亚细胞钙荧光和生物发光成像<sup&gt; 2+</sup&gt;老年海马神经元

摘要

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

摘要

易感性相关的神经退行性疾病和局部缺血神经元细胞死亡的中老年大脑是极其增加，但负责的机制都是很知名。兴奋性毒性，认为有助于诱导既损伤神经元损害的方法，通过激活谷氨酸受体，促进^钙离子内流和线粒体^的 Ca 2+超载的介导。在细胞内^钙离子稳态细胞内^钙离子稳态或改造的显着变化可能有利于老神经细胞神经元损伤。在老化研究^的 Ca 2+重塑我们已经使用活细胞成像在大鼠海马神经元的，类似于在老化体内神经元的某些方面的长期培养物。为这个目的，海马细胞，在第一个地方，新鲜从新生大鼠海马分散并涂布于POLI-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片。然后培养物保持在控制的媒体的数天或数瓦特eeks调查年轻人和老年人的神经元，分别。第二，培养的神经元中装入fura2并进行使用数字荧光比率成像细胞内的Ca ^2+浓度的测量。第三，培养的神经元被转染质粒表达低亲和力水母发光蛋白和绿色荧光蛋白靶向线粒体串联。 24小时后，水母发光蛋白在细胞内重构与腔肠素和神经元受到生物发光成像监测线粒体^Ca 2+浓度的。这三个步骤的过程允许细胞质和线粒体^的 Ca 2+响应的监测，以相关的刺激如例如谷氨酸受体激动剂NMDA和比较是否这些和其它响应由老化的影响。此过程可产生新的见解，如何老化影响细胞溶质和线粒体^的 Ca 2+响应所选的刺激以及所选药物旨在防止神经元细胞的测试死亡年龄相关的疾病。

引言

兴奋性毒性是有助于神经元损伤和细胞死亡的神经系统损伤，如局部缺血的最重要机制之一，并且在某些神经变性疾病如阿尔茨海默氏病^1。这种类型的神经毒性的主要是对Ca介导的谷氨酸演技²⁺ -permeable，离子型NMDA受体（NMDA受体^）2。曝光培养神经元对谷氨酸的可导致兴奋性中毒^3，这会导致神经细胞凋亡^4。我们和其他人先前认为神经易受NMDA诱导的凋亡可能与发育的体外和老化^5-8变化。

它已被广泛接受的增加胞质无^Ca 2+浓度^（[Ca2 +浓度_cyt的 ）导致细胞的活化。但是，如果此温升过高和/或持续的话，它可以触发细胞死亡^9。此外，已经提出该兴奋性中毒，需要线粒体的Ca ^{2+摄取10中，由于}治疗神经元对谷氨酸诱导的细胞死亡¹¹线粒体解偶联剂保护神经元。如果线粒体占用过多的^钙离子，线粒体通透性转换孔的开放，可能会出现，导致释放细胞色素C等促凋亡因子，并诱导细胞凋亡。我们最近已表明，这种线粒体的Ca ^2+摄取直接相关的年龄依赖性易感性兴奋性毒性，通过直接测量NMDA诱导的线粒体的Ca ^2+摄取在单个海马神经元^5，其被报告在本文中的方法。海马，涉及生理过程，如学习，记忆等认知过程^12，极易受到衰老和神经退行性疾病^13。已经提出的是，数周体外后，培养海马神经元表现出了一些老化神经元¹⁴的典型特征。因此，长期培养海马神经元可以提供一个全面的模型来研究衰老增强兴奋性毒性的^钙离子介导的机制。

提出的方法的总的目标是，因此，调查在^细胞内Ca 2+体内稳态或Ca ²⁺重塑大脑老化实质性的变化包括由NMDA受体激动剂在一个长期培养海马神经元激发的差^的 Ca 2+响应。该方法包括大鼠海马神经元的培养物的详细描述和胞浆和线粒体^的 Ca 2+浓度的单个神经元的监测荧光和生物发光成像，分别。细胞内^钙离子在培养的神经元荧光成像是一个标准的程序。然而，该方法是用于子不太可靠细胞^钙测量，包括线粒体^钙 。原因包括缺乏合成探针的适当的定位和不恰当的亲和性^钙离子浓度可在线粒体从低μM级改连到毫水平的。以蛋白质作为例如水母发光蛋白的使用^钙离子探针，已经允许靶向亚细胞器和使用使用不同的coelenterazines或突变的探针缺乏具体的^钙离子结合位点¹⁵衍生物不同的^钙亲和力。以这种方式，表达线粒体靶向水母发光蛋白的生物发光成像可允许的线粒体^的 Ca 2+浓度在单个神经元的监测。然而，这个过程可能需要使用光子计数摄像机或超灵敏CCD相机对生物发光成像^16-18。这种方法可能会产生新的结果，应该在更establ确认ished大脑衰老模型作为，例如，从旧的动物的大脑切片。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

伦理声明:涉及动物主题程序已经在与欧洲的欧洲公约123 /理事会和86/609 / EEC协议批准巴利亚多利德大学动物住房设施的协议处理。

1.短期和长期的大鼠海马神经元的文化

1. 涂覆聚-D-赖氨酸的制备12毫米的玻璃盖玻片。
   1. 消毒直径12mm的玻璃盖玻片在乙醇中至少24小时。让他们在无菌条件下干燥。
   2. 分布在封口膜在培养皿条盖玻片。覆盖每个盖玻片的表面上用200μl的1mg / ml的聚D-赖氨酸。允许治疗O / N。
   3. 第二天用双蒸无菌水洗涤盖玻片，每15分钟对在无菌条件下90分钟。
   4. 填写四井multidish板500微升的Neurobasal培养基，每孔。神经基础培养基应加以补充10％胎牛血清，2％B27，1μg/ ml的庆大霉素和2mM L-谷氨酰胺。
   5. 放置盖玻片在multidish板。维持它们在湿度37ºC和_5％CO 2培养箱中直至使用。
2. 从分离新生大鼠海马神经元。
   1. 制备1.8毫升木瓜蛋白酶溶液（直接购买）在小瓶中（20微升/毫升）在无菌条件下:为了获得20微升的最终浓度/ ml，在1.8毫升Hank氏加0.6％BSA的添加约40微升木瓜蛋白酶（微升应计算根据供应商的条件）。汉克的0.6％BSA中制备通过混合85 ml的HBSS培养基用15ml的4％牛血清白蛋白（BSA，制备求解4克的BSA在100ml的HBSS）。在无菌罩准备吧。
   2. 孵育在汉克的加0.6％BSA的木瓜蛋白酶使用前30分钟，在37ºC。使用在使用前0.22μm滤器过滤溶液。
   3. 加入贝科的准备联队的F-12培养基改进的900毫升双蒸无菌水Eagle培养基粉（每升13.5克）。然后加入6克HEPES和336毫克_碳酸氢钠和用NaOH 4 N.添加无菌水，以获得一个1升溶液，并用0.20微米的聚醚砜过滤它将pH调节至7.42（PES）瓶顶过滤器。在无菌罩携带这一过程。最后饱和无菌条件下，使用前用CO ₂的溶液。存储解决方案，在4ºC，并使用它们冷冻。
   4. 安乐死新生（P0）幼鼠被斩首，并在无菌HBS中洗了头。打开用无菌剪刀的帮助下头骨。提取大脑用抹刀和联队的F-12培养基快速清洗。
   5. 使一对角切割用手术刀在每个半球（图1B）的帮助下，它携带到含有含的F-12培养基的皮氏培养皿。
   6. 放弃脑膜仔细解剖钳的帮助，并在放大镜下。
   7. 确定海马特征凹的位置上使用放大镜皮层。然后，通过从一个边境精心拉动和从它的位置用眼科剪取出分离皮层海马。
   8. 转移海马组织到一个4孔板填充用无菌汉克的介质缺乏的Ca ^{2+和Mg 2+}加0.6％BSA和清洗海马组织。如果不取出介质切割使用相同的眼科剪小块组织（约2×2毫米）。
   9. 转移海马件含有1.8 ml的预过滤的木瓜蛋白酶溶液的小瓶。然后培养他们在37ºC偶尔，轻轻摇动。 15分钟后，加入90微升DNA酶I溶液（50μg/ ml的终浓度）孵育另外15分钟。
   10. 转移组织到10ml的离心管中，并用新鲜的Neurobasal培养基洗片段。通过5毫升的塑料PIP通过组织碎片获取细胞悬液ETTE。
   11. 离心细胞悬浮液，在160×g离心5分钟。使用塑料无菌巴斯德吸管除去上清液，并小心地中止沉淀用1毫升在1毫升的Neurobasal培养基的自动移液管。
   12. 测量使用Neubauer计数室中的细胞密度。把玻璃盖玻片在纽鲍尔室。添加10微升的细胞悬浮液。确保细胞悬浮液进入腔室均匀且使得无气泡。算在显微镜下的细胞数，并执行相应的计算，以获得合适的降40-80微升含有30×10 ^3细胞 。细胞的总数量将取决于所使用的动物数量。
3. 短期和海马神经元的长期培养。
   1. 在含有500微升的Neurobasal培养基的四个井multidish板在下降了约50微升至每个前制备并保持在培养箱，围绕板30×10 ^3细胞含有一种聚-D-赖氨酸包被的，直径12mm玻璃盖玻片的multidish板的井。
   2. 维持原代海马细胞湿度37ºC和5％的_二氧化碳培养箱中培养实验之前， 在体外 2-5天（DIV，短期的，年轻的培养）或> 15 DIV（长期，老年文化），而不改变企业文化媒体。

胞质钙2.荧光成像^2+浓度

1. 准备荧光成像测试解决方案。
   1. 制备含有一个外部的HEPES缓冲盐水（HBS）溶液，以mM:氯化钠145，氯化钾_5，MgCl 2的1， _氯化钙 2 1，葡萄糖10，钠- HEPES 10（pH值为7.42）。
   2. 制备含有外部^和 Mg 2+，HEPES缓冲的盐水（HBS）溶液，以mM:氯化钠146，氯化钾5， _氯化钙 2 1，葡萄糖10和HEPES 10（pH值为7.42）。
   3. 解决的NMDA镁^2+，HEPES缓冲的盐水（HBS）在一个FINA用10μM的甘氨酸为100μM升浓度和补充它。
   4. 通过求解（以mM计）制备含有氯化钾代替NaCl的HBS溶液:氯化钾_145，MgCl 2的1， _氯化钙 2 1，葡萄糖10和HEPES 10（pH值为7.42）。
2. 海马细胞荧光钙探针fura2 / AM的装载。
   1. 以含盖玻片细胞培养掉孵化器，并与哈佛商学院中在室温通过将它们转移到含有500微升哈佛商学院的每孔一个新的四井multidish板把它们洗干净。
   2. 孵育细胞fura2 / AM4μM的在黑暗的地方（在相同的HBS介质制备）60分钟在RT（25℃）。
   3. 60分钟后，洗净盖玻片新鲜HBS网上平台。
3. 胞质的记录荧光图像的[Ca ^2+]在培养的细胞。
   1. 打开灯，显微镜，灌注系统，荧光相机和电脑。
   2. 放置在盖玻片的恒温平台在倒置显微镜阶段开12个毫米的玻璃盖玻片，并选择使用40X物镜（油，NA:1.3）的显微镜字段。连续灌注细胞在没有或有试验物质存在预温（37℃）哈佛商学院的网上平台。保持流量在约5-10毫升/分钟的速率。
      注意:对于活细胞细胞灌注系统安装在用于打开12个毫米的玻璃盖玻片的恒温平台。 8线重力驱动的灌注系统配备了一个阀控制器被用于灌注的解决方案。真空泵负责去除多余的网上平台。解决方案使用的是在管加热系统加热。
   3. 捕获背景图像的快门关闭在两个激发波长。
   4. 外延照亮细胞轮流在340和380纳米。在520nm处每5-10秒与荧光摄像头，这是由一个呋喃-2分色镜过滤记录光发射。
   5. 当记录周期​​结束，保存完整的序列Òf图像在520nm在计算机中以供进一步分析发射。
4. 分析记录荧光图像。
   1. 打开实验文件。使用aquacosmos软件，点击"率"，然后选择所需的比例范围内。计算通过在所产生的图像的像素比例的像素，以便获得比图像的序列。
   2. 通过调整"背景消除"扣除背景。按"开始计算"。
   3. 按"所有时间序列"按钮，删除感兴趣的古区（投资回报）​​。对于单个细胞定量分析，建立利益或投资回报相对应的单个神经元的新区域。在每个像素中对应于每个感兴趣区域，每个图像都平均比率值，以获得的用于各个感兴趣区（细胞）比荧光值的记录。
   4. 要绘制个人录音输出对应于每个投资回报率的比率荧光值到图形PROGR上午。
   5. 使相应的计算使用合适的数据分析估计比值的荧光的上升的大小响应于每个刺激和制图软件。

线粒体钙3.生物发光成像^2+浓度

1. 转染培养海马神经元与mitGAmut质粒。
   注:将细胞首先用含有一个线粒体靶向序列和突变的水母发光蛋白缺乏融合到绿色荧光蛋白（GFP）一个^的 Ca 2+结合位点的mitGAmut质粒。这种结构检测大上升中线粒体的Ca ^2+摄取 ，并允许转染的细胞通过GFP荧光的识别。质粒被开发和由P.Brûlet和同事^18（CNRS，巴黎）友情提供。
   1. 制备的Neurobasal TF，含有的Neurobasal培养基，缺乏胎牛血清，B27，gentamic在和2mM L-谷氨酰胺。
   2. 准备50微升的Neurobasal TF加在小瓶（溶液A）2.5微升转染试剂。制备50微升的Neurobasal TF的加4微克mitGAmut质粒在小瓶中（溶液B）。加入轻轻溶液B在溶液A允许在20分钟内搅拌，无晃动。
   3. 含转移海马神经元含200微升新鲜的Neurobasal TF新multidish板盖玻片。
   4. 一滴一滴添加100微升溶液A + B的过每盖玻片。温育30分钟。删除网上平台。洗一次细胞用新鲜的Neurobasal TF。返回盖玻片到原来的神经基础培养基。
   5. 培养神经元的另外24小时，在37ºC和_5％的CO 2染后，以允许有效表达和探头的定位。
2. 准备生物发光成像的测试解决方案。
   1. 制备含NMDA 100微米或145毫米氯化钾为HBS解决方案上述（步骤2.1）。制备含有10mM ^的 Ca 2+加毛地黄皂苷100μM的HBS溶液。
3. 重组线粒体有针对性的水母发光蛋白与腔肠素的n。
   1. 转印盖玻片含转染的海马神经元到4孔平板含有200微升的HBS。
   2. 加入4微升腔肠N（200微米），以200微升HBS的为4微米的终浓度，轻轻混匀。孵育2小时，在室温（25℃）并在黑暗中。
4. 线粒体记录生物发光图像[ ^钙 ]。
   1. 打开显微镜，灯，灌注系统，生物发光照相机和计算机。
   2. 转移重构盖玻片一个恒温（37℃）灌注腔，并在5-10毫升/分钟的速率与预先温热的HBS溶液连续灌注。
   3. 使用40倍物镜（油，NA:1.3），选择含有细胞表达的一个微观领域如图所示，通过使用FITC滤光片的绿色荧光蛋白（GFP）的表达相关的荧光发射poaequorins。典型的字段可包含1-2转染的细胞。捕获GFP荧光图像，使用CCD照相机。
   4. 关闭显微镜的光。删除含有二向色箱设在光路。关闭激发光和关闭暗框完全黑暗。
   5. 细胞灌注5-10毫升/分钟，HBS中有或无的测试解决方案预先加热至37ºC。
   6. 捕获光子发射图像，每10秒，用图像处理器处理的光子计数照相机。
   7. 在每个实验结束时，透化以释放所有其余的光子发射细胞用0.1毫洋地黄皂苷在10mM的CaCl ₂在HBS。
      注意:这些光子的排放必须相加，以便估计的总光子的排放量，在^钙离子浓度的校准所需的值<。/ LI>
   8. 在电脑与相关联的绿色荧光图像存储生物发光图像的光子计数成像前抓获。
5. 分析生物发光图像反映线粒体^钙离子浓度的。
   1. 使用特定的软件量化光子排​​放。光子排放可利用布利尼等¹⁵描述的算法转换为线粒体游离^钙离子浓度（[ ^钙 ] _MIT）。
   2. 打开实验和GFP荧光图像。感兴趣（投资回报）​​与特定的软件的帮助下通过绘制根据在实验开始捕获的荧光图像的转染细胞的形状选择的区域。
   3. 每次粘贴图像上相同的投资回报。在每个ROI总光子发射计算与特定的软件获得每个细胞在每个时间点的发光发射值（L）。
   4. 添加了所有的光子EMISS离子在生物发光图像，包括毛地黄皂苷透化，使用特定的软件，以获得含有所有光子排放生物发光图像后所得到的那些。
   5. 光子排放的利益进行计算特定软件的每个区域的出口值。要做到这一点，在为了计算生物发光值对每个ROI在每次点击"图形"。选择"总价值"和"使用当前的投资回报率的所有图像。按"计算"。保存"txt.file"和导出数据到工作表。对于每一个投资回报率，的[Ca ^2+] _MIT是使用以下算法计算:
      
      的[Ca ^2+]（M）= [R +（R·K _TR） - 1] / [K _{的R -} （R·K _R）];
      
      哪里，
      R = [L /（L _总 λ）] ^{1 / n的}
      L是在测量中的每个感兴趣区域的时间发射的发光。
      _l总为总发光加成存在于组织中当时在测量时间为每个感兴趣的区域中的计数后剩余。 λ，K _{TR，K R和n}是常数，其值取决于水母发光蛋白结合（野生型或突变）和coelenterazin使用（野生型或n型），以及在记录温度^16。对于这里使用的组合（突变AEQ和coelenterzine n）时，在37ºC，我们使用了以下值:K _{R =} ^8.47×10 7，K _TR = 165.6×10 ³中，n = 1204和λ= 0138。
6. 使相应的计算使用合适的数据的分析来估计在生物发光的上升的大小响应于每个刺激和制图软件。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

在这里，我们描述一个简单的方法来评估^的 Ca 2+重塑和NMDA对胞浆和线粒体的影响的[Ca ^2+]老年神经元。 图1示出了该过程的示意图，用于隔离和从新生大鼠中培养的海马神经元。在开始之前，我们需要准备无菌，D - 聚赖氨酸涂层的玻璃盖玻片并找到他们在一个4孔盘。接着，新生大鼠被打死，大脑中删除。分离海马后，组织精心分散使用木瓜蛋白酶。分离的细胞洗涤并...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

细胞内钙的大脑老化的重塑²⁺稳态已涉及到认知的损失，易感性增加缺血性损伤，兴奋性毒性和神经退行性疾病。为了验证这种假设在体外 ， ^钙成像程序可用。不幸的是，旧的海马神经元的活培养是不可靠的。最近，人们已经观察到大鼠海马神经元老化体内包括ROS的积聚，形成脂褐素颗粒，异色灶，活化的pJNK和p53 / p21的通路，胆固醇损失的典型标志的存在许多，和?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics