Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.

Einleitung

Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod^1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper⁴ darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP⁵, vor allem bei den Synapsen⁶abhängig sind. Die Verteilung der Mitochondrien innerhalb von Neuronen sind deshalb wichtig.

In die letzten 10 Jahren, die eine Vielzahl von Informationen, dass gezeigt hat der Handel und das Andocken des neuronalen Mitochondrien, ist streng reglementiert. Motorproteine sind bei der Verteilung der Mitochondrien zu spezifischen zellulären Fächer in das Neuron beteiligt. Handel mit Mitochondrien ist besonders wichtig, weil Neuronen Axone und Dendriten fernab der Soma-Projekt. Motorproteine Kinesin direkt in erster Linie Anterograde (Weg von der Soma) Handel mit Mitochondrien entlang der Mikrotubuli während Dynien Motorproteinen direkte retrograde (in Richtung der Soma) Motilität^{7,8,9 , 10}. Zelluläre Signale gibt es solch eine mitochondriale Membranpotential und Impuls-Leitung, die Einfluss auf das Vorhandensein und die Richtung der mitochondrialen Menschenhandel^11,12,13.

Neben Mitochondrien zu transportieren, gibt es spezielle Proteine, Mitochondrien zu spezifischen zellulären Kompartimenten zu lokalisieren, die hohen Energiebedarf, wie Knoten von Ranvier und Synapsen^{8,14, 17}. In der Tat, die meisten von Mitochondrien in Axonen sind nicht bewegliche^9,13,18. Spezielle Proteine wie Syntaphilin Anker Mitochondrien Mikrotubuli entlang der Axone während andere Proteine Anker Mitochondrien an den Aktin-Zytoskelett^19–21. Wachstumsfaktoren und Ionen wie Calcium wurden berichtet, um die Einstellung der Mitochondrien Bewegung sie Regionen lokalisieren wo sie benötigte^21,22,23sind zu unterstützen.

Zusammengenommen, sind Menschenhandel und docking der Mitochondrien entscheidend für die richtige Funktion der Neuronen. Zur Unterstützung dieser wurde Unterbrechung des mitochondrialen Handel mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit, Huntington Krankheit, erbliche spastische Paraparese und Optikusatrophie^{15,24,25,26,27}. Neuere Studien konzentrierten sich auf mitochondriale Dysfunktion und Pathologie als ein möglicher Mechanismus für diabetische Neuropathie, die sensorische Verlust im Zusammenhang mit Diabetes^{28,29,30,31 ,32,33}. Die Hypothese ist, dass Diabetes die Verteilung der Mitochondrien innerhalb der sensorischen Projektionen der kutanen Nervenendigung verändert. Daher wurde eine Technik entwickelt, um zu visualisieren und zu quantifizieren Mitochondrien innerhalb der Intraepidermal Nervenfasern (IENFs), die distalen Spitzen der Dorsal Root Ganglion sensorischen Afferenzen. Die Technik kombiniert Fluoreszenz Immunohistochemistry spezifische mitochondriale und Nervenfaser Etiketten mit konfokalen Mikroskopie Z-Serie Erwerb von Signalen mit leistungsstarken 3D Bildanalyse-Software zur Messung der Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien von menschlichen kutanen Stanzbiopsien zur Erreichung dieses Ziels.

Protokoll

Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test.

1. Fluoreszenz Immunohistochemistry

1. Prepare Stanzbiopsien für Intraepidermal Nervenfaser Immunohistochemistry:
   1. Perform 3 mm Haut Biopsien durch medizinisches Personal und die gesamte Biopsie in 1,5 mL Zamboni ' s Fixativ Lösung (2 % Paraformaldehyd, 0,3 % gesättigt Pikrinsäure in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) bei 4 ° C über Nacht.
   2. Spülen Proben mit einer Lösung von 30 % Saccharose mit PBS-Puffer bei 4 ° C für 16-24 h oder bis die Probe sinkt.
   3. Embed Proben in optimale Arbeitstemperatur Verbindung (OCT) mit einem Cryomold. Legen Sie die ganze 3 mm-Biopsie mit der Epidermis nach unten in die Form und füllen Sie den Schimmel mit etwa 2 mL Okt. Freeze der Schimmel auf zerstoßenem Trockeneis. Shop bei-80 ° C bis zum Gebrauch.
   4. Cut 50 µm Dicke Querschnitte mit einem Kryostaten und speichern in einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 180 µL Frostschutzmittel Speicherlösung pro Bohrloch (30 % Ethylenglykol, 30 % Glycerin in PBS). Die folgenden Anweisungen sind für 8 Brunnen von einer 96-well-Platte. Flecken auf Abschnitte von jedem Standort der Biopsie, die 200-300 µm voneinander entfernt sind.

Tag 1:

2. unspezifische Kennzeichnung des Stratum corneums zu stillen:
   1. Etikett 96-Well-Platte wie in Abbildung 1 gezeigt.
   2. Lager Signal Enhancer Lösung, um unspezifische Bindung der Sekundärantikörper ^{34 , 35} in jede Vertiefung Pipettieren 150 µL. Abschnitte in Signal-Enhancer-Lösung mit einer Impfkeimen Schleife übertragen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, während der Arbeit mit dem Gewebe beschädigen oder reißen die Gewebeschnitte zu vermeiden. Halten Sie in Signal-Enhancer-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker.
   3. Vorbereiten spülen Brunnen in den Zeilen 2 und 3 des 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung.
   4. Abschnitte sorgfältig in Zeile 2 und Spülen mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur übertragen.
   5. Spülen ein zweites Mal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Zeile 3).
3. 5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert Lösung vorbereiten:
   1. bereiten 5 % Lösung, die 5 % BSA enthält blockieren und 0,3 % Triton X 100 (TX-100) in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 1) während der Abschnitte sind Inkubation Signal-Enhancer-Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.
   2. Bereiten Sie blockierende Brunnen in Zeile 4 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 5 % BSA Lösung in jedem Bohrloch blockieren.
   3. Abschnitte in individuelle Vertiefungen von 5 % BSA Lösung blockiert und inkubieren Sie Abschnitte in 5 % BSA Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker blockieren.
4. 1 % BSA Spülung Lösung und Verdünnung der Primärantikörper vorbereiten:
   1. bereiten Sie 1 % Spüllösung, die 1 % BSA und 0,3 % enthält TX-100 in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 2) während der Abschnitte sind Inkubation in 5 % BSA blockierende Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.
   2. Verdünnen Primärantikörper in 1 % BSA Spüllösung während Abschnitte in 5 % BSA blockierende Lösung brüten sind.
      1. 1.500 µL Primärantikörper Lösung machen und fügen Sie jeweils gut in Zeile 5.
      2. Verdünnen die primären Antikörper: verwenden Sie das Nerven-spezifische Beschriftung, Kaninchen polyklonale Anti-Protein Genprodukt 9.5 (PGP9.5) auf 1:1 000. Verwenden Sie die Mitochondrien-spezifische Bezeichnung, Maus monoklonalen Anti-Pyruvat-Dehydrogenase E2/E3bp Antikörper (PDH) bei 1: 100 in 1 % BSA Spüllösung.
5. Primärantikörper vorbereiten:
   1. Pipettieren 150 µL Primärantikörper in jede Zeile auch in 5 von 96-Well-Platte.
   2. Mit der Loop-Werkzeug Abschnitte aus der blockierenden Lösung (Zeile 4) in der Zeile 5 enthält den primären Antikörper übertragen.
   3. Wickeln Sie die Platte fest mit Parafilm zu halten vor dem Austrocknen.
   4. Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.

Tag 2:

6. spülen Proben:
   1. Prepare spülen Brunnen in Reihen 6, 7 und 8 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 % BSA Spüllösung in jede Vertiefung.
   2. Abschnitte in ersten 1 % BSA Spüllösung (Zeile 6) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Spülungen durch Inkubation Abschnitte in 1 % BSA Spüllösung in den Zeilen 7 und 8 für 1 h bei Raumtemperatur noch zweimal zu wiederholen.
7. Sekundärantikörper in 1 % BSA Spüllösung zu verdünnen:
   1. machen 1.500 µL Sekundärantikörper Lösung während Abschnitte in den letzten Spülgang 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) Inkubation werden.
   2. Sekundärantikörper verdünnen: für PGP9.5 (grün-fluoreszierende konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 1: 1000), für PDH (rot-fluoreszierend konjugierten Ziege Anti-Maus, 1:1 000) in 1 % BSA Spüllösung.
8. Sekundärantikörper vorbereiten:
   1. Pipettieren 150 µL Sekundärantikörper in Zeile 9 von 96-Well-Platte.
   2. Sanft übertragen die Abschnitte von 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) in Sekundärantikörper Vertiefungen (Zeile 9).
   3. Mit Parafilm, wickeln Sie die Platte fest zu halten vor dem Austrocknen. Mit Alufolie abdecken. Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.

Tag 3:

9. vorbereiten reinigen 1 X PBS durch Filterung durch einen 0,22 µm-Filter:
   1. Pipettieren 150 µL gefiltert 1 X PBS in Zeile 10, 11 und 12.
   2. Proben auf Zeile 10 übertragen und spülen Sie mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Decken Sie 96-Well-Platte mit Alufolie ab und auf einen flachen Rocker beim Spülen. Wiederholung gefiltert 1 x PBS spülen zwei weitere Male für 1 h bei Raumtemperatur in den Zeilen 11 und 12.
10. Montage Gewebeschnitte Objektträger vorbereiten:
    1. Ort 50 µL 1 X PBS auf einer Folie gefiltert.
    2. Transfer-Abschnitt von 1 X PBS (Zeile 12) in den 50 µL Tropfen. Positionieren Sie sorgfältig Abschnitt in der Dropdownliste der PBS durch Entfaltung des Gewebes und Abflachung es sanft auf dem Objektträger. Entfernen Sie überschüssige PBS mit einer Glaspipette um das Montage-Reagenz Verdünnung zu vermeiden. Abschnitte mit der Glaskolben nicht berühren.
    3. Pipettieren 1 - 2 Tropfen Montage Reagenz mit DAPI direkt auf den Abschnitt über das Mikroskop Folie mit Sorgfalt um die Ausrichtung des Abschnitts nicht zu stören. Sanft lege ein 50 mm x 24 mm #1.5 Mikroskop Glas Deckglas über Abschnitt.
    4. Klare Luftblasen gebildet, indem man das Deckglas und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Kanten des Deckglases. Bereiten Sie eine neue Folie und wiederholen Sie die Montage-prdet für jeden Abschnitt.
    5. Heilung/trockene Montage Medien indem man die Folien in der dunklen Nacht bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Folien auf 4 ° C für kurzfristige (1-2 Wochen) oder-20 ° C für die Langzeitspeicherung (mehr als 2 Wochen).
       Hinweis: Negativkontrollen Primärantikörper für PGP9.5 oder PDH in Schritt 1.4.2.2 weggelassen und angezeigt, keine unterscheidbare Kennzeichnung von Nerven oder Mitochondrien in der Epidermis. Positiv, dass Kontrollen wurden Etiketten für die PDH Antikörper zu beweisen alle Mitochondrien (Daten nicht gezeigt). Positivkontrollen wurden auf kultivierten primäre Maustaste Dorsal Root Ganglion Neuronen durchgeführt, die mit einem Baculovirus zum Label Mitochondrien mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Signal ausgestrahlt wurden und dann fixiert und befleckt mit dem PDH-Antikörper und rot fluoreszierende Sekundärantikörper. Alle Mitochondrien, die GFP zum Ausdruck zu bringen, wurden gemeinsam mit dem roten Etikett für PDH Immunohistochemistry (Daten nicht gezeigt) beschriftet wurden.

2. Confocal Imaging

1. konfokale Bildgebung durchführen:
   1. sammeln Bilder mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem 40 X Ölimmersion (1,25 numerische Apertur (N.A)) Ziel auf einem inversen Mikroskop.
      1. Bei jedem Brennebene sequenziell erwerben fluoreszierende Signale:
         Kerne: Erregung λ = 405 nm, spektrale Emission Filter λ = 420-480 nm
         Nervenfasern: Erregung λ = 488 nm, spektrale Emission Filter λ = 505-560 nm
         Mitoch Ondria: Erregung λ = 543 nm, spektrale Emission Filter λ = 606-670 nm
   2. die folgenden Scan-Parameter in die Mikroskop-Software eingeben: Scan-Rate von 600 Hz mit 2 Rahmen mit durchschnittlich und Zoom von 2,2; Intensität 12-Bit Auflösung (4096 grau Ebenen).
      1. Stellen die Mikroskop-Software für optimierte laterale Auflösung (scan-Auflösung = 1.024 x 1.024) und axiale Auflösung/optische-Schnitt (konfokale Blende = 1 luftig Einheit (AU) mit Z-Schrittweite von 210 nm).
         Hinweis: Die resultierende XYZ-Auflösung ist 172,2 nm x 172,2 nm X 210 nm mit einer Bildgröße von 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
   3. Aktivieren Sie ein live-Bild für das Nervensignal (grün-Fluoreszenz) und stellen Sie die Z-Fokus-Regler zu finden und einstellen den oberen und unteren Brennweite Flugzeuge in der Mikroskop-Software, die das Nervensignal im Abschnitt Gewebe umfassen. Z-Gesamtreichweite beträgt in der Regel 30-50 µm für einen 50 µm Gewebe Abschnitt.
   4. Feld Scan mit der Mikroskop-Software während einer live-Bild drehen, so dass die Epidermis in das Bild horizontal oder vertikal positioniert ist.
   5. Scannen jedes Signal getrennt und passen Sie den Detektor (Photomultiplier Röhre, PMT) Spannung und Offset zu minimieren/über und unter gesättigten Pixel entfernen.
      Hinweis: Die Scan-Zeiten mit den oben genannten Parametern dauern ca. 20-40 min je nach Anzahl der Z-Scheiben.

3. 3D Visualisierung und Analyse der Mitochondrien innerhalb menschlicher Intraepidermal Nervenfasern

