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  • Divulgaciones
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Resumen

Se demuestra un nuevo método de detección de drogas para determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas de fármacos a una proteína diana mediante la formación de nanoclusters fluorescentes oro (Au CN) dentro de la proteína cargada con fármaco, basados ​​en la señal diferencial de fluorescencia emitida por el Au NCs. Proteínas tales como albúmina de suero de albúmina humana (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) se seleccionan como las proteínas modelo. Cuatro pequeños fármacos moleculares (por ejemplo, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida) de diferentes afinidades de unión a las proteínas de albúmina se ponen a prueba. Se encontró que la tasa de formación de Au NCs fluorescentes dentro de la proteína albúmina cargadas de fármaco en condiciones desnaturalizantes (es decir, 60 ° C o en presencia de urea) es más lento que el formado en la proteína prístina (sin drogas). Por otra parte, la intensidad fluorescente de la CN como formado se encontró que se correlaciona inversamente con las afinidades de unión de estos fármacos a las proteínas de albúmina. Particularmente,cuanto mayor es la afinidad de unión a proteína de drogas, más lenta será la velocidad de formación de Au CN, y por lo tanto se observa una intensidad de fluorescencia inferior de la resultante Au NCs. La intensidad de fluorescencia de la resultante Au NCs por lo tanto, proporciona una medida sencilla de la fuerza de unión relativa de los diferentes fármacos ensayados. Este método también es extensible para medir la constante de unión específica de proteína-fármaco (K D) simplemente variando el contenido de fármaco precargado en la proteína a una concentración de proteína fija. Los resultados medidos coinciden bien con los valores obtenidos utilizando otros métodos de prestigio pero más complicados.

Introducción

Albúminas séricas tales como albúmina de suero humano (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) son la proteína más abundante en el plasma y juegan un papel vital en el mantenimiento de la presión osmótica del compartimiento de sangre. También son reconocidos como proteínas portadoras para las pequeñas moléculas de baja solubilidad en agua, tales como esteroides, ácidos grasos, hormonas tiroideas, y una amplia variedad de fármacos. La propiedad de unión (por ejemplo, sitios de unión, afinidad o fuerza de unión) de estas moléculas a suero albúminas forma un tema importante en la farmacocinética. 1-4 Varios métodos analíticos se han desarrollado para estudiar las propiedades de unión de diferentes fármacos al suero albúminas, tales como cristalografía de rayos X, 5,6 resonancia magnética nuclear (RMN), 7-11 y resonancia de plasmón superficial (SPR), 12,13 etc. Sin embargo, estos métodos están limitados ya sea por un proceso de análisis tedioso y requiere mucho tiempo (por ejemplo, el crecimiento del cristal único para Crystallo de rayos Xestudio gráfico), requerimiento de equipo especializado y caro (SPR), o en necesidad de etiquetado de isótopos costosa (RMN) para la detección. Por tanto, es altamente deseable desarrollar métodos alternativos para la detección de drogas molecular pequeña de una manera rápida y directa, y rentable.

Nanoclusters oro (Au CN) son un tipo especial de nanomaterial, que contienen varias decenas de átomos de metal con tamaños menores de 2 nm. 14-17 Ellos han atraído amplios intereses de investigación debido a su estructura electrónica discreta y dependiente del tamaño, 18, 19 y molecular como absorciones y emisiones. 20-23 Tales propiedades materiales únicos, en particular, la fuerte fluorescencia, han encontrado diversas aplicaciones tales como detección y proyección de imagen en los sistemas biológicos. ultrapequeño de 24-32 fluorescente Au NCs se puede sintetizar utilizando proteínas funcionales, tales como albúminas séricas, como plantilla. 33 En un típico síntesis de proteínas con plantilla de Au NCs, una cierta cantidad de sales de Au están encapsulados dentro de la primera proteína y posteriormente reducida por la propia proteína. La capacidad reductora de la proteína se atribuye a Constituyente residuos de aminoácidos funcionales (por ejemplo, tirosina) que se pueden activar mediante el aumento del pH de la solución a alcalino. Despliegue de la estructura de la proteína se considera como un paso fundamental para la formación de Au CN. Esto es porque en una proteína desplegada, los grupos funcionales más reductores pueden estar expuestos a las sales de Au encapsulados. Desplegamiento de la proteína se puede lograr mediante tratamiento térmico o la exposición a agentes desnaturalizantes. La introducción de pequeños drogas moleculares también puede afectar el proceso de desarrollo, es decir, la modificación de la temperatura de desnaturalización punto medio y la entalpía de despliegue. 34,35 El efecto de todos estos factores, a su vez, puede ser reflejada por la cinética de formación de fluorescente Au CN y se manifiesta en la intensidad de fluorescencia de las resultantes Au CN. 36

e_content "> Este video demuestra el método de cribado de fármacos mediante la síntesis de Au NCs en las proteínas de albúmina cargadas con fármaco a una temperatura más alta (60 ° C) o en presencia de agentes desnaturalizantes (por ejemplo, urea). La intensidad de fluorescencia de resultante Au NCs es la lectura de la señal. En primer lugar, Au NCs se sintetizan en HSA y BSA plantillas tratadas a 60 ° C o en presencia de urea para mostrar cómo desplegamiento de la proteína (inducida por tratamiento térmico o desnaturalizantes) afecta a la cinética de formación de Au NCs. En segundo lugar, Au NCs se sintetizan en las plantillas de proteínas precargado con diferentes fármacos, y el efecto de carga de fármaco en las intensidades de fluorescencia relativas de resultante Au NCs se estudia, que proporcionan la medida de la fuerza de unión relativa. Finalmente, el protocolo de cribado Au NC-fármaco se modifica para medición cuantitativa de la proteína-fármaco constante de unión (K D) mediante la variación del contenido de fármaco precargado en la proteína de una concentración fija.

Protocolo

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad (FDS) de todos los productos químicos implicados antes de su uso. El experimento de detección de drogas implica la síntesis y la manipulación de los nanomateriales, que puede tener riesgos adicionales en comparación con su contraparte granel. Por favor, garantizar todas las medidas de control necesarias para practicar durante todo el experimento, incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora de gases) y equipo de protección personal (PPE, por ejemplo, los pantalones de la longitud de seguridad, zapatos cerrados, guantes resistentes a productos químicos y gafas protectoras).

1. Preparación de los reactivos químicos para Pruebas De Drogas

  1. Los precursores para la síntesis de Au CN
    1. Disolver 30 mg de cloruro de solución de oro (III) (99,99% base metales traza, 30 wt.% En HCl diluido) en 6,9 ml de agua ultrapura para preparar 15 mM de oro (III) solución de cloruro. Precaución: solución de cloruro de oro es corrosivo e irritante. Use PPE adecuado para evitar el contacto directo con los ojos y la piel.
    2. Dissolve 74 mg de HSA o BSA en 1 ml de agua ultrapura para preparar 74 mg / ml de solución de proteína de valores.
  2. Soluciones de drogas
    1. Disolver la cantidad deseada de fármaco, por ejemplo, 1,9 mg para (a) el ibuprofeno, 2,8 mg de (b) la warfarina, 2,3 mg de (c) la fenitoína, y 1,5 mg de (d) sulfanilamida en 20 l de DMSO para preparar 450 mM de soluciones de drogas de las acciones.
      Nota: se selecciona DMSO como disolvente ya que estos medicamentos son hidrófobos y tienen una mala solubilidad en agua.
  3. Otros reactivos
    1. Disolver 600 mg de gránulos de NaOH en 10 ml de agua ultrapura para preparar 1,5 M de solución de NaOH. Disolver 2,4 g de urea en 2 ml de agua ultrapura para preparar 20 M de solución de urea.

2. Síntesis de Proteína-Templated Au CN

  1. Con plantilla-HSA Au CN (HSA-Au CN)
    1. Coloque dos viales de vidrio, conteniendo cada uno una micro barra de agitación magnética en ella, en dos de temperatura independiente de agitación magnética controlableRPR.
    2. Ajuste la temperatura de un agitador magnético a 60 ° C, y la etiqueta del frasco de vidrio en la parte superior de la misma como "60 ° C"; mientras que el otro agitador magnético se mantiene a temperatura ambiente (RT) donde el vial de vidrio en la parte superior de ella se etiqueta como "RT".
    3. Añadir 200 l de solución de HSA, 200 l de agua ultrapura, y 200 l de solución de oro cloruro de (III) a cada vial bajo agitación constante (establecido como 360 rpm a menos que se especifique lo contrario) para permitir la encapsulación de Au iones dentro de la plantilla de proteínas.
    4. 2 min después, añadir 20 l de solución de NaOH a cada vial de manera que para activar la capacidad reductora de HSA en la formación de Au NCs y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min.
    5. Cada 20 min, dibujar 50 l de soluciones de cada uno de la muestra a una placa de color negro de 384 pocillos y medir el espectro de emisión con un lector de microplacas. La configuración de exploración típica: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm.
    6. Detenga el agitador magnético después de 100 min.
    7. Enfriar los frascos de vidrio con agua corriente en un fregadero. Precaución: Los viales de vidrio están calientes. Use guantes resistentes al calor para evitar la quema.
    8. Trazar los espectros de fotoemisión en todo momento para cada muestra para adquirir la cinética de formación de Au NCs en diferentes condiciones de temperatura.
  2. Con plantilla-BSA Au CN (BSA-Au CN)
    1. Colocar un vial de vidrio que contiene un micro barra de agitación magnética en la parte superior de un agitador magnético. Deja la temperatura como la temperatura ambiente.
    2. Mezclar 200 l de solución de BSA, 200 l de urea, y 200 l de solución de cloruro de oro (III) en el vial de vidrio con agitación constante.
    3. 2 min después, añadir 20 l de solución de NaOH para activar la capacidad reductora de BSA para formar Au NCs y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min. Medir el espectro de fotoemisión de la mezcla de reacción por hora.
      Nota: se mide el espectro de fotoemisión de BSA-Au CNcon menos frecuencia debido a que la tasa de formación de BSA-au NCs es más lenta que la de HSA-Au a la misma temperatura debido a la menor eficacia de urea para desplegar la proteína.
    4. Detenga el agitador magnético después de 7 h. Trazar los espectros de fotoemisión en todo momento para ver la cinética de formación de Au CN por desnaturalización urea.

Proyección 3. Pequeño Molecular de Drogas

  1. Pantalla afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños a HSA
    1. Coloque cinco viales de vidrio, conteniendo cada uno una barra de agitación magnética en ella, en la parte superior de un agitador magnético multipunto temperatura controlable. Etiqueta de estos viales como A, B, C y D, respectivamente, para cada fármaco, es decir, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida. Etiqueta de la una con HSA puro como control.
    2. Añadir 200 l de HSA a cada vial. Añadir 1 l de solución de fármaco a las cuatro viales correspondientes. Añadir 1 l de DMSO al control. Encender el agitador y ajustar la velocidad de giro de 360rpm e incubar durante 1 hora para permitir la unión a HSA para completar la droga.
    3. 1 hr después, añadir 200 l de agua Milli-Q y 200 l de solución de cloruro de oro (III) a cada vial bajo agitación constante. Ajuste la temperatura a 60 ° C bajo agitación constante durante 10 min. Añadir 20 l de NaOH 1,5 M a cada vial y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min.
    4. Dibujar rápidamente 50 l de solución de cada vial a un plato negro 384 pocillos y medir el espectro de emisión (resultados etiquetados como 0 min). Registre los espectros de emisión de cada muestra cada 10 min. Recoge al menos cuatro espectros a cuatro tiempo diferentes, es decir 0, 10, 20, y 30 min.
    5. Repita los pasos 3.1.1 - 3.1.4 varias veces para obtener resultados con una tendencia constante. Detenga el agitador magnético.
    6. Trazar los espectros de fotoemisión resuelta en el tiempo para cada muestra (a - d, y control). Identificar la intensidad máxima de todas las muestras y complot contra el tiempo para comparar la cinética de formación de Au CN en diferentes plantillas de proteínas cargadas con fármaco.
  2. Medir la constante de unión de un fármaco específico para HSA
    1. Repita los pasos 3.1.1 - 3.1.4. Reemplazar la solución de fármaco con soluciones de ibuprofeno a cuatro concentraciones diferentes (incluyendo una muestra de control usando HSA sólo sin carga de fármaco). Etiquetar el vial de vidrio de acuerdo con la concentración de fármaco correspondientemente.
    2. 10 minutos más tarde, enfriar los viales de vidrio con agua corriente en un fregadero. Precaución: Los viales de vidrio están calientes. Use guantes resistentes al calor para evitar la quema.
    3. Dibujar 50 l de las soluciones anteriores de cada vial a un plato negro 384 pocillos y medir el espectro de emisión.
    4. Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.3 dos veces más para obtener otros dos conjuntos de resultados a diferentes concentraciones del fármaco.
    5. Detenga el agitador magnético. Trazar los espectros de fotoemisión y analizar los resultados.
      1. Para los datos brutos obtenidos en cada lote individual, trazar los espectros de fotoemisión de cadamuestra en el software como el software OriginPro y averiguar la intensidad máxima.
      2. Calcular y representar gráficamente la intensidad de fluorescencia relativa [(I 0 - I) / I 0] en contra de la concentración de fármaco, donde I y I 0 refiero a la intensidad de fluorescencia de Au NCs formado en HSA y HSA pura cargada de fármaco, respectivamente.
      3. Calcula la constante de unión por ajuste de los datos a un modelo único sitio de unión usando la ecuación de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), donde R max indica la señal de respuesta máxima, C es la concentración de ligando y K D es la constante de unión. Realice esto en software como OriginPro. Seleccione el menú de ajuste no lineal Análisis de la curva de ajuste, a continuación, seleccione la función Hill Crecimiento / categoría sigmoidal. En la configuración: página Selección de Función, haga clic en Ajustar para mostrar los resultados de armarios.

Resultados

Desplegamiento de la proteína es un procedimiento importante para la formación de proteínas con plantilla Au NCs porque los grupos funcionales más reactivos (por ejemplo, residuos de tirosina) de una proteína pueden estar expuestos a reducir los iones Au encapsulados y por lo tanto acelerar la velocidad de formación de Au NCs. Agentes de calefacción y de desnaturalización externa son dos medios comunes para promover el proceso de desarrollo de proteínas. La Figura 1 muestra el efecto d...

Discusión

Hay varios pasos críticos que deben ser destacados en este método. En el protocolo de la detección de la afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños, Etapas 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 y son críticos para obtener buenos resultados que muestran tendencia constante para la fuerza de unión relativa. En estos pasos, las acciones de adición de productos químicos y el dibujo soluciones de reacción para la medición deben ser lo más rápidamente posible para minimizar el efecto tiempo de reta...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Gold (III) chloride solution, 30%Sigma-Aldrich484385Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96%Sigma-AldrichA1887
Bovine Serum albumin, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofen, 98%Sigma-AldrichI4883 
warfarin, 98%Sigma-AldrichA2250
phenytoinSigma-AldrichPHR1139
sulphanilamide, 99%Sigma-AldrichS9251
dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
ureaSigma-AldrichU5128
Sodium hydroxideSigma-Aldrich221465
Magnetic stirrerIKART5
Microplate readerTecanInfinite M200
384-well plateCorning
5 ml air displacement pipetteEppendorf
1,000 μl air displacement pipetteEppendorf
100 μl air displacement pipetteEppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tubeEppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

Referencias

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