VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

Riepilogo

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Abstract

La comprensione clonalità tumore è fondamentale per comprendere i meccanismi coinvolti nella tumorigenesi e la progressione della malattia. Inoltre, comprendere i cambiamenti composizione clonali che si verificano all'interno di un tumore in risposta a determinati microambiente o trattamenti possono portare alla progettazione di approcci più sofisticati ed efficaci per eliminare le cellule tumorali. Tuttavia, tumori clonali inseguimento sottopopolazioni è stato difficile a causa della mancanza di marcatori distinguibili. Per risolvere questo problema, un protocollo VDJ-ss è stato creato per tracciare i modelli di evoluzione clonali di linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) recidiva sfruttando VDJ ricombinazione e mutazione somatica (SHM), due caratteristiche uniche di linfomi a cellule B.

In questo protocollo, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) librerie con potenziale di indicizzazione sono stati costruiti da amplificato immunoglobuline riarrangiato catena pesante (IgH) regione VDJ da coppie di diagnosi primaria e la recidiva DLBCL samples. In media più di mezzo milione di sequenze VDJ per campione sono stati ottenuti dopo il sequenziamento, che contengono sia VDJ riassetto e informazioni SHM. Inoltre, le condutture bioinformatica personalizzati sono stati sviluppati per utilizzare pienamente le informazioni di sequenza per la caratterizzazione di IgH-VDJ repertorio all'interno di questi campioni. Inoltre, il gasdotto permette la ricostruzione e confronto dell'architettura clonale dei tumori individuali, che consente l'esame della eterogeneità clonale nei tumori diagnosi e la deduzione di modelli di evoluzione clonali fra la diagnosi e le coppie di recidiva del tumore. Quando si applica questa analisi a diverse coppie di diagnosi-recidiva, abbiamo scoperto le prove chiave che più tumorali distintivo modelli evolutivi potrebbero portare a DLBCL ricaduta. Inoltre, questo approccio può essere esteso ad altri aspetti clinici, come l'identificazione della malattia minima residua, monitorare i progressi recidiva e la risposta al trattamento, e ricerca di repertorio immunitarioes in contesti non linfoma.

Introduzione

Il cancro è una malattia clonale. Da trenta anni fa, quando Peter C. Nowell ha proposto il cancro clonale evoluzione del modello ^1, molti studi hanno cercato di sezionare popolazioni clonali in campioni di tumore e ricostruire espansione ed evoluzione modelli clonali che sono alla base del processo di tumorigenesi ^2. Recentemente, tutto il sequenziamento del genoma ha permesso agli investigatori di dare uno sguardo profondo alla eterogeneità clonale e l'evoluzione ^3,4. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori trattabili in molti tipi cellulari, è difficile dedurre la precisa architettura clonale e percorso evolutivo. Fortunatamente c'è un marcatore clonalità naturale in cellule B mature da cui molti tumori maligni linfoidi, tra cui DLBCL, sono originari. In risposta alla stimolazione antigenica, ogni B-cella può formare una singola produttivo sequenza IgH VDJ unendo un V _H (variabile), un D (diversità), e un J _H (giunzione) segmento insieme da una grande piscina di questi segmenti. Durante questo process, piccole porzioni di sequenza originale possono essere cancellati e ulteriori nucleotidi non-templated possono essere aggiunti per creare un riarrangiamento VDJ unico. Questa riorganizzazione VDJ specifico può essere ereditata in tutta la progenie di questo B-cellule, quindi la codifica B-cellula matura individuale e la sua prole ^5. Inoltre, SHM verifica sulle sequenze VDJ ricombinati nella reazione successiva centro germinativo (GC) per introdurre mutazioni aggiuntive per l'espansione del pool di anticorpi e la valorizzazione di anticorpi affinità ^6. Pertanto, confrontando e contrastanti VDJ e SHM modelli di linfoma campioni che hanno subito questi processi, intra-tumorale eterogeneità potrebbe essere delineato e clonale percorso evolutivo della malattia può essere desunta.

In precedenza, VDJ riassetto e SHM potrebbero essere identificati mediante PCR amplificando le regioni ricombinati, clonazione dei prodotti di PCR, e successivamente sequenziamento Sanger per ottenere informazioni sulla sequenza. Questo mi avvicinos basso throughput e bassa resa, il recupero di solo una piccola parte di tutto il repertorio VDJ ricombinato, e ostacolando la caratterizzazione della rappresentazione complessiva della popolazione clonale in un dato campione. Un approccio modificato è stato creato mediante la generazione di NGS indicizzati librerie sequenziamento dai prodotti VDJ PCR e l'esecuzione di PE 2x150 bp sequenziamento di ottenere più di mezzo milione di sequenze VDJ ricombinate per campione. Inoltre, una pipeline personalizzata è stato sviluppato per eseguire il controllo di qualità (QC), allineare, filtro VDJ sequenziamento legge per identificare riarrangiamenti e SHMS di ogni lettura, ed eseguire analisi filogenetica sull'architettura clonale di ogni campione. Inoltre, è stato stabilito un nuovo approccio per caratterizzare ulteriormente i modelli di evoluzione clonali per i campioni raccolti a vari stadi della malattia.

Abbiamo applicato questa tecnica per i campioni dei pazienti DLBCL. DLBCL è una forma aggressiva di linfoma non-Hodgkin con frequenti recidive in un massimo di un thIRD dei pazienti ^7. Ricadute DLBCL normalmente si verificano presto, entro 2 o 3 anni dalla diagnosi iniziale, anche se alcuni si verificano dopo 5 anni ^8. La prognosi per i pazienti con recidiva è scarsa, con solo il 10% che raggiungeva 3 anni la sopravvivenza libera da progressione a causa di limitate opzioni di trattamento. Questa è la base per l'urgente necessità di nuovi approcci per il trattamento di DLBCL ricaduta ^9,10. Tuttavia, i meccanismi molecolari associati con DLBCL recidive sono ancora in gran parte sconosciute. In particolare, il ruolo di eterogeneità clonale al momento della diagnosi e l'evoluzione clonale durante lo sviluppo ricaduta DLBCL sono attualmente indefinita, il che rende difficile la definizione di un biomarcatore accurate e utili per prevedere le ricadute. Per rispondere a queste domande, abbiamo applicato il nostro approccio VDJ-sequenza su più coppie di corrispondenti primario diagnosi-recidiva coppie di campioni DLBCL. Due distinti scenari evolutivi clonali di ricaduta emerse dal confronto delle architetture clonali tra la diagnosi e la samp ricadutales che suggerisce molteplici meccanismi molecolari può essere coinvolta in DLBCL ricaduta.

Protocollo

1. VDJ Amplificazione

1.1) Estrazione del DNA da campioni tumorali

1. Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di congelati PTOM incorporati tessuti normali e maligni.
   1. Digest 10-30 sezioni sottili di tessuto incorporato tagliato da un microtomo criostato in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M _Na 2 EDTA) con Proteinasi K (0,5 mg / ml, concentrazione finale ) e 0,625% SDS in una provetta da centrifuga da 15 ml in un bagno d'acqua per una notte a 37 °.
   2. Aggiungere 1 ml di NaCl satura (5 M) alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi.
   3. Centrifugare a 1100 xg per 15 min a temperatura ambiente.
   4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere due volumi di 100% di etanolo.
   5. Miscelare invertendo la provetta 6-8 volte. Centrifugare a 5.000 xg per 60 min a 4 ° C per raccogliere il DNA precipitato.
   6. Lavare il pellet di DNA due volte con il 70% di etanolo. Centrifuge a 5.000 xg per 15 min ogni tempo per raccogliere il pellet.
   7. Sciogliere DNA in 100-400 microlitri tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore overnight stanza. La resa del DNA è 5 a 200 mg (concentrazione finale tra 50-500 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto
2. Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di, incorporato (FFPE) tessuto normale o maligni paraffinato fissati in formalina.
   1. Incubare sezioni di paraffina in 1 ml due volte xilene a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a Sparaffinare. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Incubare sezioni in 1 ml di etanolo al 100% per due volte a temperatura ambiente, 10 min ogni volta per rimuovere residui xileni. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. La paraffina è completamente sciolto a questo punto e solo la sezione di tessuto è restanti.
   3. Asciugare sezioni in camera temperature per 10-15 minuti.
   4. Fare un / soluzione di 0,5 mg ml proteinasi K con 1x tampone PCR (diluito da 10x tampone PCR con acqua priva di nucleasi). Aggiungere la soluzione proteinasi K per i campioni in un volume finale di 50-100 microlitri e incubare una notte a 37 ° C.
   5. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 minuti per inattivare proteinasi K.
      Nota: In questo passaggio, il DNA campione viene sciolto in tampone PCR e può essere utilizzato nei passaggi 1.2 e 1.3 direttamente. La resa del DNA è da 0,5 a 20 mg (concentrazione finale tra 10-200 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto.

1.2) valutazione della qualità del DNA

1. Mescolare 0.25 microlitri DNA polimerasi Taq con 45 ml di master mix dal kit scala commerciale in un tubo di PCR.
2. Aggiungere 5 microlitri DNA preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 nella provetta PCR e mescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte.
3. Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per7 min; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C.
4. Preparare un gel di agarosio 2% in TBE (Tris / borato / EDTA).
5. Mescolare 20 microlitri PCR con 4 ml 6x colorante di caricamento, e caricare su un gel di agarosio 2%.
6. Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di gel immaginare. Nota: i campioni che producono 5 prodotti PCR con dimensioni di 100, 200, 300, 400, e 600 bp sarà continuato a generare ampliconi VDJ.
   ATTENZIONE: etidio bromuro è un potente mutageno. Si prega di trattare con estrema cautela, indossando indumenti protettivi, cioè guanti, e smaltire in contenitori specifici per le linee guida dell'istituzione.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione quadro 1 (IgVHFR1)

1. Mescolare 45 microlitri master mix dall'etichetta tuboEd come "Mix 2" di una somatica IGH ipermutazione test per il rilevamento del gel kit commerciale, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e il DNA del campione 5 ml preparata da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR.
2. Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C.
3. Risolvere l'intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi.
4. Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di imaging gel. Un amplicon monoclonale è previsto con la gamma di dimensioni di 310-380 bp.
5. Accise la porzione gel contenente l'amplicone monoclonale tra 310-380 bp.
6. Purificare DNA da gel asportato utilizzando un kit di Gel Extraction standard secondo il protocollo del produttore. Nota: per i campioni che i frammenti FR1 potrebbero essere ottenuti, non c'è bisogno di ampiamente IGVHFR2 e IgVHFR3.

1.3.2) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione Framework 2 (IgVHFR2)

1. Mescolare 45 microlitri master mix dal tubo etichettato come "Tube B" di un gene IGH commerciale clonalità test per kit di rilevamento del gel, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e campione di DNA 5 microlitri preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR .
2. Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; quindi 72 ° C per 10 minuti e lasciare a 15 ° C.
3. Risolvere l'intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi.
4. Visualizza prodotto di PCR (s) di 0,5 mg / ml colorazione con etidio bromuro. Un amplicone monoclonale può essere osservato all'interno della gamma di dimensioni di 250-295 bp.
5. Accise la porzione gel contenente l'amplicone monoclonale tra 250-295 bp.
6. Purificare DNA da gel asportato utilizzando un estratto di normale Gelion Kit secondo il protocollo del produttore.

1.4) Ottimizzare VDJ PCR

1. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR modificate per amplificare IgVHFR1 e IgVHFR2 usando DNA non ottimale: 95 ° C per 7 minuti, 40 cicli di 95 ° C per 60 sec, 60 ° C per 60 sec e 72 ° C per 90 sec, estensione finale a 72 ° C per 10 min.

2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparazione e Sequencing

2.1) Biblioteca Preparazione

2.1.1) Fine-riparazione

1. Trasferire VDJ prodotto di PCR da 1.3 in un tubo di PCR e aggiungere Risospensione tampone da campione di DNA kit di preparazione per portare il volume a 60 ml.
2. Aggiungere 40 ml di Fine Riparazione Mix da campione di DNA Kit di preparazione e mescolare accuratamente.
3. Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C.
4. Mescolare 136 ml sfere magnetiche e 24 microlitri PCR gacqua rade primo di una provetta da 1,5 ml, quindi trasferire l'intera reazione finale di riparazione da 2.1.1.3 nel tubo 1,5 ml e mescolare bene con la soluzione perline.
5. Porre le provette su un supporto magnetico per 2 minuti per consentire la separazione delle sfere dalla soluzione. Aspirare il surnatante, e lavare le perline con l'80% fresco preparato EtOH due volte mentre il tubo è sul supporto magnetico.
6. Aspirare la soluzione di etanolo completamente e consentire alle sfere di asciugare all'aria per 15 min a temperatura ambiente per 15 min.
7. Prendete il tubo dal supporto e risospendere magnetici perle a 17,5 ml Resuspension Buffer.
8. Porre le provette di nuovo sul supporto magnetico per 2 minuti a perline separati dal Resuspension Buffer. Rimuovere la Resuspension Buffer (prodotto finale di riparazione è risospeso nel buffer Resuspension ora) in una provetta PCR clean.

2.1.2) A-tailing

1. Aggiungere 12,5 ml mix A-tailing nel tubo di PCR contenente prodotto end-riparazione e mescolare accuratamente.
2. Incubare la provetta PCR a 37 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (37 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C.

2.1.3) Adattatore legatura

1. Aggiungere 2,5 microlitri Risospensione tampone, 2,5 microlitri legatura Mix, e 2,5 microlitri DNA adattatore Indice nella reazione A-tailing.
2. Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minl in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C.
3. Aggiungere 5 ml di arresto legatura tampone in ogni reazione e mescolare accuratamente.
4. Mescolare 42,5 ml ben mescolato sfere magnetiche per pulire la reazione seguente procedura 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Aggiungere 50 microlitri Risospensione tampone per eluire il prodotto adattatore ligato.
5. Pulire il prodotto adattatore legatura per la seconda volta con 50 microlitri ben mescolato perline AMPure XP, ed eluire il prodotto in 25 microlitri Risospensione tampone in una provetta pulita PCR.

2.1.4) frammenti di DNA Amplify

1. Aggiungere 5 microlitri PCR Primer Cocktail e 25 microlitri PCR Master Mix nella provetta PCR prodotto contenente adattatore-legatura e mescolare accuratamente.
2. Eseguire amplificazione in un termociclatore pre-programmato con le seguenti condizioni: 98 ° C per 30 sec; 10 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; poi 72 ° C per 5 minuti e tenere a 10 ° C.
3. Pulire la reazione con 50 sfere magnetiche microlitri ben mescolato, ed eluire il prodotto finale in 30 microlitri Resuspension Buffer.

2.1.5) Biblioteca convalida

1. Quantificare il prodotto finale con un fluorimetro utilizzando il protocollo del produttore. Concentrazione biblioteca finale è compresa tra 2,5 e 20 ng / ml.
2. Valutare la qualità del prodotto finale utilizzando uno strumento di analisi con DNA chip alta sensibilità secondo il protocollo del produttore. Aspettatevi una singola banda con il formato previsto per entrambi IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Tidimensioni xpected del prodotto biblioteca è uguale alla dimensione del VDJ amplicone originale più le dimensioni degli adattatori (~ 125 bp).

2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing

1. Calcolare la molarità di ciascuna frazione libreria utilizzando la seguente formula: nM = [(ng / 1000) / * 660 bp] x 10 ⁹ dove ng è la concentrazione della biblioteca VDJ-PCR misurata nel passaggio 2.1.5.1 e bp è il picco dimensione della libreria VDJ-PCR misurata al punto 2.1.5.2.
2. Diluire la libreria di 2 Nm (totale 10 ml) con acqua priva di DNasi.
3. Combinare i 10 ml di 2 librerie nM insieme diluito in una provetta da 1,5 ml.
4. Aggiungere un volume uguale di Phix controllo spike-in nel tubo 1,5 ml.
5. Caricare la piscina a una concentrazione 07:00 su una cella a flusso.
6. Sequenziare le librerie utilizzando un sequencer ciclo accoppiato-end 150 secondo il protocollo del produttore.

Analisi 3. Dati

Nota: Un summary degli script bioinformatica utilizzati in questa sezione si trova un file Codice supplementare.

3.1) Allineamento e QC

1. Mappa accoppiato-end sequenziamento legge contro un IGH V umana, D e J regione del database scaricato dal sito IMGT ¹¹ utilizzando un algoritmo esplosione nucleotide adattato in base al 'BLASTN' disponibile da NCBI con divario penale aperto di 2, divario penale estensione di 1, lunghezza della parola di 7, e la soglia e-valore di 10 ^-4. Eliminare la coppia lettura non mappare sia l'IGH V e una regione J.
2. Contare le restanti coppie di lettura che hanno IGH V e J mappature per ottenere le frequenze di corrispondenza combinazioni VJ in tutti leggere coppie ottenuti dal sequenziamento corsa sul campione. Count una lettura coppia se è mappato sia l'IGH V e J gene, e quindi aggiungere il suo allele al conteggio corrispondente per la particolare combinazione VJ.
3. Classificare i conteggi per ogni regione VDJ ricombinato ottenuto dalla 3.1.2 dall'altoest al più basso. La regione VDJ ha la più alta legge conteggio viene definito come combinazione riarrangiamento principale.
4. Scartare sequenze allineate che coprono meno del 35% del dominio principale riarrangiamento identificato nel 3.1.3.

