Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Method Article
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Clonalité tumeur compréhension est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués dans la tumorigenèse et progression de la maladie. En outre, la compréhension des changements de composition de clones qui se produisent dans une tumeur en réponse à certains micro-environnement ou traitements peut conduire à la conception d'approches plus sophistiquées et efficaces pour éradiquer les cellules tumorales. Cependant, le suivi des tumeurs sous-populations clonales a été difficile en raison du manque de marqueurs distinguables. Pour résoudre ce problème, un protocole VDJ-seq a été créé pour suivre les tendances de l'évolution clonale de lymphome à grandes cellules B (LMNH-B) rechute diffuse en exploitant recombinaison VDJ et hypermutation somatique (SHM), deux caractéristiques uniques de lymphomes à cellules B.
Dans ce protocole, le séquençage de prochaine génération (NGS) bibliothèques ayant un potentiel d'indexation ont été construits à partir amplifié immunoglobuline réarrangé chaîne lourde (IgH) région VDJ de paires de diagnostic primaire et de rechute samp DLBCLles. En moyenne, plus de la moitié millions séquences VDJ par échantillon ont été obtenus après le séquençage, qui contiennent à la fois réarrangement VDJ et informations SHM. En outre, les pipelines bioinformatiques personnalisés ont été développés pour utiliser pleinement l'information de séquence pour la caractérisation des IgH-VDJ répertoire au sein de ces échantillons. En outre, le pipeline permet la reconstruction et la comparaison de l'architecture clonale de tumeurs individuelles, ce qui permet l'examen de l'hétérogénéité clonale dans les tumeurs de diagnostic et de déduction de motifs de l'évolution clonale entre le diagnostic de tumeurs et des paires de rechute. Lors de l'application de cette analyse à plusieurs paires diagnostic-rechute, nous avons découvert des preuves essentielles que de multiples tumeurs distinctif des modèles évolutifs pourraient conduire à DLBCL rechute. En outre, cette approche peut être étendu à d'autres aspects cliniques, tels que l'identification de la maladie résiduelle minimale, le suivi des progrès de la rechute et la réponse au traitement, et l'enquête de repertoire immunitairees dans des contextes non-lymphome.
Le cancer est une maladie clonale. Depuis, il ya trente ans, lorsque Peter C. Nowell a proposé le cancer clonale modèle d'évolution 1, de nombreuses études ont tenté de disséquer populations clonales dans les échantillons de tumeurs et de reconstruire les modèles d'expansion et l'évolution clonale qui sous-tendent le processus de tumorigenèse 2. Récemment, le séquençage du génome entier a permis aux enquêteurs de prendre un regard profond sur l'hétérogénéité et l'évolution clonale 3,4. Toutefois, en raison de l'absence de marqueurs traitables dans de nombreux types de cellules, il est difficile d'en déduire l'architecture clonale chemin précis et évolutif. Heureusement, il est un marqueur de clonalité naturelle dans les cellules B matures à partir de laquelle de nombreuses tumeurs malignes lymphoïdes, y compris DLBCL, sont originaires. En réponse à la stimulation antigénique, chaque cellule B peut former une séquence productive seule IgH VDJ en rejoignant un V H (variable), un D (diversité), et un J H (rejoindre) le segment ensemble à partir d'une grande piscine de ces segments. Au cours de cette prPROCESSUS, de petites portions de la séquence d'origine peuvent être supprimés et les nucleotides non basés sur des modèles supplémentaires peuvent être ajoutées pour créer un réarrangement VDJ unique. Ce réarrangement VDJ spécifique peut être hérité dans toute la descendance de cette cellule B, marquage donc lymphocytes B matures individuelle et sa progéniture 5. En outre, SHM se produit sur les séquences VDJ recombinés dans le centre germinatif (GC) réaction ultérieure pour introduire des mutations supplémentaires pour l'expansion de la piscine de l'anticorps et la mise en valeur des anticorps d'affinité 6. Par conséquent, en comparant et contrastant VDJ SHM et des motifs d'échantillons de lymphome qui ont subi ces procédés, l'hétérogénéité intra-tumorale pourrait être délimitée et voie d'évolution clonale de la maladie peut être déduite.
Auparavant, le réarrangement VDJ et SHM pourraient être identifiés par amplification par PCR les régions recombinés, le clonage des produits de PCR, puis séquençage de Sanger pour obtenir des informations de séquence. Cette approche is à faible débit et faible rendement, récupérer seulement une très petite partie de l'ensemble du répertoire de VDJ recombiné, et d'entraver la caractérisation de la représentation globale de la population clonale dans un échantillon donné. Une approche modifiée a été créée en générant END indexés bibliothèques de séquençage de produits PCR et VDJ effectuer PE séquençage 2x150 pb pour obtenir plus d'un demi-million de séquences VDJ recombinées par échantillon. En outre, un pipeline personnalisé a été développé pour effectuer un contrôle de qualité (QC), aligner, séquençage filtre VDJ lit d'identifier réarrangements et SHM de chaque lecture, et effectuer une analyse phylogénétique sur l'architecture clonale de chaque échantillon. En outre, une nouvelle approche a été établi afin de mieux caractériser les modèles de l'évolution clonale pour les échantillons prélevés à divers stades de la maladie.
Nous avons appliqué cette technique à des échantillons de patients DLBCL. LMNH-B est une forme agressive de lymphome non hodgkinien à la rechute fréquente dans près d'un eIRD des patients 7. Rechutes surviennent normalement DLBCL début, dans les 2 à 3 ans suivant le diagnostic initial, bien que certains ne se produisent après 5 ans 8. Pronostic pour les patients en rechute est faible, avec seulement 10% la réalisation de trois années de survie sans progression due à des options de traitement limitées. Ceci est la base de la nécessité urgente de nouvelles approches pour traiter DLBCL rechute 9,10. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la rechute LMNH-B sont encore largement inconnu. En particulier, le rôle de l'hétérogénéité clonale au moment du diagnostic et l'évolution clonale au cours du développement de rechute LMNH-B sont actuellement non caractérisé, ce qui rend difficile de définir un biomarqueur précis et plus utile pour prédire une rechute. Pour répondre à ces questions, nous avons appliqué notre approche VDJ-séquençage sur plusieurs paires de paires d'échantillons de diagnostic LMNH-rechute primaire appariés. Deux scénarios évolutifs clonales distinctes de rechute ont émergé de la comparaison des architectures clonales entre le diagnostic et le samp rechuteles mécanismes moléculaires qui suggère multiples peut être impliqué dans DLBCL rechute.
1. Amplification VDJ
1.1) Extraction d'ADN des échantillons de tumeurs
1.2) d'évaluation de la qualité de l'ADN
1.3) VDJ PCR
1.3.1) Amplify recombiné IgH VDJ segment de la Région cadre 1 (IgVHFR1)
1.3.2) Amplify recombiné IgH VDJ segment de cadre Région 2 (IgVHFR2)
1.4) Optimiser VDJ PCR
2. VDJ Amplicon Bibliothèque Préparation et séquençage
2.1) Préparation Bibliothèque
2.1.1) Fin de réparation
2.1.2) A-tailing
2.1.3) Adaptateur ligature
2.1.4) Fragments amplifier l'ADN
2.1.5) Bibliothèque de validation
2.2) VDJ-PCR et séquençage Bibliothèque Pooling
Analyse des données 3.
Remarque: Un summAry des scripts de bioinformatique utilisés dans cette section peut être trouvé comme un fichier de code supplémentaire.
3.1) Alignement et QC
3.2) Profil SHM identification
3.3) représentation graphique des résultats
3.4) Hétérogénéité (entropie) Mesure
La procédure globale de séquençage VDJ (VDJ-seq), y compris l'extraction d'ADN, recombiné VDJ région d'amplification et de purification, la construction de la bibliothèque de séquençage, lit le traitement et l'analyse phylogénétique, est représenté sur la figure 1. Régulièrement 5-200 pg d'ADN peut être extrait à partir de coupes de tissus congelés ou solide 0,5-20 ug d'ADN à partir de coupes de tissus inclus en paraffine fixés au formol. En fo...
En raison du nombre pratiquement illimité d'itérations de l'information de séquence codée par réarrangement VDJ et SHM au locus IGH des cellules B humaines, l'examen de l'ensemble IGH répertoire en haut débit profond séquençage avéré être un moyen efficace et complet pour délimiter clonale et les populations de cellules B sous-clones. De plus, cette stratégie peut être utilisée pour étudier la trajectoire de l'évolution clonale de développement des cellules B de la tumeur, la rémi...
The authors have no conflicts of interest to disclose.
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
MiSeq | Illumina | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon