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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Abstract

Si dimostra un nuovo metodo di screening di farmaci per determinare l'affinità di legame di piccole molecole farmaceutiche per una proteina bersaglio formando nanocluster fluorescenti oro (Au NC) all'interno della proteina-droga caricata, sulla base del segnale di fluorescenza emessa dal differenziale Au NC. Proteine ​​albumina come l'albumina sierica umana (HSA) e albumina sierica bovina (BSA) sono selezionati come le proteine ​​modello. Quattro piccole farmaci molecolari (ad esempio, l'ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide) di diverse affinità di legame alle proteine ​​albumina sono testati. Si è constatato che il tasso di formazione di fluorescenti Au CN all'interno farmaco caricata albumina in condizioni denaturanti (cioè, 60 ° C o in presenza di urea) è più lenta di quella formata nella proteina intatta (senza farmaci). Inoltre, l'intensità fluorescente del CN ​​come formata è risultato essere inversamente correlato alle affinità di legame di questi farmaci alle proteine ​​albumina. In particolare,maggiore è l'affinità di legame farmaco-proteina, più lenta è la velocità di formazione Au NC, e quindi una minore intensità di fluorescenza della risultante Au NC viene osservata. L'intensità di fluorescenza della risultante Au NC fornisce quindi una misura semplice della forza di legame relativa di diversi farmaci testati. Questo metodo è anche estensibile per misurare la costante legame specifico farmaco-proteina (K D) semplicemente variando il contenuto droga precaricato nella proteina ad una concentrazione proteica fissa. I risultati misurati corrispondono bene con i valori ottenuti con altri metodi di prestigio ma più complicati.

Introduzione

Albumine siero come albumina sierica umana (HSA) e albumina di siero bovino (BSA) sono la proteina più abbondante nel plasma e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della pressione osmotica del comparto sangue. Sono inoltre riconosciuti come proteine ​​di trasporto per le piccole molecole di bassa solubilità in acqua, come gli steroidi, acidi grassi, ormoni tiroidei, e una vasta gamma di farmaci. L'associazione di proprietà (ad esempio, siti di legame, affinità o la forza vincolante) di queste molecole di siero albumine costituisce un tema importante nella farmacocinetica. 1-4 diversi metodi analitici sono stati sviluppati per studiare le proprietà di legame dei farmaci diversi per siero albumine, come ad esempio cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare 5,6 (NMR), 7-11 e risonanza plasmonica superficiale (SPR), 12,13 etc. Tuttavia, questi metodi sono vincolate mediante un processo di analisi noioso e che richiede tempo (ad esempio, la crescita del monocristallo per X-ray Crystallostudio grafico), requisito di attrezzature specializzate e costose (SPR), o che necessitano di marcatura isotopica costosi (NMR) per la rilevazione. E 'quindi altamente auspicabile sviluppare modalità alternative per lo screening piccolo farmaco molecolare in un modo veloce, straight-forward, ed economicamente efficiente.

Nanocluster oro (Au NC) sono un tipo speciale di nanomateriali, che contengono diverse decine di atomi di metallo con dimensioni inferiori a 2 nm. 14-17 hanno attirato ampi interessi di ricerca a causa della loro struttura elettronica discreta e dimensione-dipendente, 18, 19 e molecolare come assorbimenti ed emissioni. 20-23 Tali proprietà materiali unici, in particolare una forte fluorescenza, hanno trovato diverse applicazioni come il rilevamento e l'imaging in sistemi biologici. 24-32 Ultrasmall fluorescente Au NC può essere sintetizzato utilizzando proteine ​​funzionali, quali albumine siero, come modello. 33 In una tipica sintesi delle proteine-su modelli di Au NC, una certa quantità di sali Au vengono prima incapsulati all'interno della proteina e successivamente ridotta di proteina stessa. La capacità riducente della proteina è attribuita a costituente residui amminoacidici funzionali (ad esempio, tirosina) che possono essere attivati ​​aumentando il pH della soluzione ad alcalino. Dispiegarsi della struttura delle proteine ​​è considerato come un passo fondamentale per la formazione di Au NC. Questo perché in una proteina unfolded, più gruppi funzionali riducenti possono essere esposti ai sali Au incapsulati. Protein dispiegarsi può essere ottenuto mediante trattamento termico o esposizione ad agenti denaturanti. Introduzione di piccoli farmaci molecolari può anche interessare il processo di svolgimento, cioè modificando la temperatura di denaturazione punto medio e l'entalpia di svolgimento. 34,35 L'effetto di tutti questi fattori, a sua volta può essere riflessa dalla cinetica di formazione dei fluorescenti Au NC e si manifesta in l'intensità di fluorescenza di risultanti Au NC. 36

e_content "> Questo video illustra il metodo di selezione della droga sintetizzando Au NC in proteine ​​albumina droga caricata ad una temperatura superiore (60 ° C) o in presenza di agenti denaturanti (ad esempio, urea). L'intensità di fluorescenza della risultante Au CN è la lettura del segnale. Innanzitutto, Au NC sono sintetizzati nei modelli HSA e BSA trattati a 60 ° C o in presenza di urea per mostrare come proteina dispiegarsi (indotta mediante trattamento termico o denaturanti) influenza la cinetica di formazione di Au NC. In secondo luogo, Au NC sono sintetizzati nei modelli di proteine ​​precaricato con diversi farmaci, e l'effetto della droga carico sui intensità di fluorescenza relativi dei risultante Au NC è studiato, che forniscono la misura della forza vincolante relativa. Infine, il protocollo di screening Au NC-farmaco viene modificato per misurazione quantitativa di farmaco-proteina legante costante (K D) variando il contenuto di farmaco precaricato nella proteina di una concentrazione fissa.

Protocollo

Attenzione: consultare le schede di sicurezza (SDS) di tutte le sostanze chimiche coinvolte prima dell'uso. L'esperimento screening di stupefacenti prevede la sintesi e la manipolazione dei nanomateriali, che possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte massa. Si prega di verificare le misure di controllo necessarie per essere praticato tutto l'esperimento, compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (DPI, ad esempio, i pantaloni di lunghezza di sicurezza, scarpe chiuse, guanti resistenti ai prodotti chimici, e occhiali di protezione).

1. Preparazione dei reagenti chimici per lo screening Drug

  1. Precursori per la sintesi Au NC
    1. Disciogliere 30 mg di soluzione di oro (III) cloruro (99,99% base oligometalli, 30 wt.% In HCl diluito) in 6,9 ml di acqua ultrapura per preparare 15 mM di oro (III) di cloruro. Attenzione: soluzione di cloruro d'oro è corrosivo e irritante. Indossare corretto DPI per evitare il contatto diretto con gli occhi e la pelle.
    2. Dissolve 74 mg di HSA o BSA in 1 ml di acqua ultrapura per preparare 74 mg / ml di proteine ​​soluzione madre.
  2. Soluzioni di droga
    1. Sciogliere la quantità desiderata di farmaco, per esempio, 1,9 mg per (a) ibuprofene, 2.8 mg di (b) warfarin, 2,3 mg di (c) fenitoina, e 1,5 mg per (d) sulfanilamide in 20 ml di DMSO per preparare 450 mM di soluzioni droga azionari.
      Nota: DMSO viene selezionato come solvente perché questi farmaci sono idrofobi e hanno scarsa solubilità in acqua.
  3. Altri reagenti
    1. Sciogliere 600 mg di pellet NaOH in 10 ml di acqua ultrapura per preparare 1,5 M di NaOH. Sciogliere 2.4 g di urea in 2 ml di acqua ultrapura per preparare 20 M di soluzione di urea.

2. Sintesi di proteine ​​Templated Au NC

  1. HSA-su modelli Au NC (HSA-Au NC)
    1. Inserire due fiale di vetro, ognuno contenente un micro ancoretta magnetica in esso, su due separata della temperatura controllabile ancoretta magneticaRERS.
    2. Impostare la temperatura di un agitatore magnetico a 60 ° C, ed etichetta la fiala di vetro su di essa come "60 ° C"; mentre l'altro agitatore magnetico viene mantenuta a temperatura ambiente (RT) in cui il flacone di vetro su di esso è etichettato come "RT".
    3. Aggiungere 200 ml di soluzione di HSA, 200 ml di acqua ultrapura, e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro di ciascuna fiala sotto agitazione costante (impostata come 360 ​​rpm se non diversamente specificato) per consentire l'incapsulamento di ioni Au all'interno del modello della proteina.
    4. 2 minuti più tardi, aggiungere 20 ml di soluzione di NaOH ad ogni flacone in modo da attivare la capacità di ridurre HSA nel formare Au NC e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min.
    5. Ogni 20 minuti, 50 ml di disegnare soluzioni da ciascuno del campione ad una piastra nera 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione con un lettore di micropiastre. La configurazione tipica di scansione: λ = 370 nm ex, λ em = 410-850 nm.
    6. Arrestare il agitatore magnetico dopo 100 min.
    7. Raffreddare i flaconi di vetro sotto l'acqua corrente in un lavandino. Attenzione: le fiale di vetro sono caldi. Indossare guanti resistenti al calore per evitare di bruciare.
    8. Tracciare gli spettri di fotoemissione a tutto il tempo per ciascun campione di acquisire la cinetica di formazione di Au NC a diverse condizioni di temperatura.
  2. BSA-su modelli Au NC (BSA-Au NC)
    1. Inserire una fiala di vetro contenente un micro ancoretta magnetica sulla sommità di un agitatore magnetico. Lasciare la temperatura come temperatura ambiente.
    2. Miscelare 200 ml di soluzione di BSA, 200 ml di urea, e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro nel flaconcino di vetro sotto costante agitazione.
    3. 2 minuti più tardi, aggiungere 20 ml di soluzione di NaOH per attivare la capacità riducente di BSA per formare Au NC e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. Misurare lo spettro di fotoemissione della miscela di reazione oraria.
      Nota: Lo spettro di fotoemissione di BSA-Au NC è misuratameno frequentemente perché il tasso di formazione BSA-Au NC è più lenta di quella di HSA-Au alla stessa temperatura a causa della minore efficacia di urea a svolgersi proteina.
    4. Fermare l'agitatore magnetico dopo 7 ore. Tracciare gli spettri di fotoemissione a tutti il ​​tempo di vedere la cinetica di formazione dei Au NC da urea denaturazione.

Screening 3. Piccolo Drug molecolare

  1. Schermata relativa affinità di legame di diversi farmaci piccola molecolari per HSA
    1. Posizionare cinque fiale di vetro, ciascuna contenente una ancoretta magnetica in esso, in cima ad una temperatura controllabile multipunto agitatore magnetico. Etichettare queste fiale come a, b, c, d, rispettivamente, per ciascun farmaco, vale a dire l'ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide. Etichettare quello con HSA puro come controllo.
    2. Aggiungere 200 ml di HSA ad ogni flacone. Aggiungere 1 ml di soluzione medicinale ai quattro fiale corrispondenti. Aggiungere 1 ml di DMSO al controllo. Accendere l'agitatore e impostare la velocità di centrifuga a 360rpm e incubare per 1 ora per consentire il legame di HSA droga per completare.
    3. 1 ora dopo, aggiungere 200 ml di acqua Milli-Q e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro di ciascuna fiala sotto costante agitazione. Impostare la temperatura a 60 ° C sotto costante agitazione per 10 min. Aggiungere 20 ml di NaOH 1,5 M a ciascuna fiala e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min.
    4. Disegnare rapidamente 50 ml di soluzione da ogni flaconcino a un piatto nero 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione (risultati etichettati come 0 min). Registra gli spettri di emissione di ciascun campione ogni 10 min. Raccogliere almeno quattro spettri a quattro tempi diversi, cioè 0, 10, 20 e 30 min.
    5. Ripetere i punti 3.1.1 - 3.1.4 più volte per ottenere risultati con un trend costante. Arrestare il agitatore magnetico.
    6. Tracciare la fotoemissione spettri risolta in tempo per ogni campione (a - d, e controllo). Identificare l'intensità massima di tutti i campioni e complotto contro il tempo per confrontare la cinetica di formazione dei Au NC a dimodelli di proteina-droga caricata fferent.
  2. Misurare la costante di legame di un farmaco specifico per HSA
    1. Ripetere i punti 3.1.1 - 3.1.4. Sostituire la soluzione farmaco con soluzioni ibuprofene a quattro diverse concentrazioni (tra cui un campione di controllo utilizzando HSA solo senza droga carico). Etichettare il flacone di vetro secondo la concentrazione di farmaco corrispondentemente.
    2. 10 minuti più tardi, raffreddare i flaconi di vetro sotto l'acqua corrente in un lavandino. Attenzione: le fiale di vetro sono caldi. Indossare guanti resistenti al calore per evitare di bruciare.
    3. Disegna 50 ml di soluzioni sopra di ogni fiala per un piatto nero 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione.
    4. Ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.3 altre due volte per ottenere altre due serie di risultati a diverse concentrazioni del farmaco.
    5. Arrestare il agitatore magnetico. Tracciare gli spettri di fotoemissione e analizzare i risultati.
      1. Per i dati grezzi ottenuti in ciascun lotto, tracciare gli spettri di fotoemissione di ciascuncampione in software come software OriginPro e scoprire l'intensità di picco.
      2. Calcolare e tracciare l'intensità di fluorescenza relativa [(I 0 - I) / I 0] contro la concentrazione del farmaco, dove io e mi riferisco a 0 l'intensità di fluorescenza di ragazza NC formato in-droga caricato HSA e puro HSA, rispettivamente.
      3. Calcolare la costante di legame inserendo i dati in un unico luogo di modello di legame utilizzando l'equazione di Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), dove R max indica il segnale di risposta massima, C è la concentrazione di ligando e K D è la costante di legame. Eseguire questo software come OriginPro. Selezionare il menu di analisi non lineare Montaggio Adattamento curva, quindi selezionare la funzione Hill Crescita / categoria sigmoidale. Nella Impostazioni: pagina di selezione funzione, fare clic su Adatta a mostrare i risultati a muro.

Risultati

Protein dispiegarsi un importante metodo per la formazione di proteina-templated Au NC perché gruppi funzionali più reattivi (per esempio, residui di tirosina di una proteina) possono essere esposti per ridurre gli ioni Au incapsulati e accelerare il tasso di formazione di Au NC così. Agenti di riscaldamento e di denaturazione esterno sono due mezzi comuni per promuovere il processo di svolgimento delle proteine. La Figura 1 mostra l'effetto di riscaldamento e l'aggiunta di agenti di...

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziate in questo metodo. Nel protocollo di screening della affinità di legame relativo dei diversi farmaci molecolari piccoli passi 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e sono fondamentali per ottenere buoni risultati mostrano tendenza coerente per la forza vincolante relativa. In queste fasi, le azioni di aggiunta di sostanze chimiche e disegno di soluzioni di reazione per la misura dovrebbe essere il più rapidamente possibile per minimizzare l'effetto ritardo e la stessa se...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Gold (III) chloride solution, 30%Sigma-Aldrich484385Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96%Sigma-AldrichA1887
Bovine Serum albumin, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofen, 98%Sigma-AldrichI4883 
warfarin, 98%Sigma-AldrichA2250
phenytoinSigma-AldrichPHR1139
sulphanilamide, 99%Sigma-AldrichS9251
dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
ureaSigma-AldrichU5128
Sodium hydroxideSigma-Aldrich221465
Magnetic stirrerIKART5
Microplate readerTecanInfinite M200
384-well plateCorning
5 ml air displacement pipetteEppendorf
1,000 μl air displacement pipetteEppendorf
100 μl air displacement pipetteEppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tubeEppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

Riferimenti

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