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Method Article
Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.
El objetivo de este protocolo es estudiar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidermal. Por lo tanto, se desarrollaron técnicas de análisis y proyección de imagen 3D para aislar mitocondrias nerviosas específicas y evaluar alteraciones inducidas por la enfermedad de las mitocondrias en el extremo distal de los nervios sensitivos. El protocolo combina fluorescencia inmunohistoquímica, microscopia confocal y técnicas de análisis de imagen en 3D para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Parámetros detallados se definen a través de los procedimientos con el fin de ofrecer un ejemplo concreto de cómo utilizar estas técnicas para aislar mitocondrias del nervio específico. Anticuerpos se utilizaron para etiqueta del nervio y señales mitocondriales dentro de secciones del tejido de la piel del sacador biopsias, que fue seguido por inmunofluorescencia indirecta para visualizar los nervios y las mitocondrias con una señal fluorescente verde y roja respectivamente. Se adquirieron imágenes de serie Z con microscopia confocal y análisis 3D fue utilizado para procesar y analizar las señales. No es necesario seguir los parámetros exactos descritos dentro, pero es importante ser coherentes con los elegidos a lo largo de la tinción, adquisición y análisis de los pasos. La fuerza de este protocolo es que es aplicable a una variedad amplia de circunstancias donde una señal fluorescente se utiliza para aislar otro tipo de señales que de otro modo sería imposible estudiar solos.
Las mitocondrias sirven funciones celulares vitales que incluyen la producción de energía celular, buffer de calcio y regulación necrosis y apoptosis celular muerte1,2,3. El sistema nervioso tiene una tasa metabólica alta en comparación con el cuerpo4 , lo que sugiere que las neuronas generan un alto grado de energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la respiración mitocondrial. Muchos documentos de evidencia que las funciones neuronales dependen de ATP5, especialmente en las sinapsis6. Por lo tanto, es importante la distribución de las mitocondrias dentro de las neuronas.
En los últimos 10 años que una gran cantidad de información ha demostrado que la trata y acoplamiento de las mitocondrias neuronales se regula altamente. Proteínas motoras están implicadas en la distribución de las mitocondrias a compartimentos celulares específicos a lo largo de la neurona. Trata de las mitocondrias es particularmente importante porque las neuronas proyecto axones y las dendritas del soma. Proteínas motoras quinesina dirigen principalmente anterógrada (de soma) trata de mitocondrias a lo largo de los microtúbulos y dineína proteínas motoras directas motilidad retrógrada (hacia el soma)7,8,9 , 10. hay señales celulares tal potencial de membrana mitocondrial y conducción de los impulsos que influyen en la presencia y dirección de mitocondrial tráfico11,12,13.
Además de transportar las mitocondrias, hay proteínas especializadas para localizar las mitocondrias a compartimentos celulares específicos que tienen las demandas de alta energía, tales como nodos de Ranvier y las sinapsis8,14, 17. de hecho, la mayoría de las mitocondrias dentro de axones son no-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocondrias de anclaje syntaphilin a microtúbulos a lo largo de axones mientras que otras proteínas de anclaje las mitocondrias a la actinia citoesqueleto19–21. Iones como el calcio y factores de crecimiento se han divulgado para apoyar la cesación del movimiento de las mitocondrias para localizar a las regiones donde son necesarios21,22,23.
Tomados en conjunto, la trata y acoplamiento de las mitocondrias son vitales para el funcionamiento correcto de las neuronas. En apoyo de esto, interrupción en el tráfico mitocondrial se ha asociado con varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Huntington, espástica hereditaria paraparesia y atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudios recientes se han centrado en la patología y disfunción mitocondrial como un mecanismo potencial para la neuropatía diabética, la pérdida sensorial asociada con diabetes28,29,30,31 ,32,33. La hipótesis es que la diabetes altera la distribución de las mitocondrias dentro de las proyecciones sensoriales del conclusión de nervio cutáneo. Por lo tanto, se desarrolló una técnica para visualizar y cuantificar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas de intraepidermal (IENFs), las extremidades distales de los aferentes sensoriales del ganglio de raíz dorsal. La técnica combina fluorescencia inmunohistoquímica específica mitocondrial y etiquetas fibra de nervio con microscopia confocal de la serie z adquisición de señales con software de análisis de imagen en 3D de gran alcance para medir la distribución del nervio específico mitocondrias de las biopsias del sacador cutáneo humano para lograr este objetivo.
las biopsias del sacador de la piel fueron obtenidas de sujetos que fueron reclutados de una red de gran atención primaria comunitaria en el centro de Diabetes de la Universidad de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan y el cumplimiento de los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de cada sujeto antes de la prueba por escrito.
1. inmunohistoquímica de fluorescencia
día 1:
día 2:
día 3:
2. Proyección de imagen confocal
3. visualización en 3D y análisis de las mitocondrias dentro de fibras de nervio humano Intraepidermal
Visualización y cuantificación de las mitocondrias dentro de IENFs humanos
Inmunohistoquímica de fluorescencia permite la rotulación simultánea de múltiples señales en las biopsias de la piel humana para visualizar los nervios, las mitocondrias y núcleos. Una placa de 96 pocillos es una manera conveniente de organizar los pasos en el procedimiento de inmunohistoquímica. La figura 1<...
Este protocolo está diseñado para aislar, cuantificar y analizar el tamaño y la distribución de las mitocondrias del nervio específico dentro de IENFs en 3D de las biopsias de la piel humana. Hay varios pasos críticos en el protocolo. La inmunohistoquímica de fluorescencia flotante está diseñado para la mancha y analizar varias señales en cada muestra, proporcionando una metodología más versátil para la investigación exploratoria44,45. Este procedim...
No hay conflictos de intereses.
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el programa de investigación de Neurología & descubrimiento y el Instituto A. Alfred Taubman Medical Research en la Universidad de Michigan. Este trabajo utiliza la morfología y la base de análisis de imagen del centro de investigación de la Diabetes de Michigan, financiado por los institutos nacionales de salud beca 5P 90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón. Los autores desean agradecer a J. Robinson Singleton y Gordon A. Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA | MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
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