1. 3D Epidermis zu isolieren:
   1. duplizieren Sie das Originalbild und verwenden Sie die maximale Intensität Projektion (erweiterte Fokusansicht) des Bildes zu identifizieren und isolieren die Epidermis.
   2. Verwenden eine Region von Interesse-Werkzeug, um Spur entlang der oberen und unteren Kanten der Epidermis, um unerwünschte Bereiche wie das Stratum Corneum und Dermis zu entfernen, das Fehlen von Intraepidermal Nervenfasern. Auf diese Auswahl zuschneiden.
2. Verwendung Dekonvolution auf die Nerven und mitochondriale fluoreszierende Signale:
   Hinweis: Dekonvolution hilft, die Integrität der fluoreszierenden Signale wieder herzustellen. Die Wiederherstellung, die in diesem Protokoll verwendeten wird blind Deconvolution genannt, weil es die fluoreszierenden Signale in den Bildern nutzt um zu bestimmen, wie viel die Signale von ihrer ursprünglichen Quelle verbreiten (Punkt spread Funktion). Der Prozess verbessert Signal Auflösung durch die Neuzuweisung des Signals zurück in seine Ursprungsposition verbreitet.
   1. Berechnen einen Punkt verteilen Funktion (PSF) für das grün fluoreszierende Nervensignal (grün-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern:
      1. stellen berechneten PSF auf konfokalen. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Stellen Sie Detektor Lochkamera auf 1 luftig Einheit (AE). Set Laser Erregung Wellenlänge 488 nm und Emissions-Wellenlänge 515 nm.
   2. Ein PSF für rote mitochondriale Fluoreszenzsignal (rot-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern zu berechnen:
      1. Set PSF auf konfokalen berechnet. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Detektor Lochkamera auf 1 gesetzt AU. Eingestellten Erregung Laserwellenlänge 543 nm und Emissions-Wellenlänge, 617 nm.
   3. Optimieren die Nerven- und Mitochondrien fluoreszierende Signale von Dekonvolution unter Verwendung der entsprechenden PSFs oben aufgeführten und iterative Wiederherstellung Feature auf 100 % Vertrauen und einer Iteration-Grenze von 10 Zyklen festgelegt.
3. Nerv-spezifische Oberflächen zu schaffen:
   1. Gebrauch der " DGM erstellen " Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Nerven von den deconvolved grün-fluoreszierende sekundäre Kennzeichnung von der PGP9.5 identifiziert Nerven.
   2. Uncheck die " glatt " verfügen und absolute Intensität-Funktion verwenden, um die Schwelle für das Nervensignal gesetzt, denn es ist deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz.
   3. Funktion zum setzen Sie den Schwellenwert für das Nervensignal, da es deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz ist die absolute Intensität. Legen Sie Schwellenwert niedrig genug, um die Nerven genau zu identifizieren.
   4. Filter, kleinen, nicht-Nerv Oberflächen basierend auf Größe.
      Hinweis: Manuell bearbeiten Sie ggf. zusätzliche nicht-Nerv Oberflächen innerhalb der " bearbeiten " Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte markieren und dann mit der Entf-Taste löschen.
4. Isolieren Nerv-spezifische mitochondriale Fluoreszenzsignal:
   1. Wählen Sie die Registerkarte "Bearbeiten" der Nerv Oberfläche zum Anzeigen der " Maskeneigenschaften " Funktion. Die Nerv-Oberfläche in Schritten 3.3 erstellt wird verwendet, um die Mitochondrien in die Nerven weg von mitochondrialen Signale zugeordnet die Keratinozyten isolieren.
   2. Als die " Maske alle ' Taste öffnet sich ein " Maskenkanal " Fenster, wählen Sie das deconvolved rot-fluoreszierend-Signal aus dem Pull-down-Menü unter " Kanalwahl " für das mitochondriale Signal.
   3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ein Häkchen setzen der " doppelten Kanal vor dem Auftragen der Maske " Option.
   4. Klicken Sie auf die Radio-Taste an der " konstant innen/außen " Möglichkeit, die Maskeneinstellungen und klicken Sie im Feld ein Häkchen setzen die " Voxel Außenfläche zu setzen " Option und geben Sie für den Wert 0,00. Klicken Sie auf "OK"-Taste, um den neuen Kanal erstellen, die mitochondriale Signale innerhalb der Nerv Oberfläche darstellt.
5. Mitochondrien-spezifische Oberflächen zu schaffen:
   1. Gebrauch der " DGM erstellen " Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Mitochondrien aus dem neu geschaffenen fluoreszierende Kanal der Nerv-spezifische mitochondriale Signale von 3.4 Schritte.
   2. Uncheck die " glatt " verfügen, und wählen Sie den " Hintergrund Subtraktion " Funktion, um den Schwellenwert festlegen. Diese Funktion nutzt lokale Kontrast um das mitochondriale Signal Mitochondrien aus Hintergrund identifizieren.
   3. Set-Schwellenwert ist niedrig genug, um die Mitochondrien genau zu identifizieren. In diesem Beispiel wurde der untere Grenzwert auf 2.000 für einen 16-Bit (65.536) Maßstab festgelegt.
   4. Filtern mitochondriale Oberflächen basierend auf Größe. In diesem Beispiel wird das Voxel-Limit auf 1,0 Voxel festgelegt wurde, ist die niedrigste möglich zu begrenzen. Bearbeiten Sie ggf. manuell nicht Mitochondrien Oberflächen innerhalb der " bearbeiten " Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte auswählen und dann mit der Entf-Taste löschen.
      Hinweis: Gelegentlich wird die Software Oberflächen erstellen, die keine unterscheidbare mitochondriale Fluoreszenzsignal zugeordnet sind. In diesen Fällen ist es möglich, entfernen sie mit dem " bearbeiten " tab.
6. Exportieren und morphometrische Werte für die Analyse berechnen:
   1. Werte für Nerven- und mitochondriale Oberflächen aus exportieren der " Statistik " Registerkarte zur weiteren Analyse mit elektronischen Tabellenkalkulations-Software.
   2. Exportieren die Volumenwerte für die Nerven und die mitochondriale Oberflächen.
   3. Die Anzahl der einzelnen Nervenfasern vorhanden in jedem Bild und notieren Sie den Wert in der elektronischen Tabellenkalkulation.
   4. Für jedes Bild die folgenden möglichen Werte für die Analyse in der elektronischen Tabellenkalkulation berechnen:
      1. Sum Volumes für alle Nerven Oberflächen.
      2. Filter, Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen unter einem Volumen von weniger als 0,02 µm ³ und bin Größe Oberflächen durch. Z. B. Behälter z. B. 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1.28 1.28-2,56, größer als 2,56 µm ³.
         Hinweis: Die untere Grenze der mitochondrialen Volumen wurde gegründet um 0,02 µm ³ anhand der bisher erschienenen Bände der Mitonchodria ^{36 , 37 , 38}.
      3. Zählen die Anzahl der Nerven-spezifische mitochondriale Flächen in jedem Lagerplatz und die Gesamtzahl der Flächen über die Lagerplätze (0,02 - mehr als 2,56 µm ³).
      4. Berechnung des Anteils der Nerv-spezifische mitochondriale Oberflächen in jedem Lagerplatz. Verwenden Sie die Anzahl die pro bin dividiert durch die Gesamtzahl der Mitochondrien Oberflächen.
      5. Summe der Volumina für alle Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen.
      6. Berechnet den Anteil des Nervs mit mitochondrialen Signal dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch die Summe aller mitochondriale Oberfläche Volumes.
      7. Berechnen Sie die Anzahl der Mitochondrien pro Nerv Volumen dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch den Grafen von allen mitochondriale Oberflächen.

Ergebnisse

Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs

Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. A...

Diskussion

Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung^44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Zamboni's Fixative	Newcomer Supply, Middleton, WI	1459A	2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP399-4	To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	I36933	enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)	Proteintech Group Inc. Rosemont, IL	14730-1-AP	abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)	abcam, Cambridge, MA	ab110333	abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11034	red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11032	green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A7906-100	abbreviated as BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T9284	abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter	EMD Millipore, Billerica MA	MILLEX GP SLGP 033NS	0.22 µm Millipore filter
Parafilm M	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	13-374-10	Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-032092	inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate	Corning Incorporated, Corning, NY	3603	96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	P-36931	DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-544E	Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-550-15	Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5	Confocal Microscope
Volocity x64 Software	Perkin Elmer, Waltham , MA	version 4.4.0	Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software	Bitplane, Concord, MA	version 7.7.1	Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel	Microsoft, Redmond, WA	version Office 2013	Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound	Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA	4583	abbreviated as OCT
Leica Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL	CM1850	Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	C10600	Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal