Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Понимание клональность опухоли имеет решающее значение для понимания механизмов, участвующих в онкогенеза и прогрессирования заболевания. Кроме того, понимание клоновых изменения состава, которые происходят в опухоли в ответ на определенный микро-среды или лечения, может привести к разработке более совершенных и эффективных подходов к искоренению опухолевые клетки. Тем не менее, отслеживание опухолевые клоновых субпопуляций был сложным из-за отсутствия различимых маркеров. Чтобы решить эту проблему, А VDJ-след протокол был создан, чтобы проследить закономерности эволюции клоновых диффузного большой клеточной лимфомой (В-ККЛ) рецидива эксплуатации VDJ рекомбинации и соматической Гипермутационный (ГИМ), два уникальных особенностей клеточных лимфом.
В этом протоколе, следующего поколения секвенирования (NGS) библиотеки с индексирования потенциала были построены из усиливается переставить тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) VDJ области от пар первичной диагностики и рецидивов В-ККЛ SAMPле. В среднем более полумиллиона VDJ последовательности в образце были получены после секвенирования, которые содержат как VDJ перестройку и информацию SHM. Кроме того, индивидуальные трубопроводы биоинформатики были разработаны, чтобы полностью использовать информацию о последовательности для характеризации IgH-VDJ репертуара в этих образцах. Кроме того, трубопровод позволяет реконструировать и сравнение клонального архитектуры отдельных опухолей, что позволяет рассмотрение клонального неоднородности в диагностике опухолей и вычета клоновых линий развития между диагнозом и рецидивом опухоли пар. При применении этого анализа к нескольким парам диагноз рецидива, мы обнаружили ключевую доказательства, что несколько Отличительной опухолевые эволюционные модели может привести к ККЛ рецидива. Кроме того, этот подход может быть расширен в других клинических аспектов, таких, как определение минимальной остаточной болезни, мониторинга прогресса рецидивов и ответа на лечение, и исследование иммунного репертуараES в условиях не-лимфомы.
Рак является заболеванием клональный. С тридцать лет назад, когда Питер К. Ноуэлл предложил рака клонов эволюции модель 1, многие исследования пытались вскрыть клоновых населения в образцах опухолей и реконструировать клоновых расширения и эволюции моделей, которые лежат в основе процесса онкогенеза 2. Недавно вся-секвенирование генома позволило следователям сделать глубокий взгляд на клоновых неоднородности и эволюции 3,4. Однако из-за отсутствия разрешимыми маркерами во многих типах клеток, трудно сделать вывод о точной клонального архитектуру и эволюционный путь. К счастью, есть естественный клональность маркер зрелых В-клеток, из которых многие лимфоидных злокачественных новообразований, в том числе ДВККЛ, происходят. В ответ на антигенной стимуляции, каждый В-клеток могут образовывать единую производительную последовательность IgH VDJ путем присоединения V H (переменная), А D (разнообразие), и J Н (присоединение) сегмент вместе с большим бассейном этих сегментов. В этот прocess, небольшие порции исходной последовательности могут быть удалены и дополнительные не-шаблонный нуклеотиды могут быть добавлены, чтобы создать уникальный VDJ перегруппировку. Эта специфическая VDJ перестановка может быть унаследован по всей потомства этого B-клетки, поэтому пометки индивидуальный зрелые B-клетки и ее потомства 5. Кроме того, ШМ происходит на рекомбинантных последовательностей VDJ в последующем зародышевых центров (GC) реакции вводить дополнительные мутации для расширения пула антител и повышению аффинности антител 6. Поэтому, сравнение и сопоставление VDJ и SHM модели образцов лимфомы, которые прошли эти процессы, внутри опухоли неоднородность может быть очерчен и клональной путь эволюции болезни может быть выведена.
Ранее VDJ перегруппировки и ШМ могут быть идентифицированы с помощью ПЦР амплификации рекомбинантных регионы, клонирование продуктов ПЦР, а впоследствии метод сэнгера получить информацию о последовательности. Этот подход яS низкой пропускной и низкий выход, получения лишь очень небольшую часть всей рекомбинированного VDJ репертуара, и препятствуя характеристику общей представленности клоновых населения в данном образце. Модифицированный подход был создан генерации NGS секвенирования индексированные библиотеки из продуктов ПЦР VDJ и выполнения PE 2х150 п.о. последовательности, чтобы получить более чем полмиллиона рекомбинированные VDJ последовательности на образец. Кроме того, пользовательский трубопровод был разработан для выполнения контроля качества (КК), выравнивания фильтр VDJ последовательности считывает чтобы идентифицировать и перегруппировки ГМС каждого считанного и выполнять филогенетического анализа на клональной архитектуры каждого образца. Кроме того, новый подход был создан для дальнейшего характеризуют клоновых модели эволюции для образцов, собранных на разных стадиях заболевания.
Мы применили этот метод к образцам пациентов DLBCL. В-ККЛ является агрессивная форма неходжкинской лимфомы с частыми рецидива в срок до одного-гоIRD пациентов 7. ККЛ рецидивы обычно возникают рано, в течение 2 3 лет с момента первоначального диагноза, хотя некоторые происходят через 5 лет 8. Прогноз на рецидив пациентов плохое, только с 10% достижения 3-летняя выживаемость без прогрессирования в связи с ограниченными возможностями лечения. Это является основой для настоятельной необходимости новых подходов для лечения В-ККЛ рецидив 9,10. Тем не менее, молекулярные механизмы, связанные с ККЛ рецидива по-прежнему в значительной степени неизвестны. В частности, роль клонального неоднородности в диагностике и клонального эволюции в процессе развития рецидивов В-ККЛ в настоящее охарактеризованных, что делает его трудно определить точную и полезную биомаркеров для прогнозирования рецидива. Для решения этих вопросов, мы применили наш VDJ-секвенирования подход на нескольких пар подобранных пар проб ККЛ первичный диагноз рецидива. Два различных клоновых эволюционные сценарии рецидива появились из сравнения клоновых архитектур между диагнозом и рецидивом SAMPле, что предполагает несколько молекулярных механизмов могут быть вовлечены в ККЛ рецидива.
1. Усиление VDJ
1.1) выделения ДНК из образцов опухолевых
1.2) Оценка качества ДНК
1.3) VDJ ПЦР
1.3.1) Усиление рекомбинированных IgH VDJ сегмента от Рамочной области 1 (IgVHFR1)
1.3.2) Усиление рекомбинированных IgH VDJ сегмента от Рамочной области 2 (IgVHFR2)
1.4) Оптимизация VDJ ПЦР
2. VDJ Amplicon Библиотека Подготовка и секвенирование
2.1) Подготовка Библиотека
2.1.1) Конец ремонтно-
2.1.2) А-хвостохранилище
2.1.3) Адаптер Лигирование
2.1.4) Фрагменты ДНК Усиление
2.1.5) библиотека проверки
2.2) VDJ-ПЦР Библиотека Объединение и последовательности
Анализ данных 3.
Примечание: Суммичных из биоинформатики сценариев, используемых в этом разделе можно найти в дополнительном файле кода.
3.1) Выравнивание и КК
3.2) ГИМ профиля Идентификация
3.3) Графическое представление результатов
3.4) Неоднородность Энтропия) Измерение (
В целом процедура VDJ последовательности (VDJ-след), в том числе выделения ДНК, рекомбинации VDJ область амплификации и очистки, библиотека последовательности строительства, читает обработку и филогенетического анализа, представлена на рисунке 1. Регулярно 5-200 мкг ДНК может быт...
Из-за почти неограниченного количества итераций информации о последовательности кодируемого VDJ перегруппировки и СГМ в IGH локуса В-клеток человека, экспертиза всей IGH репертуар высокой пропускной глубокой последовательности оказался эффективным и всеобъемлющим образом, чтобы очерти...
The authors have no conflicts of interest to disclose.
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
MiSeq | Illumina | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены