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Method Article
Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.
O objetivo do presente protocolo é estudar as mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas. Portanto, desenvolveram-se técnicas de análise e geração de imagens 3D para isolar o nervo específico mitocôndrias e avaliar alterações induzida por doença da mitocôndria na ponta distal dos nervos sensoriais. O protocolo combina imuno-histoquímica da fluorescência, microscopia confocal e técnicas de análise de imagem 3D para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. Parâmetros detalhados são definidos em todos os procedimentos a fim de fornecer um exemplo concreto de como usar essas técnicas para isolar o nervo específico mitocôndrias. Anticorpos foram usados para rotular o nervo e mitocondriais sinais dentro de seções de tecido da pele soco biópsias, que foi seguido por imunofluorescência indireta para visualizar os nervos e as mitocôndrias possuem um sinal fluorescente verde e vermelho, respectivamente. Z-série imagens foram adquiridas com microscopia confocal e software de análise 3D foi usado para processar e analisar os sinais. Não é necessário seguir os parâmetros exatos descritos dentro, mas é importante ser consistente com os escolhidos durante a coloração, etapas de aquisição e análise. A força deste protocolo é que é aplicável a uma ampla variedade de circunstâncias onde um sinal fluorescente é usado para isolar outros sinais que seriam impossíveis estudar sozinho.
As mitocôndrias servem as funções celulares vitais que incluem a produção de energia celular, tampão cálcio e regulando necrótico e apoptose celular morte1,2,3. O sistema nervoso tem uma alta taxa metabólica, em comparação com o corpo4 , sugerindo que os neurônios geram um alto grau de energia celular na forma de adenosina trifosfato (ATP) através da respiração mitocondrial. Um monte de documentos de prova que funções neuronais são dependentes de ATP5, especialmente no sinapses6. Portanto, a distribuição de mitocôndrias dentro neurônios é importante.
Nos últimos 10 anos que um monte de informações mostrou que o tráfico e encaixe de mitocôndrias neuronais é altamente regulamentados. Proteínas do motor estão envolvidas na distribuição de mitocôndrias de compartimentos celulares específicos ao longo do neurônio. Tráfico de mitocôndrias é particularmente importante porque os neurônios projeto axônios e dendritos, longe do soma. Motor proteínas cinesina direto principalmente anterógrada (afastando-se da soma) tráfico de mitocôndrias ao longo dos microtúbulos, enquanto Dineína proteínas motor direto da motilidade retrógrada (em direção o soma)7,8,9 , 10. existem sinais de celulares como um potencial de membrana mitocondrial e condução do impulso que influenciam a presença e a direção de mitocondrial de tráfico11,12,13.
Além de transportar as mitocôndrias, existem proteínas especializadas para localizar as mitocôndrias de compartimentos celulares específicos que têm demandas de alta energia, tais como nós de Ranvier e sinapses8,14, 17. na verdade, a maioria das mitocôndrias dentro axônios são non-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocôndrias de âncora syntaphilin de microtúbulos ao longo do axónio enquanto outras mitocôndrias de âncora de proteínas para o citoesqueleto de actina19–21. Íons como cálcio e fatores de crescimento têm sido relatados para apoiar a cessação do movimento de mitocôndrias localizá-los para regiões onde eles são necessários21,22,23.
Tomados em conjunto, o tráfico e o encaixe da mitocôndria são vitais para o bom funcionamento dos neurônios. Para apoiar isso, interrupção no tráfico mitocondrial tem sido associada com várias condições neurológicas, incluindo a doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Huntington, espástica hereditária paraparesia e atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudos recentes têm-se centrado na disfunção mitocondrial e patologia como um mecanismo potencial para neuropatia diabética, a perda sensorial associada com diabetes28,29,30,31 de32, ,33. A hipótese é que o diabetes altera a distribuição de mitocôndrias dentro as projeções sensoriais do nervo cutâneo. Portanto, uma técnica foi desenvolvida para visualizar e quantificar as mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas (IENFs), as pontas distais da raiz dorsal gânglio sensorial afferents. A técnica combina fluorescência immunohistochemistry específicos mitocondrial e rótulos de fibras nervosas com aquisição de z-series de microscopia confocal de sinais com software de análise de imagem 3D poderosa para medir a distribuição do nervo específico mitocôndrias de biópsias de soco cutâneo humano para atingir esse objetivo.
biópsias de pele soco foram obtidas a partir de temas que foram recrutados a partir de uma rede de grandes cuidados primários baseada na Comunidade, no centro de Diabetes da Universidade de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Michigan e respeitado os princípios da declaração de Helsinque. Escrito consentimento informado foi obtido de cada assunto antes do teste.
1. imuno-histoquímica da fluorescência
dia 1:
dia 2:
dia 3:
2. Imagem latente confocal
3. 3D visualização e análise de mitocôndrias dentro humano fibras nervosas intraepidérmicas
Visualização e quantificação das mitocôndrias dentro de IENFs humanas
Imuno-histoquímica da fluorescência permite a marcação simultânea de múltiplos sinais dentro de biópsias de pele humana para visualizar os nervos, mitocôndrias e núcleos. Uma placa de 96 poços é uma maneira conveniente de organizar as etapas do procedimento de imuno-histoquímica. A Figura 1 mostra...
Este protocolo é projetado para isolar, quantificar e analisar o tamanho e a distribuição de mitocôndrias de nervo específico dentro IENFs em 3D de biópsias de pele humana. Existem vários passos críticos no protocolo. A imuno-histoquímica da fluorescência flutuante é projetada para manchar e analisar vários sinais em cada amostra, fornecendo uma metodologia mais versátil para pesquisa exploratório44,45. Este procedimento permite a penetração dos a...
Não há conflitos de interesse para declarar.
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde subsídios K08 NS061039-01A2, o programa de pesquisa de Neurologia & descoberta e o r. Alfred Taubman Medical Research Institute da Universidade de Michigan. Este trabalho usou a morfologia e o núcleo de análise de imagem do Michigan Diabetes Research Center, financiado pelos institutos nacionais de saúde Grant 5P 90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças renais e digestivo. Os autores gostaria de agradecer a J. Robinson Singleton e a Gordon Smith (Universidade de Utah), por sua generosa doação de amostras de pele humana.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA | MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
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