細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

要約

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

要約

神経変性および虚血に関連する神経細胞死に対する感受性は非常に高齢の脳で増加しているが、原因となるメカニズムはひどく知られています。興奮毒性、両方の傷害により誘発されるニューロン損傷に寄与すると考えプロセスは、 ^の Ca 2+流入およびミトコンドリア^の Ca 2+過負荷を促進するグルタミン酸受容体の活性化によって媒介されます。 ^細胞内Ca 2+恒常性の^細胞内Ca 2+ホメオスタシスや改造の実質的な変化は、古いニューロンにおけるニューロン損傷を好むことがあります。老化中のCa ²⁺リモデリングを調査するために、我々 は 、in vivoでの神経細胞を老化させ、いくつかの態様で似ているラット海馬神経細胞の長期培養でのライブセルイメージングを使用しています。このために、海馬の細胞は、最初の場所で、新鮮に生まれたばかりのラットの海馬から分散され、ポーリ-D-リジンコーティングされ、カバーガラス上にプレーティングしました。その後、培養物は数日または数ワットのために制御されるメディアに保管されていますそれぞれ、老若男女ニューロンを調査するためeeks。第二に、培養されたニューロンはFURA2にロードされ、デジタル蛍光比イメージングを使用して、細胞質ゾル^Ca 2+濃度の測定を行っています。第三に、培養神経細胞は、ミトコンドリアを標的とする低親和性エクオリンとGFPのタンデムを発現するプラスミドでトランスフェクトされます。 24時間後、細胞内でエクオリンはセレンテラジンを用いて再構成され、神経細胞は、ミトコンドリアのCa ^2+濃度を監視するための生物発光イメージングに供します。この3段階の手順としては、例えば、細胞質ゾル、関連刺激に対するミトコンドリアのCa ^2+応答のモニタリングを可能にするグルタミン酸受容体アゴニストNMDAこれら及び他の応答は、加齢によって影響を受けるかどうかを比較します。この手順では、どのように影響を与える細胞質とミトコンドリアのCa ²⁺選択刺激に対する応答だけでなく、神経細胞を防止することを目的とし選択される薬剤のエージング試験のように、新しい洞察をもたらすことができます加齢関連疾患で死亡。

概要

興奮毒性は、虚血などの神経学的傷害であり、例えば、アルツハイマー病の¹などのいくつかの神経変性疾患における神経損傷および細胞死に寄与する最も重要な機構の1つです。神経毒性のこのタイプは、主にカルシウムに作用するグルタメートにより媒介される²⁺ -permeable、イオンチャネル型NMDA受容体^{（NMDAR）2。}グルタミン酸への培養神経細胞の曝露は、神経細胞のアポトーシス^{4を引き起こす}興奮毒性^3、につながることができます。我々と他の人は、以前、NMDA誘導性アポトーシスに対するニューロンの脆弱性は、in vitroでの開発と^5-8の加齢に変更される可能性があることを報告しています。

これは、広く細胞質ゾルのフリー^Ca 2+濃度（の[Ca ^2+] _CYT）の増加は、細胞の活性化につながることが認められています。この上昇は高すぎ、および/ ​​または十分に持続する場合には、それは細胞死^9をトリガすることができます。また、提案されていますその興奮毒性は、ミトコンドリアのCa ²⁺取り込み^10、グルタミン酸誘発細胞死¹¹に対するミトコンドリア脱共役保護ニューロンとニューロンの治療以降が必要です。ミトコンドリアはあまりにも多くのCa ^2+を取る場合は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔の開口部は、シトクロムcおよび他のプロアポトーシス因子の放出、およびアポトーシスを誘導につながる、発生することがあります。私たちは最近、このミトコンドリアのCa ²⁺取り込みを直接直接単一海馬ニューロン⁵におけるNMDA誘発性のミトコンドリアのCa ²⁺取り込み、この記事で報告されているメソッドを測定することにより、興奮毒性の年齢依存性の感受性に関連していることが示されています。このような学習、記憶およびその他の認知プロセス¹²のような生理学的プロセスに関与する海馬は、加齢と神経変性疾患¹³に対して非常に脆弱です。これは、 インビトロで数週間後、ことが提案されている、培養海馬ニューロンは、高齢者のニューロン¹⁴の典型的な特徴の数を示します。したがって、長期培養海馬神経細胞は老化で強化された興奮毒性の^の Ca 2+媒介メカニズムを調査するための包括的なモデルを提供することができます。

提示された方法の全体的な目的は、長期培養海馬ニューロンにおけるNMDA受容体アゴニストによって誘発される差動^の Ca 2+応答を含む老化脳における^細胞内Ca 2+ホメオスタシス又はCa ²⁺リモデリングの実質的な変化を調査することです。この方法は、それぞれ、ラット海馬ニューロンの培養物の詳細な説明及び個々のニューロンにおける蛍光および生物発光イメージングによる細胞質ゾルおよびミトコンドリア^の Ca 2+濃度のモニタリングを含みます。培養神経細胞における細胞質ゾルのCa ²⁺の蛍光イメージングは、標準的な手順です。しかし、この方法は、サブのための信頼性が低いですミトコンドリアのCa ²⁺を含む細胞のCa ²⁺測定。この理由も、mMのレベルに低μMレベルからミトコンドリアで変更される可能性のCa ²⁺濃度のための合成プローブの適切な標的と不適切な親和性の欠如を含みます。インスタンスエクオリンのようなタンパク質に基づいたCa ²⁺プローブの使用は、細胞内小器官への標的化し、特定のCa ²⁺結合部位^15を欠く異なるセレンテラジンまたは変異プローブを用いて、異なる誘導体のCa ²⁺親和性の使用を許可されています。このように、ミトコンドリア標的エクオリンを発現する細胞の生物発光イメージングは、個々の神経細胞におけるミトコンドリア^の Ca 2+濃度のモニタリングを可能にすることができます。しかし、この手順では、生物発光イメージングのために^16-18光子計数カメラや超CCDカメラの使用を必要とするかもしれません。この方法は、よりestablに確認すべきである小説の結果を得ることが脳の老化のモデルは古い動物から、例えば、脳スライス、としてished。

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プロトコル

倫理声明：動物を対象とする手順は、欧州条約123 /欧州評議会と指令609分の86 / EECに一致バリャドリッド大学動物飼育施設によって承認されたプロトコルの下で処理されました。

ラット海馬ニューロンの1短期・長期の文化

1. ポリ-D-リジンの製造は、12 mmのガラスカバースリップコーティング。
   1. 少なくとも24時間、エタノール中に直径12mmのガラスカバースリップを滅菌します。彼らは無菌条件下で乾燥することができます。
   2. ペトリ皿にパラフィルムのストリップ上にカバーグラスを配布します。 1 mg / mlのポリ-D-リジンの200μlで、各カバーグラスの表面を覆います。 O / Nを処理できるようにします。
   3. 次の日は、無菌条件下で90分間蒸留滅菌水で15分毎にカバーガラスを洗います。
   4. 神経基礎培養培地500μlで4ウェルmultidishプレートを埋めるウェルあたり。神経基礎培養培地を補足する必要があります10％ウシ胎児血清、2％のB27、を1μg/ mlのゲンタマイシンおよび2mM L-グルタミン。
   5. multidishプレートにカバースリップを置きます。加湿37ºC、使用するまで、5％CO ₂インキュベーターでそれらを維持します。
2. 新生ラットからの海馬神経細胞の単離。
   1. 無菌条件下でバイアル（20μL/ ml）に1.8ミリリットルパパイン溶液（直接購入）準備：20μlの最終濃度を得るために/ 1.8ミリリットルハンクスプラス0.6％BSA中で約40μlのパパイン追加ML（μlを計算する必要があります）サプライヤーの条件によって異なります。ハンクス0.6％のBSA、4％のウシ血清アルブミンの15 mlのHBSS培地85 mlと混合することにより調製される（BSA、100 mlのHBSS中でBSAを4g解決調製しました）。無菌フードでそれを準備します。
   2. 使用前に37ºCで30分間ハンクスプラス0.6％BSA中のパパインをインキュベートします。使用前に0.22μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。
   3. ダルベッコ添加することによりハムF-12培地を調製二重滅菌蒸留水900ミリリットルにイーグル培地粉末（1Lあたり13.5グラム）を修正しました。その後、6グラムHEPESを追加して、336ミリグラムのNaHCO ₃及びNaOH 4 N. 1 L溶液を得るために、滅菌水を加え、0.20μmのポリエーテルスルホン（PES）ボトルトップフィルターを使用してフィルタリング使用し7.42のpHを調節します。無菌フード内でこのプロセスを実行します。最後に、使用前に無菌条件下でのCO ₂で溶液を飽和させます。ストアソリューション4ºCで、冷却それらを使用しています。
   4. 断頭により新生児（P0）仔ラットを安楽死させると、滅菌HBS培地で頭を洗います。滅菌はさみの助けを借りて、頭蓋骨を開きます。へらで脳を抽出し、HamのF-12培地中ですぐにそれを洗います。
   5. 各半球（ 図1B）でメスの助けを借りて斜めカットを行い、ハムF-12培地を含むペトリ皿にそれを運びます。
   6. 解剖鉗子の助けを借りて、拡大鏡の下で慎重に髄膜を捨てます。
   <李は>虫眼鏡を使用して、皮質の上に特徴凹状の場所に海馬を特定します。そして、1国境から慎重に引き出し、目のはさみを使用して、その位置からそれを除去することによって、皮質から海馬を分離。
   7. 無菌ハンクス培地のCa ²⁺を欠くとMg ²⁺プラス0.6％BSAで満たされた4ウェルプレートに海馬組織を移し、海馬組織を洗います。培地を除去せずに、同じ目のはさみを使用して、（2×2ミリメートル程度）小片に組織を切断します。
   8. 1.8ミリリットルプレフィルタパパイン溶液を含有するバイアルに海馬の部分を転送します。そして時折、穏やかに振とうしながら37ºCでそれらを培養します。 15分後、（最終50μg/ mlの）のDNase I溶液の90μlを添加し、さらに15分間インキュベートします。
   9. 10ミリリットルの遠心チューブに組織を移し、新たな神経基礎培養培地で断片を洗います。 5mLのプラスチックピップを通して組織フラグメントを通過させることにより、細胞懸濁液を得ますETTE。
   10. 5分間160×gで遠心細胞懸濁​​液。プラスチック滅菌パスツールピペットを用いて上清を除去したNeurobasal培養培地1mlのピペットを自動1mlで注意深くペレットを一時停止します。
   11. ノイバウアーカウントチャンバーを用いて細胞密度を測定します。ノイバウアー室の上にカバーガラスを置きます。 10μlの細胞懸濁液を追加します。細胞懸濁液を均一かつ気泡を作るんチャンバに入ることを確認してください。 30×10 ³細胞を含有する40-80マイクロリットルの適切な低下を得るために、顕微鏡下で細胞数をカウントし、対応する計算を実行します。細胞の総数は、使用される動物の数に依存します。
3. 短期およびラット海馬神経細胞の長期培養。
   1. それぞれに、約50マイクロリットルの低下に約30×10 ^3細胞を神経基礎培養培地500μlを含む4ウェルmultidishプレートの上に前に準備し、インキュベーター、プレートに保持1つのウェルポリ-D-リジンでコーティングされた、直径12mmのガラスカバースリップを含むmultidishプレートの。
   2. 文化を変えることなく、実験の前に、インビトロでの 2-5日（DIV、短期、若い文化）または> 15 DIV（長期熟成の文化）加湿37ºC、5％CO ₂インキュベーター内で一次海馬細胞を維持メディア。

細胞質^Ca 2+濃度の2蛍光イメージング

1. 蛍光イメージングのための試験溶液の調製。
   1. NaCl 145、KClの5、のMgCl _{2 1、CaCl} 2を1、グルコース10、ナトリウムHEPES 10（pHは7.42を）：MMで、含む外部HEPES緩衝生理食塩水（HBS）溶液を調製します。
   2. NaCl 146、KClの5、グルコースのCaCl ₂ 1、10およびHEPES 10（pHは7.42）：MMで含む外部^、Mg 2+を含まない、HEPES緩衝生理食塩水（HBS）ソリューションを準備します。
   3. FINAでのMg ^{2+を含まない} 、HEPES緩衝生理食塩水（HBS）にNMDAを解きますリットル、100μMの濃度と10μMのグリシンとそれを補います。
   4. KCl _145、MgCl 2を_1、CaCl 2を1、グルコース10およびHEPES 10（pHは7.42）を：（MMで）解くことで代わりのNaClのKClを含むHBS溶液を調製します。
2. 蛍光カルシウムプローブFURA2 / AMで海馬細胞の負荷。
   1. インキュベーターからカバーガラスを含む細胞培養物を取り、ウェルあたりHBSを500μlを含む新しい4ウェルmultidishプレートにそれらを転送することにより、室温でHBS培地でそれらを洗ってください。
   2. FURA2で細胞をインキュベート/暗所でRT（25ºC）で60分間（同じHBS培地中で調製した）AM 4μM。
   3. 60分後、新鮮なHBS培地でカバーグラスを洗います。
3. 培養細胞中の[Ca ^2+]細胞質ゾルの蛍光画像を記録します。
   1. ランプ、顕微鏡、灌流システム、蛍光カメラとコンピュータの電源を入れます。
   2. 以下のためのサーモスタットのプラットフォームでカバースリップを置き倒立顕微鏡のステージ上でオープン12ミリメートルのガラスカバースリップとは、対物レンズ40倍（1.3油、NA）を使用して微細なフィールドを選択します。不在または試験物質の存在下で（37ºC）予め温めたHBS培地で連続的に細胞を灌流。 /分、約5〜10 mlとの速度で流れを維持します。
      注：生きている細胞の細胞灌流システムは、オープン12ミリメートルのガラスカバースリップ用サーモスタットプラットフォームに装着されています。弁制御装置を搭載した8ライン重力駆動灌流システムは、溶液を灌流するために使用されます。真空ポンプは、過剰の培地を除去する責任があります。ソリューションは、内管の加熱システムを使用して加熱されます。
   3. シャッターが両方の励起波長で閉鎖して、背景画像をキャプチャします。
   4. 340および380 nmで交互に細胞をエピは、点灯します。レコード光が520nmのフラ-2ダイクロイックミラーによってフィルタリングされた蛍光カメラ、と5-10秒で放出されます。
   5. 記録期間が終了すると、完全な配列のOを格納Fの画像は、さらなる分析のためにコンピュータ520 nmで放出されました。
4. 記録された蛍光画像の解析。
   1. 実験ファイルを開きます。 AQUACOSMOSソフトウェアを使用して、「比率」をクリックして、所望の比率の範囲を選択します。比率画像のシーケンスを取得するために、得られた画像内の画素比率によってピクセルを計算します。
   2. 「背景除去」を調整することにより、バックグラウンドを減算します。プレス「スタート計算」。
   3. プレス「常にシーケンス」ボタンおよび利息（ROIを）の古代の領域を消去します。個々の細胞の定量的分析のために、個々のニューロンに対応する興味やROIの新しい領域を確立します。各ROIと各画像に対応する各画素の平均全比の値は、個々のROI（セル）用の比率の蛍光値の記録を取得します。
   4. グラフのprogrに各ROIに対応する比率の蛍光値をエクスポート個々の録画をグラフ化するには午前。
   5. 適切なデータ分析やグラフ作成ソフトウェアを使用して、各刺激に応答して蛍光比の上昇の大きさを推定するために、対応する計算を行います。

ミトコンドリアのCa ^2+濃度の3生物発光イメージング

1. mitGAmutプラスミドと培養海馬神経細胞のトランスフェクション。
   注：細胞は、まず、ミトコンドリア標的化配列および緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合し^た Ca 2+結合部位を欠く突然変異したエクオリンを含むmitGAmutプラスミドでトランスフェクトされています。この構造は、ミトコンドリアのCa ²⁺取り込みの大きな上昇を検出し、GFP蛍光によってトランスフェクトされた細胞の同定を可能にします。プラスミドが開発され、親切P.Brûletおよび共同研究者^18（CNRS、パリ、フランス）から提供されました。
   1. ウシ胎児血清を欠いている、神経基礎培養培地を含む、神経基本TFを準備し、B27、gentamicおよび2mM L-グルタミン。
   2. 神経基礎TF50μlのプラスバイアル（溶液A）で2.5μlのトランスフェクション試薬を準備します。 50神経基本TFμlのプラス4μgのバイアル中mitGAmutプラスミド（溶液B）を用意します。振盪せず、20分の間に混合できるように溶液Aの上に静かにB液を追加します。
   3. 新鮮な神経基礎TFの200μLを含む新しいmultidishプレートに海馬ニューロンを含むカバースリップを転送します。
   4. すべてのカバーガラスの上にドロップすることにより溶液A + B100μlのドロップを追加します。 30分間インキュベートします。メディアを削除します。新鮮な神経基本TFとの細胞1回洗浄。元の神経基礎培養培地にカバースリップを返します。
   5. 効率的な発現およびプローブの標的を可能にするために、トランスフェクション後_{37ºC、5％CO} 2でさらに24時間培養ニューロン。
2. 生物発光イメージングのための試験溶液を調製します。
   1. NMDA100μMのまたは145mMのKClを含むHBS溶液を調製します（ステップ2.1）上記。 10 mMのカルシウムを含む²⁺プラス100μMをジギトニンHBS溶液を調製します。
3. セレンテラジンnのミトコンドリアを標的とエクオリンの再構成。
   1. HBSの200μLを含む4ウェルプレートにトランスフェクトされた海馬ニューロンを含むトランスファーカバースリップ。
   2. 4μMの最終濃度のために、HBSの200μlにセレンテラジン4μlのn個（200μm）を加え、穏やかに混合。 RT（25ºC）で2時間、暗所でインキュベートします。
4. ミトコンドリアの記録生物発光画像の[Ca ^2+]。
   1. 顕微鏡、ランプ、灌流系、生物発光カメラとコンピュータの電源を入れます。
   2. サーモスタット（37ºC）灌流チャンバーに再構成カバースリップを転送し、5〜10ミリリットル/分の速度で予め温めHBS溶液で連続的に灌流。
   3. 対物レンズ40倍（油、NA：1.3）を使用して、Aを発現する細胞を含む顕微鏡視野を選択FITCフィルターを用いて緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現と関連した蛍光発光によって示されるようにpoaequorins。典型的なフィールドは、1-2トランスフェクトされた細胞を含有してもよいです。 CCDカメラを用いて、GFPの蛍光画像を取り込みます。
   4. 顕微鏡光をオフにします。光の経路に位置するダイクロイック含有ボックスを削除します。励起光をオフにして、完全な暗闇のための暗ボックスを閉じます。
   5. とやテスト・ソリューションは、37ºCで事前に温めなしHBS培地5-10 ml /分で細胞を灌流。
   6. 画像処理装置で処理光子計数カメラとフォトニック放出画像ごとに10秒をキャプチャします。
   7. 各実験の最後に、残りのすべての光放射を放出するために、HBS中10mMでジギトニン0.1mMの_CaCl 2で細胞を透過性。
      注：これらのフォトニック排出量は総排出量のフォトニック、のCa ²⁺濃度の校正のために必要な値を推定するために加算されなければなりません<。/ LI>
   8. GFP関連蛍光画像とコンピ​​ュータに保管して生物発光画像は、フォトンカウンティングイメージングの前に捕獲しました。
5. ミトコンドリアの[Ca ^2+]を反映した生物発光画像の解析。
   1. 特定のソフトウェアを使用して、フォトニック排出量を定量化します。光子放出はBriniらによって記載されたアルゴリズムを使用して、ミトコンドリアの遊離Ca ^2+濃度 （の[Ca ^2+] _MIT）に変換することができる^。15。
   2. 実験およびGFP蛍光画像を開きます。実験の開始時に取り込まれた蛍光画像に応じてトランスフェクトされた細胞の形状を描くことで、特定のソフトウェアの助けを借りて、興味（ROIを）の領域を選択します。
   3. すべての画像に同じのROIを貼り付けます。各ROIの総光子放出は、各時点で各セルの蛍光発光値（L）を得るために特定のソフトウェアを用いて計算されます。
   4. すべてのフォトニックemissを追加すべての光子放出を含む生物発光画像を得るために、特定のソフトウェアを使用して、透過性をジギトニン後に得られたものを含む生物発光画像中のイオン。
   5. 計算のための特定のソフトウェアへの関心のあらゆる地域のためのフォトニック排出量の書き出し値。これを行うには、各時点でのすべてのROIのための生物発光値を計算するために、「グラフ」をクリックします。 「合計値」を選択し、「すべての画像に現在のROIを使用しています。押して、「計算します」。ワークシートに「txt.file 'とエクスポートデータを保存します。すべてのROIのために、の[Ca ^2+] _{MITは、次のアルゴリズム}を使用して計算されます。
      
      [Ca ^2+]（M）= [R +（R・K _TR） - 1] / _[K R - （R・K _R）];
      
      ここで、
      R = [L /（L _トータル λ）] ^{1 / N}
      Lは、関心のある各領域の測定時に放出された発光です。
      Lの_合計があります各関心領域について測定時にその時点での組織中に存在する数を加えた後、残りのトータル発光。 λ、K _TR、K Rおよびnは、値がエクオリン（野生型または変異）とcoelenterazin使用（野生型またはN型）だけでなく、記録温度¹⁶の組み合わせに依存する定数です。ここで使用される組み合わせについては37ºCで、（AEQとcoelenterzine nを変異させ）、我々は次の値を使用_：K R = 8.47×10 ^7、K _TR = 165.6×10 ^3を 、nは1204、λ= 0138 =。
6. 適切なデータ分析を使用して、各刺激に応答して生物発光の上昇の大きさを推定し、ソフトウェアをグラフための対応する計算を行います。

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結果

ここでは、高齢者の神経細胞での[Ca ^2+]のCa ²⁺改造および細胞質とミトコンドリアのNMDAの効果を評価するための簡単な方法を説明する。 図1は、新生ラット海馬神経細胞の単離および培養するための手順の概略を示しています。開始する前に、我々は、無菌の、ポリ-D-リジンコート、カバーガラスを準備し、4ウェルディッシュでそれらを検索する必要があります。...

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ディスカッション

細胞内Ca ²⁺の改造老化脳内の恒常性は、認知喪失に関係しているが、虚血性損傷、興奮毒性および神経変性に対する感受性を増加させました。 in vitroでこの仮説を調べるために、のCa ²⁺イメージング手順が用意されています。残念ながら、古い海馬ニューロンの生存可能な培養物は、信頼性がありません。最近では、ROSの蓄積、リポフスチン顆粒の形成、ヘテロ病巣、pJ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics