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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo utilizza tecniche di imaging e l'analisi tridimensionali (3D) per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Le tecniche sono applicabili ad altre situazioni in cui un segnale fluorescente viene utilizzato per isolare un sottoinsieme di dati da un altro segnale fluorescente.

Abstract

L'obiettivo del presente protocollo è quello di studiare i mitocondri all'interno di fibre nervose intraepidermiche. Pertanto, le tecniche di imaging e l'analisi 3D sono state sviluppate per isolare i mitocondri del nervo specifico e valutare le alterazioni indotte da malattia dei mitocondri nella parte distale dei nervi sensoriali. Il protocollo combina fluorescenza immunoistochimica, microscopia confocale e tecniche di analisi di immagine 3D per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Parametri dettagliati sono definiti in tutto le procedure al fine di fornire un esempio concreto di come utilizzare queste tecniche per isolare i mitocondri del nervo specifico. Gli anticorpi sono stati utilizzati per etichettare il nervo e segnali mitocondriali all'interno di sezioni di tessuto di pelle punch biopsie, che è stata seguita dall'immunofluorescenza indiretta per visualizzare i nervi ed i mitocondri con un segnale fluorescente verde e rosso rispettivamente. Z-serie di immagini sono state acquisite con microscopia confocale e software per l'analisi 3D è stato utilizzato per elaborare e analizzare i segnali. Non è necessario seguire i parametri esatti descritti all'interno, ma è importante essere coerenti con quelle scelte durante la colorazione, la procedura di acquisizione e analisi. La forza di questo protocollo è che è applicabile a una vasta gamma di circostanze in cui viene utilizzato un segnale fluorescente per isolare altri segnali che altrimenti sarebbe impossibili studiare da soli.

Introduzione

I mitocondri servono funzioni cellulari vitali che includono la produzione di energia cellulare, buffering di calcio e che regolano necrotico e apoptotica delle cellule morte1,2,3. Il sistema nervoso ha un alto tasso metabolico rispetto al corpo4 suggerendo che i neuroni generano un elevato grado di energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) attraverso la respirazione mitocondriale. Un sacco di documenti di prova che funzioni neuronali sono dipendente da ATP5, soprattutto presso le sinapsi6. Pertanto, la distribuzione dei mitocondri all'interno dei neuroni è importante.

Negli ultimi 10 anni che un sacco di informazioni ha dimostrato che il traffico e l'ancoraggio dei mitocondri di un neurone è altamente regolamentati. Proteine motrici sono coinvolti nella distribuzione di mitocondri a specifici compartimenti cellulari in tutto il neurone. Traffico dei mitocondri è particolarmente importante perché neuroni proiettano assoni e dendriti lontano dal soma. Proteine motrici chinesina principalmente diretto anterogrado (lontano il soma) tratta dei mitocondri lungo i microtubuli mentre dineina proteine motore diretto motilità retrograda (verso il soma)7,8,9 , 10. ci sono segnali cellulari un potenziale di membrana mitocondriale e conduzione di impulso che influenzano la presenza e la direzione di traffico mitocondriale11,12,13.

Oltre a trasportare i mitocondri, ci sono proteine specializzate per localizzare i mitocondri a specifici compartimenti cellulari che hanno richieste di alta energia, come nodi di Ranvier e sinapsi8,14, 17. In realtà, la maggior parte dei mitocondri all'interno di assoni è non motili9,13,18. Proteine specializzate come i mitocondri di ancoraggio syntaphilin i microtubuli lungo gli assoni, mentre altre proteine di ancoraggio mitocondri al actina citoscheletrica19–21. Ioni come il calcio e fattori di crescita sono stati segnalati per supportare la cessazione della circolazione di mitocondri per localizzarli in regioni dove sono necessari21,22,23.

Presi insieme, il traffico e l'attracco dei mitocondri sono vitali per il corretto funzionamento dei neuroni. A sostegno di ciò, interruzioni nel traffico mitocondriale sono stato associato con parecchi termini neurologici compreso la malattia di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth, malattia di Huntington, spastica ereditaria paraparesis e atrofia ottica15,24,25,26,27. Recenti studi hanno messo a fuoco su disfunzione mitocondriale e la patologia come un meccanismo potenziale per la neuropatia diabetica, la perdita sensitiva connessa con diabete28,29,30,31 ,32,33. L'ipotesi è che il diabete altera la distribuzione dei mitocondri all'interno delle proiezioni sensoriali del terminale nervoso cutaneo. Di conseguenza, una tecnica è stata sviluppata per visualizzare e quantificare i mitocondri all'interno le fibre nervose intraepidermiche (IENFs), la punta distale delle afferenze sensoriali del ganglio di radice dorsale. La tecnica combina fluorescenza immunoistochimica di specifici mitocondriali ed etichette di fibre nervose con microscopia confocale serie z acquisizione di segnali con software di analisi di immagine 3D potente per misurare la distribuzione del nervo specifico mitocondri da biopsie cutanee umane per raggiungere questo obiettivo.

Protocollo

biopsie di pelle sono state ottenute da soggetti che sono stati reclutati da una rete di grandi cure primarie comunitario presso l'Università dello Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Questo studio è stato approvato dalla Università del Michigan Institutional Review Board e rispettato i principi della dichiarazione di Helsinki. Scritto il consenso informato è stato ottenuto da ciascun soggetto prima del test.

1. fluorescenza immunoistochimica

  1. preparare le biopsie del punzone per intraepidermal fibre nervose immunohistochemistry:
    1. pelle di 3 mm di eseguire biopsie di medico personale e posizionare la biopsia tutta in 1.5 mL Zamboni ' soluzione fissante s (paraformaldeide al 2%, 0,3% saturato di acido picrico in tampone fosfato salino (PBS), pH 7.4) a 4 ° C durante la notte.
    2. Sciacquare i campioni con una soluzione di saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C per 16-24 h o fino a che il campione scende.
    3. Incorpora i campioni a temperatura ottimale di taglio composto (OCT) utilizzando un cryomold. Posizionare la biopsia intero 3 mm con l'epidermide rivolto verso il basso nello stampo e riempire lo stampo con circa 2 mL di ott. Freeze lo stampo su ghiaccio tritato a secco. Conservare a-80 ° C fino all'uso.
    4. Cut 50 µm spessore utilizzando un criostato sezioni trasversali e memorizzare in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti utilizzando unità di storage antigelo 180 µ l per pozzetto (glicole etilenico 30%, 30% glicerolo in PBS). Le seguenti indicazioni sono per 8 pozzetti di una piastra ben 96. Macchia sezioni da ogni sito di biopsia che sono 200-300 µm da altro.

1 ° giorno:

  1. placare il contrassegno non specifico dello strato corneo:
    1. etichetta 96 pozzetti come mostrato in Figura 1.
    2. Dispensare 150 µ l di soluzione enhancer stock segnale per ridurre il legame non specifico di anticorpi secondari 34 , 35 in ciascun pozzetto. Trasferire le sezioni nella soluzione di potenziatore di segnale utilizzando un'ansa da inoculo.
      Nota: fare attenzione mentre si lavora con il tessuto per evitare di danneggiare o strappare le sezioni di tessuto. Mantenere in soluzione di potenziatore di segnale per 30 minuti a temperatura ambiente su un piatto rocker.
    3. Preparare risciacquo pozzi nelle righe 2 e 3 della piastra 96 pozzetti aggiungendo 150 µ l di tampone fosfato salino (PBS): 1x in ciascun pozzetto.
    4. Trasferire con cautela le sezioni in riga 2 e risciacquo in 1X PBS per 10 min a temperatura ambiente.
    5. Risciacquare una seconda volta in 1X PBS per 10 min a temperatura ambiente (riga 3).
  2. Preparare 5% albumina di siero bovino (BSA) soluzione bloccante:
    1. preparare 5% soluzione contenente 5% BSA di blocco e lo 0,3% Triton X 100 (TX-100) in 0.1 M PBS (Vedi tabella 1) mentre sezioni sono incubando soluzione di potenziatore di segnale. BSA non entrare facilmente in soluzione. Soluzione di vortice fino a BSA si dissolva completamente.
    2. Preparare blocchi pozzi nella riga 4 della piastra 96 pozzetti aggiungendo 150 µ l di soluzione bloccante in ciascun pozzetto di 5% BSA.
    3. Trasferire sezioni nei singoli pozzetti di BSA 5% soluzione di blocco e incubare sezioni in 5% BSA blocco soluzione per 1-2 h a temperatura ambiente su un piatto rocker.
  3. Preparare 1% BSA risciacquo soluzione e diluizione di anticorpi primari:
    1. preparare 1% soluzione per sciacqui contenente BSA 1% e lo 0,3% TX-100 in 0.1 M PBS (Vedi tabella 2) mentre le sezioni sono incubazione in soluzione al 5% BSA blocco. BSA non entrare facilmente in soluzione. Soluzione di vortice fino a BSA si dissolva completamente.
    2. Diluire gli anticorpi primari in soluzione per sciacqui BSA 1%, mentre le sezioni sono incubando in soluzione al 5% BSA blocco.
      1. Fare 1.500 µ l di soluzione di anticorpo primario e aggiungere a ciascuna bene nella riga 5.
      2. Diluire gli anticorpi primari: utilizzare l'etichetta specifica del nervo, coniglio policlonale anti-proteina gene prodotto 9.5 (PGP 9.5) a 1:1, 000. Utilizzare l'etichetta di mitocondrio-specifica, mouse dell'anticorpo di E2/E3bp monoclonale anti-piruvato deidrogenasi (PDH) a 1: 100 in 1% BSA risciacquo soluzione.
  4. Preparare anticorpo primario:
    1. dispensare 150 µ l di anticorpo primario in ogni bene in fila 5 della piastra 96 pozzetti.
    2. Utilizzando lo strumento loop, trasferire sezioni dalla soluzione bloccante (riga 4) nella riga 5 contenente l'anticorpo primario.
    3. Avvolgere la piastra strettamente con parafilm per tenerlo da asciugare.
    4. Campioni su piatto rocker a temperatura ambiente per 1 h e poi incubare i campioni a 4 ° c su un rocker piatto durante la notte.

2 ° giorno:

  1. risciacquare campioni:
    1. preparare pozzi di risciacquo nelle righe 6, 7 e 8 della piastra 96 pozzetti aggiungendo 150 µ l di BSA 1% soluzione di risciacquo in ogni pozzetto.
    2. Trasferire sezioni in primo 1% soluzione per sciacqui BSA (riga 6) e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Ripetere i risciacqui due volte più incubando sezioni in BSA 1% soluzione di risciacquo in righe 7 e 8 per ogni 1h a temperatura ambiente.
  2. Diluire anticorpi secondari in BSA 1% soluzione di risciacquo:
    1. fare 1.500 µ l di soluzione di anticorpo secondario mentre sezioni sono incubando nell'ultimo risciacquo di BSA 1% risciacquo soluzione (riga 8).
    2. Diluire anticorpi secondari: per PGP 9.5 (anticorpo anti-coniglio di capra coniugata con verde fluorescente, 1: 1000), per PDH (rosso-fluorescente coniugati capra anti-topo, 1:1, 000) in 1% BSA risciacquo soluzione.
  3. Preparare anticorpo secondario:
    1. dispensare 150 µ l di anticorpo secondario nella riga 9 della piastra a 96 pozzetti.
    2. Trasferire delicatamente le sezioni da 1% BSA risciacquo soluzione (riga 8) nei pozzetti di anticorpo secondario (riga 9).
    3. Using parafilm, avvolgere la piastra strettamente per tenerlo da asciugare. Coprire con carta stagnola. Posizionare il campione sul piatto rocker a temperatura ambiente per 1 h e poi incubare i campioni a 4 ˚ c su un rocker piatto durante la notte.

giorno 3:

  1. preparare pulire 1X PBS filtrando attraverso un filtro da 0,22 µm:
    1. dispensare 150 µ l di filtrato 1X PBS nella riga 10, 11 e 12.
    2. Trasferire campioni per riga 10 e risciacquare in 1X PBS per 1 h a temperatura ambiente. Coprire la piastra a 96 pozzetti con carta stagnola e mettere su un piatto rocker durante il risciacquo. Ripetere filtrata 1x risciacquo PBS due volte di più per 1 h a temperatura ambiente in righe 11 e 12.
  2. Preparare vetrini da microscopio per il montaggio di sezioni di tessuto:
    1. mettere 50 µ l di filtrato 1X PBS su una diapositiva.
      2. Goccia di
    2. sezione trasferimento da 1X PBS (riga 12) nella 50 µ l. Posizionare con attenzione la sezione nella goccia di PBS da svolgersi il tessuto e delicatamente l'appiattimento su lastra di vetro. Rimuovere l'eccesso di PBS con una pipetta di vetro per evitare di diluire il reagente di montaggio. Non toccare le sezioni con il bulbo di vetro.
    3. Pipetta da 1 - 2 gocce di reagente di montaggio contenente DAPI direttamente sopra la sezione sul microscopio diapositiva utilizzando cura per non disturbare l'orientamento della sezione. Posizionare delicatamente 50 mm x 24 mm #1.5 microscopio vetrino coprioggetti sopra la sezione.
    4. Cancellare eventuali bolle d'aria che formano pur ponendo il vetrino coprioggetto e asciugare il liquido in eccesso fuori dai bordi del coprivetrino. Preparare una nuova diapositiva e ripetere il montaggio process per ogni sezione.
    5. Cura/a secco il supporto di montaggio inserendo le diapositive nel buia durante la notte a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini a 4 ° C per a breve termine (1-2 settimane) o a-20 ° C per la conservazione a lungo termine (superiore a 2 settimane).
      Nota: Controlli negativi omessi gli anticorpi primari per PGP 9.5 o PDH nel passaggio 1.4.2.2 e non visualizzata alcuna etichettatura distinguibili dei nervi o mitocondri nell'epidermide. Positivi i controlli sono stati effettuati per il PDH anticorpo per dimostrarlo etichette tutti i mitocondri (dati non mostrati). Controlli positivi sono stati effettuati su neuroni del ganglio di radice dorsale coltivati primari del topo che erano trasdotte con un baculovirus ai mitocondri di etichetta con un segnale di proteina fluorescente verde (GFP) e quindi fissi e macchiati con l'anticorpo PDH e rosso fluorescente anticorpo secondario. Tutti i mitocondri che esprimevano GFP sono stati co-etichettati con l'etichetta rossa per PDH immunohistochemistry (dati non mostrati).

2. Formazione immagine confocal

  1. eseguire imaging confocale:
    1. raccolta immagini utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo a immersione in olio (apertura numerica 1.25 (N.A.)) su un microscopio invertito a 40x di scansione laser.
      1. a ogni piano focale in sequenza di acquisire il segnale fluorescente:
        Nuclei: eccitazione λ = 405 nm, emissione spettrale filtro λ = 420-480 nm
        fibre nervose: eccitazione λ = 488 nm, emissione spettrale filtro λ = 505-560 nm
        Mitoch moda: eccitazione λ = 543 nm, emissione spettrale filtro λ = 606-670 nm
    2. inserire i seguenti parametri di scansione nel software microscopio: velocità di scansione di 600 Hz con 2 averaging frame e zoom di 2,2; risoluzione di intensità 12 bit (4096 grigio livelli).
      1. Impostare il software di microscopio per ottimizzato risoluzione laterale (risoluzione di scansione = 1.024 x 1.024) e ottici ad alta risoluzione assiali di sezionamento (confocale apertura = 1 unità arioso (AU) con dimensioni di z-passaggio di 210 nm).
        Nota: La risoluzione XYZ risultante è 172,2 nm x 172,2 nm, x 210 nm con una dimensione di immagine di 176,1 µm x 176,1 µm x 30-50 µm.
    3. Attivare una scansione diretta per il segnale del nervo (verde-fluorescenza) e regolare il controllo di z-messa a fuoco per trovare e impostare la parte superiore e inferiore piani focali nel software microscopio che comprendono il segnale del nervo all'interno della sezione di tessuto. La z-gamma totale è in genere 30-50 µm per una sezione di tessuto 50 µm.
    4. Ruotare il campo di scansione con il software di microscopio durante una scansione diretta in modo che l'epidermide è posizionato orizzontalmente o verticalmente nell'immagine.
    5. Scansione ogni segnale separatamente e regolare il rivelatore (tubo di fotomoltiplicatore, PMT) tensione e offset per ridurre al minimo o rimuovere qualsiasi sopra e sotto pixel saturo.
      Nota: I tempi di scansione con i parametri sopra prendono circa 20-40 min a seconda del numero di fette z.

3. 3D di visualizzazione e analisi dei mitocondri all'interno umano Intraepidermal fibre nervose

  1. isolare l'epidermide 3D:
    1. duplicare l'immagine originale e utilizzare la massima intensità proiezione (vista di messa a fuoco estesa) dell'immagine per identificare e isolare l'epidermide.
    2. Utilizzare una regione di strumento di interesse per traccia lungo i bordi superiori e inferiori dell'epidermide per rimuovere aree indesiderate come il corneum dello strato e il derma che sono assenti di fibre nervose intraepidermiche. Ritaglia questo.
  2. Deconvoluzione uso sul nervo e segnali fluorescenti mitocondriali:
    Nota: deconvoluzione aiuta a ripristinare l'integrità dei segnali fluorescenti. Il restauro utilizzato in questo protocollo viene chiamato deconvoluzione cieco perché utilizza i segnali fluorescenti nelle immagini per determinare quanto i segnali diffuso dalla loro fonte originale (funzione di diffusione di punto). Il processo migliora la risoluzione del segnale riassegnando il segnale diffuso torna alla sua posizione di origine.
    1. Calcola un punto sparsa di funzione (PSF) per il segnale del nervo fluorescente verde (verde-fluorescenza) con i seguenti parametri:
      1. impostare PSF calcolato confocale. Impostare l'indice di rifrazione medio alla apertura 1.515 e numerica a 1.25. Impostare foro stenopeico detector 1 unità arioso (A.U.). Lunghezza d'onda di eccitazione laser set a 488 nm ed emissione lunghezza d'onda a 515 nm.
    2. Calcolare un PSF per il segnale mitocondriale fluorescente rosso (rosso-fluorescenza) con i seguenti parametri:
      1. Set calcolati PSF a confocale. Impostare l'indice di rifrazione medio alla apertura 1.515 e numerica a 1.25. Impostato su 1 foro stenopeico detector AU. Lunghezza d'onda di eccitazione laser set a 543 nm ed emissione lunghezza d'onda a 617 nm.
    3. Ottimizza i segnali fluorescenti del nervo ed i mitocondri di deconvoluzione utilizzando il PSFs corrispondente elencati sopra e funzione iterativa ripristino impostato al 100% di fiducia e un limite di iterazione di 10 cicli.
  3. Creare superfici specifiche del nervo:
    1. uso il " creare superficie " strumento per rendere una superficie solida dei nervi da Quantificaizone verde-fluorescente secondaria etichettatura del PGP 9.5 identificato nervi.
    2. Deselezionare la " liscia " dispongono e utilizzare la funzionalità di intensità assoluta per impostare la soglia per il segnale del nervo dal momento che è significativamente più luminosa di fluorescenza di fondo.
    3. Utilizzare la funzionalità di intensità assoluta per impostare la soglia per il segnale del nervo dal momento che è significativamente più luminosa di fluorescenza di fondo. Impostare il valore di soglia abbastanza basso per identificare con precisione i nervi.
    4. Filtro su superfici piccole, non-nervo basato su dimensione.
      Nota: Se necessario, modificare manualmente ulteriori superfici non-nervo all'interno del " modifica " scheda tenendo premuto il tasto CTRL per selezionare più oggetti e quindi eliminarli con il tasto CANC.
  4. Isolate del nervo specifico segnale mitocondriale fluorescente:
    1. selezionare la scheda modifica della superficie del nervo per visualizzare il " maschera proprietà " caratteristica. La superficie del nervo creata nei passaggi da 3.3 viene utilizzata per isolare i mitocondri all'interno di quei nervi lontano da segnali mitocondriali associati con i keratinocytes.
    2. Come la " maschera tutti ' pulsante apre un " canale maschera " finestra, scegliere l'elenco a discesa sotto il segnale rosso fluorescente Quantificaizone " selezione del canale " per il segnale mitocondriale.
    3. Fare clic nella casella per mettere un segno di spunta " canale duplicato prima di applicare la maschera " opzione.
    4. Clic sulla radio pulsante di fronte il " costante all'interno/esterno " opzione delle impostazioni della maschera e fare clic nella casella per mettere un segno di spunta " impostare voxel fuori superficie per " opzione e digitare 0.00 per il valore. Pulsante fare clic su OK per creare il nuovo canale che rappresenta mitocondriali segnali all'interno della superficie del nervo.
  5. Creare superfici mitocondrio-specifica:
    1. uso il " creare superficie " strumento per rendere una superficie solida dei mitocondri dal canale appena creato fluorescente dei segnali del nervo specifico mitocondriali da passi 3.4.
    2. Deselezionare la " liscia " dispongono e selezionare il " sfondo sottrazione " funzione per impostare la soglia. Questa funzionalità utilizza il contrasto locale intorno il segnale mitocondriale per identificare i mitocondri da background.
      3. Valore di soglia
    3. set abbastanza basso per identificare con precisione i mitocondri. In questo esempio la soglia inferiore è stata fissata a 2.000 per una scala di 16 bit (65.536).
    4. Mitocondriale superficie basati sulla dimensione del filtro. In questo esempio che il limite di voxel era impostato su 1,0 voxel, che è il più basso limitare possibili. Se necessario, modificare manualmente su superfici non-mitocondri all'interno del " modifica " scheda tenendo premuto il tasto CTRL per selezionare più oggetti e quindi eliminarli con il tasto CANC.
      Nota: In alcuni casi, il software verrà create le superfici che non sono associate con un segnale mitocondriale fluorescente distinguibile. In questi casi, è possibile rimuoverli con il " modifica " Tab.
  6. Esportare e calcolare i valori morfometrici per analisi:
    1. esportare i valori per il nervo e superfici mitocondriale dalla " Statistiche " scheda per ulteriori analisi con software del foglio elettronico.
    2. Esportare i valori di volume per il nervo e superfici mitocondriale.
    3. Contare il numero di singole fibre nervose presenti in ogni immagine e registrare il valore del foglio di calcolo elettronico.
    4. Per ogni immagine, calcolare i seguenti valori potenziali per l'analisi del foglio di calcolo elettronico:
      1. sommare i volumi per tutte le superfici del nervo.
      2. Filtro nervose specifiche superfici mitocondriale sotto un volume di meno di 0,02 µm 3 e bin le superfici di dimensioni. Ad esempio, utilizzare bidoni come 0,02 - 0,04, 0.04 - 0.08, 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1,28, 1.28-2.56, maggiore di 2,56 µm 3.
        Nota: Il limite inferiore del volume mitocondriale è stato impostato su 0,02 µm 3 basato su volumi precedentemente pubblicati di mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Contare il numero di superfici mitocondriale del nervo specifico all'interno di ciascuna collocazione e il numero totale delle superfici sopra i bidoni (0.02 - maggiore di 2,56 µm 3).
      4. Calcolare la proporzione di nervo specifiche superfici mitocondriale in ciascuna collocazione. Utilizzare il conteggio a bin diviso per il numero totale delle superfici di mitocondri.
      5. Sum i volumi per tutte le specifiche del nervo mitocondriale superfici.
      6. Calcolare la proporzione del nervo con segnale mitocondriale dividendo il volume di superficie totale del nervo dalla somma di tutti i volumi di superficie mitocondriale.
      7. Calcolare il numero di mitocondri per volume di nervo dividendo il volume di superficie totale del nervo per il conteggio di tutte le superfici mitocondriale.

Risultati

Visualizzazione e quantificazione dei mitocondri all'interno di IENFs umano

Fluorescenza immunoistochimica permette l'etichettatura simultanea di molteplici segnali entro le biopsie della pelle umana per visualizzare i nervi, i mitocondri e nuclei. Una piastra a 96 pozzetti è un modo pratico per organizzare i passaggi della procedura di esame immuno-istochimico. La figura 1 Mostra ...

Discussione

Questo protocollo è progettato per isolare, quantificare e analizzare la dimensione e la distribuzione dei mitocondri nervose specifiche all'interno di IENFs in 3D da biopsie di pelle umana. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Immunohistochemistry digalleggiante fluorescenza è stato progettato per macchiare ed analizzare i segnali multipli in ogni campione, offrendo una metodologia più versatile per ricerca esplorativa44,45. Questa procedura conse...

Divulgazioni

Senza conflitti di interesse di dichiarare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da NS061039 di istituti nazionali di salute sovvenzioni K08-01A2, il programma per la ricerca di neurologia & scoperta e r. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l'Università del Michigan. Questo lavoro utilizzato la morfologia e il nucleo di analisi di immagine del Michigan diabete Research Center, finanziato da istituti nazionali di salute Grant 5P 90 DK-20572 dall'Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali. Gli autori vorrei ringraziare J. Robinson Singleton e r. Gordon Smith (Università dello Utah) per la loro generosa donazione di campioni di pelle umana.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2% Zamboni's FixativeNewcomer Supply, Middleton, WI 1459A2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP399-4To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsI36933enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APabbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)abcam, Cambridge, MAab110333abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugateThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11034red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11032green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine SerumSigma-Aldrich, St. Louis, MOA7906-100abbreviated as BSA
Triton X- 100Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT9284abbreviated as TX-100
0.22 µm FilterEMD Millipore, Billerica
MA		MILLEX GP SLGP 033NS0.22 µm Millipore filter
Parafilm MFisher Scientific, Pittsburgh, PA13-374-10Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated LoopFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-032092inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay PlateCorning Incorporated, Corning, NY360396-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPIThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsP-36931DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-544ECoverslips
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-550-15Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal MicroscopeLeica Microsystems, Buffalo Grove, ILSP5Confocal Microscope
Volocity x64 Software Perkin Elmer, Waltham , MAversion 4.4.0Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis SoftwareBitplane, Concord, MAversion 7.7.1Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
ExcelMicrosoft, Redmond, WAversion Office 2013Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature CompoundSakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA4583abbreviated as OCT
Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

Riferimenti

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