3.2) SHM profilo di identificazione

1. Contare tutti i modelli SHM attraverso la legge dal punto 3.1.3. Definire ogni modello SHM come sottoclone.
2. Contare il numero dei subcloni che sono corrispondenti a differenti modelli unici SHM, e il numero di letture che vengono mappati alle singole sottocloni.

3.3) Rappresentazione grafica dei risultati

1. Eseguire l'analisi filogenetica sulle subcloni utilizzando i loro corrispondenti modelli SHM utilizzando un quartiere metodo dal pacchetto R "ape" giunzione secondo il protocollo del produttore. Calcolare una matrice di distanza dai singoli schieramenti distinti per ricreare la filogenesi subclone radicato alla sequenza germinale del VJ combinazione in questione per ogni set di campioni appaiati.
2. Utilizzare la sequenza nucleotidica di ogni subclone come carattere vettoriale e calcolare la distanza approssimativa corda tra tutti i subcloni in maggiore riarrangiamento VJ sia per la diagnosi e campioni ricaduta corrispondenti utilizzando una misura di distanza Levenshtein dove matematicamente la distanza tra due allineamenti è dato da d _{x, y} (i, j), dove d _{x, y} (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 altrimenti, e poi riassumere questa funzione per tutta la lunghezza della stringa corrispondente al nucleotide sequenze ie j.
3. Graficamente visualizzare la matrice risultante delle distanze e dei loro corrispondenti subclone conteggi subclone nei seguenti due modi:
   1. Utilizzare pacchetto R "massa", secondo il protocollo del produttore di applicare scaling multidimensionale alla matrice distanza subclone e generare un principio bidimensionale coordinate della mappa, che viene poi tracciata con il logaritmodi conteggi subclonal come il raggio del cerchio.
   2. Costruire un grafo non orientato in base alla distanza Levenshtein, dove i vertici corrispondono a ogni subclone distinta derivante dal maggiore riarrangiamento VJ.
      Nota: Se la distanza tra due cloni distinti è uguale a uno allora esiste un arco tra i due vertici. Se la distanza è maggiore di uno, allora vi è un fronte che li collega.
   3. Tracciare il grafico del 3.3.3.2 usando la funzione tkplot nel pacchetto R "IGRAPH" con il layout Kamada Kawai secondo il protocollo del produttore. Il raggio dei vertici è proporzionale alla radice al cubo del numero totale di cloni mappati ad esso e l'ombreggiatura utilizza un intervallo rosso e blu per indicare la proporzione di cloni che o appartengono alla diagnosi (blu) o recidiva (rosso) campioni .

3.4) eterogeneità (Entropy) Misura

1. Esaminare i numeri e conteggi sottoclone delmodelli individuali di mutazione somatica che si verificano nella principale riarrangiamento VJ per ogni set di campioni appaiati.
2. Calcolare l'entropia empirica e l'entropia empirica residuo corretto per il numero di cloni distinti in ciascun campione usando la stima entropia basato istogramma standard.

Risultati

La procedura complessiva di VDJ sequenziamento (VDJ-seq), compresa l'estrazione del DNA, ricombinato VDJ regione amplificazione e purificazione, la costruzione della libreria sequenziamento, legge elaborazione e analisi filogenetica, è rappresentato in figura 1. Ordinariamente 5-200 mg DNA può essere recuperato da sezioni di tessuto solido congelato o 0,5-20 mg DNA da sezioni di tessuto incluso in paraffina fissati in formalina. A seconda della qualità, modello riarrangiamento e SHM grado di sing...

Discussione

A causa del numero quasi illimitato di iterazioni di informazioni sequenza codificata da VDJ riarrangiamento e SHM al locus IGH delle cellule B umane, l'esame di tutto il repertorio IGH da high-throughput deep-sequenziamento ha dimostrato di essere un modo efficace e completo per delineare clonale e le popolazioni di cellule B sub-clonali. Inoltre, questa strategia può essere usato per studiare il percorso evoluzione clonale di sviluppo delle cellule B tumorali, remissione e ricaduta confrontando le architetture cl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	89125-170	200 proof, for molecular biology
TE buffer	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA
Xylenes	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
Proteinase K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix	Promega	U1515	10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer	Roche	11699105001	Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2	Life Technonogies	4311806	50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Corning (cellgro)	46-011-CM	6x1 L
50X TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 µg/µl
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µg/µl
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	50 columns
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Life Technologies	Q32854
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Magnetic stand	Life Technologies	4457858
Gel imaging system	Bio-Rad Laboratories	170-8370