 6x, y cargar en un gel de agarosa al 2%.
6. Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imaginación gel. Nota: las muestras que producen productos de PCR en 5 tamaños de 100, 200, 300, 400, y 600 pb se continuará para generar amplicones VDJ.
   PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno potente. Por favor, manejar con extrema precaución con el uso de equipo de protección, es decir, guantes, y disponer en contenedores específicos según las pautas de la institución.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 1 (IgVHFR1)

1. Mezclar mezcla maestra 45 l de la etiqueta del tuboed como "Mix 2" de una somática Hipermutación Ensayo IGH para la detección del gel kit comercial, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR.
2. Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C.
3. Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis.
4. Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imágenes de gel. Un amplicón monoclonal se espera que con el rango de tamaño de 310 a 380 pb.
5. Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 310 hasta 380 pb.
6. Se purifica el ADN a partir de gel escindido utilizando un kit de extracción en gel estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: para muestras que los fragmentos FR1 pudieron obtenerse, no hay necesidad de ampliamente IgVHFR2 y IgVHFR3.

1.3.2) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 2 (IgVHFR2)

1. Mezclar mezcla maestra 45 l del tubo etiquetado como "Tube B" de un Clonalidad Ensayo IGH gen comercial para el kit de detección de Gel, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR .
2. Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y dejar a 15 ° C.
3. Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis.
4. Visualice producto de PCR (s) en 0,5 g / ml de bromuro de etidio tinción. Un amplicón monoclonal se puede observar dentro de la gama de 250 a 295 pb de tamaño.
5. Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 250-295 pb.
6. Se purifica el ADN a partir de gel escindido usando un extracto estándar de Gelion Kit según el protocolo del fabricante.

1.4) Optimizar VDJ PCR

1. Utilice las siguientes condiciones de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 y IgVHFR2 utilizando ADN subóptima: 95 ° C por 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 segundos, 60ºC durante 60 segundos y 72 ° C durante 90 segundos, extensión final a 72 ° C durante 10 min.

2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparación y secuenciación

2.1) Preparación Biblioteca

2.1.1) Fin de reparación

1. Traslado VDJ producto de PCR de 1,3 en un tubo de PCR y añadir tampón de resuspensión de ADN Preparación de muestras Kit para llevar el volumen hasta 60 l.
2. Añadir 40 l de reparación Final Mix de Kit de Preparación de ADN de la muestra y mezclar bien.
3. Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C.
4. Mezclar 136 l perlas magnéticas y 24 g l PCRagua Rade primero en un tubo de 1,5 ml, a continuación, transferir toda la reacción End-reparación de 2.1.1.3 en el tubo de 1,5 ml y mezclar bien con la solución de perlas.
5. Colocar los tubos en un soporte magnético durante 2 minutos para permitir la separación de las perlas de la solución. Aspirar el sobrenadante y lavar las perlas con 80% fresca preparada EtOH dos veces mientras el tubo está en el soporte magnético.
6. Aspirar la solución de etanol por completo y permitir que las perlas se sequen al aire durante 15 min a temperatura ambiente durante 15 min.
7. Tome el tubo fuera de la base y volver a suspender las perlas magnéticas en 17,5 l tampón de resuspensión.
8. Colocar los tubos de nuevo en el soporte magnético durante 2 minutos para cuentas separadas de la resuspensión de búfer. Retire la resuspensión Buffer (producto final de reparación se vuelve a suspender en el tampón de resuspensión ahora) en un tubo de PCR limpio.

2.1.2) A-tizón

1. Añadir 12,5 l mezcla A-tizón en el tubo de PCR que contiene el producto final de reparación y mezclar bien.
2. Incubar el tubo de PCR a 37 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (37 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C.

2.1.3) Adaptador Ligadura

1. Añadir 2,5 l tampón de resuspensión, 2,5 l Ligadura Mix, y 2,5 l Índice adaptador de ADN en la reacción A-tizón.
2. Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 minl en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C.
3. Añadir 5 l Detener Ligadura de búfer en cada reacción y mezclar bien.
4. Mezclar 42,5 perlas magnéticas l bien mezclados para limpiar la reacción siguiendo los pasos 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Añadir 50 l tampón de resuspensión para eluir el producto ligado al adaptador.
5. Limpiar el producto ligado al adaptador para un segundo tiempo mediante el uso de 50 l bien mezclados perlas AMPure XP, y eluir el producto en 25 l tampón de resuspensión en un tubo de PCR limpio.

2.1.4) Los fragmentos de ADN Amplify

1. Añadir 5 l PCR Primer Cóctel y 25 l PCR Master Mix al tubo de PCR que contiene el producto ligado al adaptador y mezclar bien.
2. Realizar la amplificación en un termociclador pre-programado con las siguientes condiciones: 98 ° C durante 30 s; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos; luego 72 ° C durante 5 minutos y mantenga a 10 ° C.
3. Limpiar la reacción mediante el uso de perlas magnéticas 50 l bien mezclados, y eluir el producto final en 30 l tampón de resuspensión.

2.1.5) Biblioteca de Validación

1. Cuantificar el producto final con un fluorómetro utilizando el protocolo del fabricante. Concentración biblioteca final está entre 2.5 a 20 ng / l.
2. Evaluar la calidad del producto final mediante el uso de un instrumento analítico con el chip de ADN de alta sensibilidad de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuente con una sola banda con el tamaño esperado para cualquiera IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Texpected tamaño del producto biblioteca es igual al tamaño del amplicón VDJ original más el tamaño de los adaptadores (~ 125 pb).

2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling y secuenciación

1. Calcular la molaridad de cada fracción biblioteca utilizando la siguiente fórmula: nM = [(ng / 1.000) / BP * 660] x 10 ⁹ donde ng es la concentración de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.1 y BP es el pico tamaño de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.2.
2. Diluir la biblioteca para 2 nM (10 l en total) con agua libre de DNasa.
3. Combinar los 10 l de las bibliotecas diluidas 2 nM juntos en un tubo de 1,5 ml.
4. Añadir un volumen igual de control de espiga-en PhiX en el tubo de 1,5 ml.
5. Cargue la piscina en la concentración de 19:00 en una celda de flujo.
6. Secuenciar las bibliotecas utilizando un secuenciador de ciclo de gama emparejado 150 según el protocolo del fabricante.

Análisis 3. Datos

Nota: Un summario de los guiones bioinformáticos utilizados en esta sección se puede encontrar como un Código Archivo suplementario.

3.1) Alineación y control de calidad

1. Mapa secuenciación de extremo emparejado lee contra un IGH humana V, D y J de base de datos región descargado desde el sitio web de IMGT ^{11 utilizando} un algoritmo explosión de nucleótidos adaptada basada en 'blastn' disponible de NCBI con brecha pena de abierto de 2, penalización de extensión de 1, longitud de palabra de 7, y el umbral de e-valor de 10 ^-4. Deseche el par leer no asignar a la vez un IGH V y una región J.
2. Cuente los restantes pares de leer que tienen IGH V y J asignaciones para obtener las frecuencias de juego combinaciones VJ en todos leen pares obtenidos de la ejecución de secuenciación en la muestra. Cuente un par de lectura si se asigna a la vez un IGH V y J gen, y luego añadir su alelo a la cuenta correspondiente a la combinación VJ particular.
3. Clasifique los recuentos para cada región VDJ recombinado obtenido a partir de 3.1.2 de la altaest al más bajo. La región VDJ tiene el más alto recuento de lecturas se define como importante combinación reordenamiento.
4. Deseche secuencias alineadas que cubren menos del 35% de la importante reorganización de dominio identificado en 3.1.3.

3.2) SHM Perfil de Identificación

1. Cuente todos los patrones SHM través de las lecturas de la etapa 3.1.3. Definir cada patrón SHM como un subclon.
2. Cuente el número de los subclones que se corresponden a diferentes patrones únicos SHM, y el número de lecturas que se asigna a subclones individuales.

3.3) La representación gráfica de los resultados

1. Lleve a cabo el análisis filogenético de los subclones utilizando sus correspondientes patrones SHM utilizando un barrio método de unión del paquete R "mono", de acuerdo con el protocolo del fabricante. Calcula una matriz de distancia de las alineaciones distintas individuales para recrear la filogenia subclone arraigada a la secuencia de la línea germinal del VJ combinación en cuestión para cada conjunto de muestras pareadas.
2. Utilice la secuencia de nucleótidos de cada subclon como vector de caracteres y calcular la distancia cadena aproximada entre todos los subclones en los principales reordenamiento VJ tanto para el diagnóstico y las muestras de recaída correspondientes utilizando una medida de distancia Levenshtein donde matemáticamente la distancia entre dos alineaciones está dada por d _{x, y} (i, j), donde d _{x, y} (i, j) = 1 si i ≠ j y 0 de otro modo, y luego esta función resumen sobre la longitud de la cadena correspondiente a secuencias de nucleótidos i y j.
3. Gráficamente mostrar la matriz resultante de las distancias subclone y su población en subclone correspondientes en las siguientes dos maneras:
   1. Utilice el paquete R "MASA", de acuerdo con el protocolo del fabricante para aplicar escalamiento multidimensional a la matriz de distancia subclone y generar un principio de dos dimensiones coordenadas mapa, que luego se traza junto con el logaritmode los recuentos de subclonales como el radio del círculo.
   2. Construir un grafo no dirigido basado en la distancia Levenshtein, donde los vértices corresponden a cada subclon distinta que surge de la gran reordenamiento VJ.
      Nota: Si la distancia entre dos clones distintos es igual a uno entonces existe un borde entre estos dos vértices. Si la distancia es mayor que uno, entonces no hay ningún borde de conexión ellos.
   3. Trazar la gráfica de 3.3.3.2 utilizando la función tkplot en el paquete R "IGRAPH" con la disposición Kamada Kawai según el protocolo del fabricante. El radio de los vértices es proporcional a la raíz al cubo del número total de clones mapeadas a la misma y el sombreado utiliza una gama de color rojo y azul para indicar la proporción de clones que o bien pertenecen al diagnóstico (azul) o recaída (rojo) muestras .

3.4) La heterogeneidad (entropía) Medición

1. Examine los números y cuenta subclone delpatrones individuales de hipermutación somática que ocurren en el reordenamiento VJ importante para cada una adscrita conjunto de muestras.
2. Calcular la entropía y la entropía empírica empírica residual ajustado por el número de clones distintos en cada muestra utilizando la estimación entropía basado en histograma estándar.

Resultados

El procedimiento general de secuenciación VDJ (VDJ-SEC), incluyendo la extracción de ADN, recombina VDJ región de amplificación y purificación, la construcción de bibliotecas de secuenciación, se lee en el procesamiento y el análisis filogenético, está representado en la Figura 1. Rutinariamente de 5-200 g de ADN puede ser recuperada a partir de secciones de tejido sólido congelado o 0,5 a 20 g de ADN a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol. De...

Discusión

Debido al número casi ilimitado de iteraciones de información de la secuencia codificada por VDJ reordenamiento y SHM en el locus IGH de células B humanas, el examen de todo el repertorio IGH por alto rendimiento en alta secuenciación demostró ser una forma eficaz y completa para delinear clonal y las poblaciones de células B sub-clónicas. Además, esta estrategia se puede utilizar para estudiar la ruta de evolución clonal de desarrollo de células B tumor, remisión y recaída mediante la comparación de las ar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	89125-170	200 proof, for molecular biology
TE buffer	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
Proteinase K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix	Promega	U1515	10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer	Roche	11699105001	Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2	Life Technonogies	4311806	50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Corning (cellgro)	46-011-CM	6x1 L
50x TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 µg/µl
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µg/µl
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	50 columns
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Life Technologies	Q32854
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Magnetic stand	Life Technologies	4457858
Gel imaging system	Bio-Rad Laboratories	170-8370