Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Resumen

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Resumen

La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca ^{2 + afluencia} y mitocondrial Ca ^{2 + sobrecarga.} Un cambio sustancial en Ca ^{2 + homeostasis} intracelular o remodelación de ^Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca ²⁺ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica ^de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca ²⁺ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial ^Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial ^Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.

Introducción

La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer ^1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca ²⁺ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) ^2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad ^3, lo que provoca la apoptosis neuronal ^4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida por NMDA puede cambiar con el desarrollo in vitro y el envejecimiento de ^5-8.

Es ampliamente aceptado que un aumento en la ^{concentración} de Ca2 + citosólico-libre ^([Ca2 +] _cyt) conduce a la activación de las células. Sin embargo, si este aumento es demasiado alta y / o sostenida suficiente, puede desencadenar la muerte celular ^9. Por otra parte, se ha propuestoque excitotoxicidad requiere Ca ²⁺ mitocondrial captación ^10, ya que el tratamiento de las neuronas con las neuronas protegidas desacoplador mitocondrial contra glutamato inducida por la muerte celular ^11. Si mitocondrias ocupan demasiado Ca ^2+, se puede producir la apertura de la transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que lleva a la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos, y la apoptosis que induce. Recientemente hemos demostrado que este mitocondrial ^de Ca 2 + captación está directamente relacionado con la susceptibilidad dependiente de la edad a la excitotoxicidad, midiendo directamente inducida por NMDA mitocondrial ^de Ca 2 + captación en las neuronas del hipocampo ^individuales 5, un método que se informa en este artículo. El hipocampo, involucrado en procesos fisiológicos tales como el aprendizaje, la memoria y otros procesos cognitivos ^12, es altamente vulnerable al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos ^13. Se ha propuesto que, después de varias semanas in vitro, se cultivaronlas neuronas del hipocampo muestran un número de características típicas de las neuronas de edad ^14. En consecuencia, las neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo pueden proporcionar un modelo integral para investigar Ca ²⁺ mecanismos mediadas de mayor excitotoxicidad en el envejecimiento.

El objetivo general del método presentado es, por lo tanto, para investigar los cambios sustanciales en el Ca ²⁺ intracelular homeostasis o Ca ²⁺ remodelación en el envejecimiento del cerebro incluyendo las respuestas el diferencial Ca ²⁺ provocadas por agonistas de los receptores NMDA en un largo plazo neuronas del hipocampo en cultivo . El método incluye una descripción detallada de la cultura de las neuronas del hipocampo de rata y el seguimiento de las concentraciones de ^Ca2 + citosólico y mitocondrial mediante fluorescencia y imágenes de bioluminiscencia en las neuronas individuales, respectivamente. Imágenes de fluorescencia de Ca ²⁺ citosólico en las neuronas cultivadas es un procedimiento estándar. Sin embargo, este método es menos fiable para subcelular Ca ²⁺ mediciones incluyendo mitocondrial ^de Ca2 +. Las razones para esto son la falta de orientación adecuada de sondas sintéticas y afinidad inapropiado para Ca ²⁺ concentraciones que pueden cambiar en las mitocondrias del bajo nivel M, incluso al nivel mM. El uso de ^Ca 2 + sondas basadas en proteínas como, por ejemplo, aequorina, ha permitido a la focalización a orgánulos subcelulares y el uso de derivados de diferentes ^Ca 2 + afinidades utilizando diferentes coelenterazines o sondas mutados que carecen de sitios de unión específica ¹⁵ Ca ^2+. De esta manera, imágenes de bioluminiscencia de células que expresan aecuorina mitocondrias-dirigida puede permitir el seguimiento de mitocondriales ^de Ca 2 + concentraciones en neuronas individuales. Sin embargo, este procedimiento puede requerir el uso de cámaras de conteo de fotones o cámaras CCD ultrasensibles de imágenes de bioluminiscencia ^16-18. Este método puede producir nuevos resultados que debe ser confirmada en más establmodelos cies de envejecimiento del cerebro como, por ejemplo, secciones de cerebro de animales viejos.

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Protocolo

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido manejados bajo los protocolos aprobados por la instalación de alojamiento de los animales de la Universidad de Valladolid, de acuerdo con la Convención Europea 123 / Consejo de Europa y la Directiva 86/609 / CEE.

1. Corto y Largo Plazo Cultura de las neuronas del hipocampo de rata

1. Preparación de poli-D-lisina recubierto, 12 mm cubreobjetos de vidrio.
   1. Esterilizar 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro en etanol durante al menos 24 h. Deje que se seque en condiciones estériles.
   2. Distribuir los cubreobjetos en una tira de Parafilm en una placa de Petri. Cubrir la superficie de cada cubreobjetos con 200 l de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir el tratamiento de O / N.
   3. El día siguiente lavado los cubreobjetos con agua bidestilada estéril cada 15 min durante 90 min en condiciones estériles.
   4. Llenar una placa de cuatro pozos multiplaca con 500 l de Neurobasal medio de cultivo por pocillo. Neurobasal medio de cultivo debe ser complementado conSuero bovino fetal al 10%, 2% B27, 1 mg / ml de gentamicina y 2 mM L-glutamina.
   5. Coloque el cubreobjetos en la placa multiplaca. Mantener en un humidificado 37 ° C y 5% de CO ₂ incubadora hasta su uso.
2. Aislamiento de las neuronas del hipocampo de ratas neonatales.
   1. Preparar 1,8 ml de solución de papaína (directa comprado) en un vial (20 l / ml) en condiciones estériles: para obtener una concentración final de 20 l / ml de añadir alrededor de 40 l papaína en 1,8 ml de Hank, más 0,6% de BSA (l debe calcularse dependiendo de las condiciones de proveedores). De Hank 0,6% de BSA se prepara mezclando 85 ml de medio HBSS con 15 ml de albúmina de suero bovino al 4% (BSA, preparado la solución de 4 g de BSA en 100 ml HBSS). Preparar en una campana estéril.
   2. Incubar la papaína en Hank de más 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ºC antes de su uso. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 micras antes de su uso.
   3. Preparar medio F-12 de Ham añadiendo DulbeccoModificado polvo de Medio de Eagle (13,5 g por L) en 900 ml de agua bidestilada estéril. A continuación, añadir 6 g de HEPES y 336 mg _NaHCO3 y ajustar el pH a 7,42 con NaOH 4 N. Añadir agua estéril para obtener una solución de 1 L y filtrarla usando una polietersulfona 0,20 micras (PES) botella de filtro superior. Realizar este proceso en una campana estéril. Finalmente saturar la solución con CO ₂ en condiciones estériles antes de su uso. Soluciones Almacenar a 4 ºC y utilizarlos refrigerada.
   4. La eutanasia a recién nacido (P0) crías de ratas por decapitación y se lava la cabeza en medio HBS estéril. Abra el cráneo con la ayuda de unas tijeras estériles. Extraer el cerebro con una espátula y lavar rápidamente en medio F-12 de Ham.
   5. Haga un corte diagonal con la ayuda de un bisturí en cada hemisferio (Figura 1B), y llevarla a una placa de Petri que contiene medio F-12 de Ham.
   6. Meninges Descartar cuidadosamente con la ayuda de unas pinzas de disección y bajo una lupa.
   7. Identificar el hipocampo en una zona cóncava característica más de la corteza usando la lupa. Luego, separe el hipocampo de la corteza tirando cuidadosamente de una frontera y de sacarlo de su posición con unas tijeras oculares.
   8. Transferir el tejido del hipocampo a una placa de 4 bien lleno de medio estéril de Hank carente Ca ²⁺ y Mg ^2+, más 0,6% de BSA y lavar el tejido del hipocampo. Sin retirar los medios de comunicación cortar el tejido en trozos pequeños (alrededor de 2 x 2 mm) utilizando las mismas tijeras oculares.
   9. Transferencia piezas de hipocampo a un vial que contiene 1,8 ml de solución de papaína pre-filtrada. Entonces incuban a 37 ºC con ocasional, agitación suave. 15 min después, añadir 90 l de solución de DNasa I (50 mg / ml final) y se incuba durante 15 min adicionales.
   10. Transferir el tejido a un tubo de centrífuga de 10 ml y lavar los fragmentos con frescos Neurobasal medio de cultivo. Obtener suspensión de células haciendo pasar los fragmentos de tejido a través de un pip plástico 5 mlette.
   11. Suspensión de células Centrifugar a 160 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur de plástico estéril y suspender pellet cuidadosamente con una pipeta de 1 ml automatizados en 1 ml de medio de cultivo Neurobasal.
   12. Medir la densidad de células usando una cámara de recuento Neubauer. Coloque el cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer. Añadir 10 l de suspensión celular. Asegúrese de que la suspensión celular entra en la cámara de manera uniforme y sin hacer burbujas. Contar el número de células bajo el microscopio y realizar cálculos correspondientes para obtener una gota adecuada de 40 a 80 l que contiene 30 x 10 ³ células. El número total de células dependerá del número de animales utilizados.
3. A corto plazo y la cultura a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata.
   1. Sobre la placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de Neurobasal medio de cultivo preparado antes y se mantienen en la incubadora, la placa alrededor de 30 x 10 ³ células en una caída de alrededor de 50 l a cadapocillo de la placa multiplaca que contiene uno poli-D-lisina, 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro.
   2. Mantener las células del hipocampo primaria en un humidificado 37 ° C y 5% de CO ₂ incubadora durante 2-5 días in vitro (DIV, a corto plazo, las culturas jóvenes) o> 15 DIV (a largo plazo, las culturas de edad) antes de experimentos sin necesidad de cambiar la cultura medios de comunicación.

2. Fluorescencia de Imagen de citosólica ^de Ca2 + Concentración

1. Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de fluorescencia.
   1. Preparar una solución externa de solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 145, KCl 5, _MgCl2 1, _CaCl2 1, glucosa 10, sodio-HEPES 10 (pH 7,42).
   2. Preparar una solución exento externa, Mg ^2+, solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 146, KCl 5, _CaCl2 1, glucosa 10 y 10 HEPES (pH 7,42).
   3. Resuelva salina NMDA en Mg ^{2 + libre,} tamponada con HEPES (HBS) a una final concentración de 100 mM y complementarlo con 10 mM glicina.
   4. Preparar una solución de HBS que contenía KCl en lugar de NaCl mediante la resolución de (en mM): KCl 145, _MgCl 2 1, CaCl ₂ 1, glucosa 10 y HEPES 10 (pH 7,42).
2. La carga de las células del hipocampo con fluorescente sonda de calcio fura2 / AM.
   1. Tome el cultivo de células que contienen cubreobjetos fuera de la incubadora y lavarlos con medio HBS a RT transfiriéndolos a una nueva placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de HBS por pocillo.
   2. Se incuban las células con fura2 / AM 4 M (preparado en el mismo medio HBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) en un lugar oscuro.
   3. Después de 60 minutos, lavar cubreobjetos con medio HBS fresco.
3. Grabación de imágenes de fluorescencia de citosólico ^[Ca 2+] en células cultivadas.
   1. Encienda la lámpara, microscopio, sistema de perfusión, cámara de fluorescencia y el ordenador.
   2. Coloque los cubreobjetos en una plataforma para termostatizadoabiertas 12 mm cubreobjetos de cristal en la platina del microscopio invertido y seleccionar un campo microscópico utilizando un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3). Perfundir células continuamente con precalentado (37 ºC) medio HBS en ausencia o presencia de sustancias de ensayo. Mantener el flujo a una velocidad de aproximadamente 5-10 ml / min.
      Nota: sistema de perfusión celular para células vivas está montado en una plataforma para termostatizado abiertas 12 mm cubreobjetos de vidrio. Sistema de perfusión por gravedad 8 líneas equipadas con un controlador de válvula se utiliza para perfundir las soluciones. Una bomba de vacío es responsable de la eliminación de cualquier exceso de medio. Las soluciones se calentaron usando un sistema de calefacción en el tubo.
   3. Capturar una imagen de fondo con el obturador cerrado en ambas longitudes de onda de excitación.
   4. Epi-iluminar células alternativamente a 340 y 380 nm. Record luz emitida a 520 nm cada 5-10 seg con una cámara de fluorescencia, que se filtra por un espejo dicroico fura-2.
   5. Cuando finalice el período de registro, guarde la secuencia completa of imágenes emiten en 520 nm en el ordenador para su posterior análisis.
4. Análisis de imágenes fluorescentes grabados.
   1. Abra el archivo de experimento. Usando el software aquacosmos, haga clic en 'Relación' y seleccione el rango de relación deseada. Calcular la relación de pixel por pixel en las imágenes resultantes a fin de obtener una secuencia de imágenes de relación.
   2. Reste fondo ajustando la 'eliminación de fondo'. Pulse 'cálculo de inicio'.
   3. Pulse 'todo momento secuencia' botón y borrar las antiguas regiones de interés (ROI). Para el análisis cuantitativo de las células individuales, establecer nuevas regiones de interés o regiones de interés correspondientes a las neuronas individuales. Promedio de todos los valores de la relación en cada píxel correspondientes a cada ROI y cada imagen para obtener una grabación de valores de fluorescencia ratio para ROI individuales (células).
   4. Para graficar las grabaciones individuales exportar los valores de relación de fluorescencia correspondientes a cada retorno de la inversión a un progr gráficaa.m.
   5. Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de las subidas de fluorescencias proporción en respuesta a cada estimulación mediante un análisis de datos adecuado y graficando software.

3. La bioluminiscencia de imágenes de ^Ca2 + mitocondrial Concentración

1. La transfección de las neuronas del hipocampo en cultivo con el plásmido mitGAmut.
   NOTA: Las células se transfectaron primero con el plásmido que contiene una secuencia mitGAmut mitocondrias-orientada y un aequorina mutado carente de un sitio de unión ^de Ca2 + fusionado a la proteína fluorescente verde (GFP). Esta construcción detecta grandes aumentos en mitocondrial ^de Ca 2 + captación y permite la identificación de células transfectadas por la fluorescencia GFP. El plásmido fue desarrollado y proporcionado amablemente por el P. Brulet y compañeros de trabajo ¹⁸ (CNRS, París).
   1. Preparar Neurobasal TF, que contiene Neurobasal medio de cultivo, que carece de suero fetal bovino, B27, gentamicy 2 mM L-glutamina.
   2. Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 2,5 l reactivo de transfección en un vial (Solución A). Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 4 g mitGAmut plásmido en un vial (Solución B). Añadir con cuidado la solución B sobre la solución A. Permitir la mezcla durante 20 minutos, sin agitar.
   3. Transfiera los cubreobjetos que contienen las neuronas del hipocampo a nuevas placas multiplaca que contienen 200 l de TF Neurobasal fresco.
   4. Añadir gota a gota 100 l de solución A + B sobre cada cubreobjetos. Incubar durante 30 min. Retire el medio. Lavar una vez las células con TF Neurobasal fresco. Devolver los cubreobjetos a la original Neurobasal medio de cultivo.
   5. Neuronas de cultivo para un 24 h más a 37 ºC y 5% de CO ₂ después de la transfección para permitir la expresión eficiente y la orientación de la sonda.
2. Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de bioluminiscencia.
   1. Preparar soluciones HBS contienen NMDA 100 mM o 145 mM KCl comoanteriormente (Paso 2.1). Prepare la solución HBS conteniendo mM Ca ^{2 +} 10 plus digitonin 100 mM.
3. Reconstitución de aequorina mitocondrias-dirigida con coelenterazina n.
   1. Cubreobjetos de transferencia que contiene las neuronas del hipocampo transfectadas a una placa de cuatro pocillos que contenía 200 l de HBS.
   2. Añadir 4 l de coelenterazina n (200 M) a 200 l de HBS para una concentración final de 4 mM y mezclar suavemente. Incubar durante 2 horas a RT (25 ºC) y en la oscuridad.
4. Grabación de imágenes de bioluminiscencia de mitocondrial ^[Ca2 +].
   1. Encienda el microscopio, la lámpara, el sistema de perfusión, cámara de bioluminiscencia y el ordenador.
   2. Transferir a un cubreobjetos reconstituidas (37 ºC) cámara de perfusión termostatizada y perfundir continuamente con solución pre-calentado HBS a una velocidad de 5-10 ml / min.
   3. El uso de un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3), seleccione un campo microscópico que contiene células que expresan la unapoaequorins como se muestra por la emisión de fluorescencia asociado con la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando los filtros FITC. Un campo típico puede contener 1-2 células transfectadas. Capturar la imagen de fluorescencia de GFP, usando una cámara CCD.
   4. Apague la luz del microscopio. Quite la caja que contiene dicroico-ubicado en la vía de la luz. Apague la luz de excitación y cerrar la caja oscura de completa oscuridad.
   5. Perfundir células a 5-10 ml / min con medio HBS con o sin soluciones de prueba pre-calentado a 37 ºC.
   6. Captura de imágenes de emisión fotónicos cada 10 seg con una cámara de recuento de fotones manejado con un procesador de imagen.
   7. Al final de cada experimento, permeabilizar las células con 0,1 mM de digitonina en 10 mM CaCl ₂ en HBS con el fin de liberar a todos los restantes emisiones fotónicos.
      Nota: Estas emisiones fotónicas deben sumarse para estimar el total de emisiones fotónicas, un valor requerido para la calibración de Ca ²⁺ concentraciones <./ li>
   8. Imágenes de bioluminiscencia tienda en el ordenador la imagen de fluorescencia de GFP asociado con capturaron antes de la proyección de imagen de recuento de fotones.
5. Análisis de imágenes de bioluminiscencia que reflejan mitocondrial ^[Ca2 +].
   1. Cuantificar las emisiones fotónicas utilizando software específico. Las emisiones fotónicos pueden ser convertidos a Ca ²⁺ mitocondrial libre de concentración ^([Ca2 +] _mit) utilizando el algoritmo descrito por Brini et al. ^15.
   2. Abra la imagen de fluorescencia de GFP experimento y. Seleccionar regiones de interés (ROIs) con la ayuda de software específico por dibujar la forma de las células transfectadas de acuerdo con las imágenes de fluorescencia capturados al comienzo del experimento.
   3. Pegue las mismas regiones de interés en cada imagen. Total de emisiones fotónicas en cada retorno de la inversión se calculan con un software específico para obtener el valor de emisión de luminiscencia (L) para cada celda en cada punto en el tiempo.
   4. Suma todo el emiss fotónicoiones en las imágenes de bioluminiscencia, incluidos los obtenidos después de digitonina permeabilización, utilizando el software específico, para obtener una imagen de bioluminiscencia que contiene todas las emisiones fotónicos.
   5. Los valores de exportación de emisiones fotónicas para todas las regiones de interés para un software específico para los cálculos. Para ello, haga clic en 'Graph' con el fin de calcular los valores de bioluminiscencia para cada ROI en cada momento. Seleccione "valor total" y "utilizar ROI actual para todas las imágenes. Pulse 'calcular'. Guarde el 'txt.file' y exportar datos a una hoja de cálculo. Por cada ROI, [Ca ^{2 +]} _mit se calcula utilizando el siguiente algoritmo:
      
      ^[Ca2 +] (M) = [R + (R · K _TR) - 1] / [K _{R - (R} · K _R)];
      
      dónde,
      R = [L / (L λ _total)] ^{1 / n}
      L es la luminiscencia emitida en el momento de la medición en cada región de interés.
      L _{total es}la luminiscencia total restante después de la adición de los recuentos presentes en el tejido en ese momento en el momento de la medición para cada región de interés. λ, K _TR, K _R y n son constantes cuyos valores dependen combinación de aequorina (tipo salvaje o mutado) y coelenterazin utilizado (de tipo salvaje o de tipo n), así como la temperatura ¹⁶ de grabación. Para la combinación usada aquí (AEQ y coelenterzine n mutado), a 37 ºC, se utilizaron los siguientes valores: K _R = 8,47 x 10 ^7, K _TR = 165,6 x 10 ^3, n = 1204 y λ = 0,138.
6. Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de los aumentos en la bioluminiscencia en respuesta a cada estímulo mediante un análisis de datos adecuado y graficando software.

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Resultados

Aquí se describe un método simple para evaluar Ca ²⁺ remodelación y los efectos del NMDA en citosólica y mitocondrial ^[Ca2 +] en las neuronas de edad. La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento para el aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratas neonatales. Antes de empezar, tenemos que prepararnos, recubiertos, cubreobjetos de vidrio de poli-D-lisina estériles y colocarlos en una placa de 4 pocillos. A continuación, las ratas neonatales son asesinados y el...

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Discusión

La remodelación de Ca ^{2 + homeostasis} intracelular en el envejecimiento del cerebro se ha relacionado con la pérdida cognitiva, aumento de la susceptibilidad a daños isquémico, la excitotoxicidad y la neurodegeneración. Para investigar esta hipótesis in vitro, procedimientos de imagen Ca ²⁺ están disponibles. Por desgracia, las culturas viables de las neuronas del hipocampo de edad no son fiables. Recientemente, se ha observado que los cultivos a largo plazo de las neuronas del hipo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics