Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Resumen

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Resumen

La fagocitosis es un proceso fundamental a través del cual las células inmunitarias innatas engullen las bacterias, células apoptóticas u otras partículas extrañas con el fin de matar o neutralizar el material ingerido, o presentarlo como antígenos e iniciar la respuesta inmune adaptativa. El pH de los fagosomas es un parámetro crítico regulación de fisión o fusión con endomembranes y la activación de las enzimas proteolíticas, eventos que permiten la vacuola fagocítica a madurar en un orgánulo degradativa. Además, se requiere la translocación de H ⁺ para la producción de altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son esenciales para la matanza eficiente y señalización a otros tejidos del huésped. Muchos patógenos intracelulares subvierten asesinato fagocitosis mediante la limitación de la acidificación phagosomal, destacando la importancia del pH en la biología fagosoma. Aquí se describe un método radiométrico para la medición de pH phagosomal en los neutrófilos utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con zymosan como targ fagocíticaets y imágenes de células vivas. El ensayo se basa en las propiedades de fluorescencia de FITC, que se inactivó mediante pH ácido cuando se excita a 490 nm pero no cuando se excita a 440 nm, lo que permite la cuantificación de una relación dependiente del pH, en vez de la fluorescencia absoluta, de un solo colorante. También se proporciona un protocolo detallado para llevar a cabo en la calibración de tinte situ y la conversión de la relación de a valores de pH real. Métodos radiométricos de un solo tinte se consideran en general superior a la longitud de onda única o protocolos pseudo-radiométrica de doble tinte, ya que son menos sensibles a las perturbaciones tales como blanqueo, se centran cambios, variaciones láser y etiquetado irregular, que distorsionan la señal medida. Este método se puede modificar fácilmente para medir el pH en otros tipos de células fagocíticas, y zymosan puede ser reemplazado por cualquier otra partícula que contiene amina, a partir de perlas inertes a los microorganismos vivos. Por último, este método puede ser adaptado para hacer uso de otras sondas fluorescentes sensibles a diferentes intervalos de pH o de otros phagosomactividades al, por lo que es un protocolo generalizado para la proyección de imagen funcional de fagosomas.

Introducción

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material^1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O₂^- and its derivative reactive oxygen species (ROS) ^2,4.

The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes ^5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na⁺/H⁺ exchanger or ClC family Cl^-/H⁺ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H⁺ translocation ^9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils ^4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba ^13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H⁺ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H⁺ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme ^17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH ^22-24.

In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing ^25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism ²⁸. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)¹¹, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later ^29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH ^31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions ³³.

Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH ^34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies ³⁶, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses.

Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH ¹⁹. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm ³⁷. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

Protocolo

Declaración de Ética: Todas las manipulaciones animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Ginebra.

1. Preparación de Metas fagocíticas

1. Añadir 20 mg de zymosan se secó a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Vortex y el calor en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Enfriar y centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
2. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de PBS y se somete a ultrasonidos durante 10 minutos en un sonicador de baño de agua. Transferir 500 l a dos tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min.
3. Repita el lavado con 500 l de PBS. El zymosan hervida puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C.
4. Lave zimosán dos veces en 500 l recién preparados 0,1 M Na ₂ CO _3, pH 9,3 que el anterior (paso 1.2).
5. Resuspender en 490 l después del lavado final. Añadir 10 l de 10 mg / ml de FITC disuelto en dimetil sulfoxide (DMSO), vórtice, cubrir con papel de aluminio, y se incuba con agitación durante 4 horas a temperatura ambiente.
6. Para quitar colorante no fijado, lávese que el anterior (paso 1.2), primero con 0,5 ml de DMSO + 150 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 300 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 450 l de PBS, a continuación PBS solo.
7. Cuente zimosán utilizando un hemocitómetro. Añadir 1 l de zymosan a 500 l de PBS, vórtice, a continuación, añadir 10 l hasta el borde de la cámara de hemocitómetro, donde se encuentra con el cubreobjetos se coloca sobre la rejilla central. Montar el hemocitómetro en un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo 20X.
8. Centrarse en la esquina superior izquierda contiene 16 cuadrados y contar todas las partículas zymosan en esta área utilizando un contador de recuento mano. Repita con la esquina inferior derecha. Calcular la concentración zymosan usando la siguiente ecuación: concentración Zymosan = Cantidad / 2 x 500 x 10 ⁴ zymosan / ml. Zimosán marcado puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C.
9. Opsonizar el wi zimosán etiquetadoth un conejo anticuerpo anti-zymosan en 1: 100 dilución. Vortex e incubar durante 1 hora en un 37 ° C baño de agua. Lavar con 500 l de PBS que el anterior (paso 1.2).
   Nota: La sonicación es muy recomendable, sobre todo después de la opsonización, como zimosán tiende a formar montones que pueden hacer análisis más difíciles más adelante. Opsonización con 65% v / v de rata o de suero humano se puede utilizar como una alternativa.
10. Contar zymosan usando un hemocitómetro como se describe en los pasos 1,7-1,8, y se diluye hasta 100 x 10 ⁶ partículas / ml. Opsonización con otros estimuladores fagocíticas, como complemento o no la opsonización, se puede realizar alternativamente.

2. Live Video Microscopía

1. Aislar neutrófilos primarios de ratón como se describe en detalle en otra parte ^38.
   1. También puede utilizar cualquier tipo de célula fagocítica. Mantener los neutrófilos en hielo en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a una concentración de 10 x 10 ⁶ células / ml hasta que esté listo para su uso. Otros tipos de células se pueden sembrar 1-4 días antes.
2. Añadir 2 x 10 ⁵ (20 l) de los neutrófilos hacia el centro de un plato de fondo de vidrio 35 mm, se extendió la caída mediante la adición de 50 l de medio y se incuba a 37 ° C durante 5 min para permitir que las células se adhieran.
3. Añadir 1 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) se calentaron a 37 ° C que contiene la específica MPO hidrazida inhibidor 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 M). Los inhibidores no específicos de la MPO, como azida de sodio (5 mM), también se pueden utilizar, pero se han sugerido recientemente para ejercer efectos no específicos adicionales en pH ^39.
4. Montar el plato en un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un sistema de calefacción C 37 ° y un objetivo de aceite de 40X. Se incuban las células sin formación de imágenes durante 10 min para permitir que las células y los equipos se equilibren.
5. Ajuste la configuración de microscopio para adquirir una imagen de transmisión de campo brillante [phase o contraste de interferencia diferencial (DIC), si está disponible] con 440 nm o 490 nm de excitación y 535 nm de emisión cada 30 segundos.
6. Ajuste el tiempo de exposición y la frecuencia de adquisición de acuerdo con el sistema de microscopio para evitar el exceso de fotoblanqueo y fototoxicidad y en función de las preguntas experimentales se preguntó. Comience la adquisición de imágenes.
7. Después de 2 min, añadir 10 x 10 ⁶ (50 l) opsonizado-FITC zymosan al centro del plato. Ajuste de destino: proporciones de células dependiendo del tipo de fagocito y de destino utilizado.
8. Continuar de imágenes para 30 min. Después de 30 minutos detener la adquisición de lapso de tiempo y comenzar un temporizador. Mueva el escenario y capturar 10 o más instantáneas en diferentes campos de visión de imagen otros fagosomas, todo dentro de 5 min.

3. Los experimentos de calibración y control

1. Preparar las soluciones de calibración pH (recetas se describen en la Tabla 1) antes del día del experimento y congelar en alícuotas de 10 ml.Descongele las soluciones de calibración y caliente a 37 ° C en un baño de agua. Comprobar el pH con un medidor de pH y registrar el pH real de las soluciones.
2. Montar una bomba peristáltica en la parte inferior plato de cristal antes de la adquisición de la imagen y realizar microscopía de vídeo en directo como se describe anteriormente (sección 2).
3. Al final del período de adquisición de 30 min encienda la bomba para eliminar la solución dentro del plato, añadir 1 ml de la primera solución de calibración y detener la bomba.
4. Espere hasta que la señal se estabiliza, por lo general 5 min. Repita el procedimiento con cada solución de calibración.
   1. Realizar al menos una calibración por día experimental, y calibrar comenzando con el más alto pH y secuencial de trabajo a la más baja, así como a partir de la pH más bajo y trabajando de forma secuencial hacia el más alto.
5. Como control, añadir 100 l de 100 mM de yoduro de propionium difenil inhibidor de la NADPH oxidasa (DPI) diluido en HBSS a las células en 900 l de HBSS en el plato de fondo de vidrio, yincubar durante 10 min.
6. Comience adquisición y añadir zimosán que el anterior (paso 2.7). Después de 15 min de la fagocitosis, añadir 10 l de 10 mM inhibidor de la V-ATPasa concanamycin A (ConcA) diluido en HBSS y continuar de imágenes para un adicional de 15 min.

4. Análisis

1. Análisis de películas a intervalos y las instantáneas fagosoma.
   Nota: Las siguientes instrucciones son específicas para ImageJ. Paso a paso las instrucciones pueden variar ampliamente dependiendo del software utilizado, pero las funciones descritas en esta sección están disponibles en la mayoría de software de análisis de imagen profesional.
   1. Abra las imágenes con software de análisis de imagen profesional. Reste el fondo en el canal 490 dibujando una pequeña ROI cuadrado con la herramienta de selección poligonal cuadrados en una zona donde no hay células, y haciendo clic en Plugins> BG Sustracción de retorno de la inversión. Luego cargue el mismo ROI en el canal 440 haciendo clic en Editar> Cambios> Restaurar selección y repetir.
   2. Hacer una imagen de relación de 32 bits del canal de 490 dividido por el canal 440 haciendo clic en Proceso> Calculadora Imagen ..., la selección de las imágenes apropiadas en los menús desplegables Image1 y Image2, luego seleccionando "brecha" en el menú desplegable de la Operación y comprobar el resultado casilla 32-bit (float).
   3. Cambie la tabla de consulta de códigos de colores para un código de colores compatibles con relación haciendo clic en Imagen> tablas de búsqueda> Rainbow RGB. Umbral de la imagen relación de eliminar 0 e infinito píxeles haciendo clic en Imagen> Ajustar> Umbral .... Ajuste las barras de desplazamiento para que zimosán aparece en rojo y haga clic en Aplicar, asegurándose de que los valores de ajuste píxeles de fondo casilla NaN a se selecciona.
   4. Combine esta relación pila con el canal de campo brillante en un compuesto de varios canales haciendo clic en Imagen> Color> Combinar Canales, y la selección de la imagen de campo brillante en el menú desplegable canal gris y la imagen de relación en el menú desplegable canal verde, y la selección de laMantenga imágenes fuente casilla de verificación. Analiza las películas a intervalos o instantáneas para determinar qué fagosomas se van a analizar. El canal de campo brillante es útil para esto.
   5. Dibuje las regiones de interés (ROI) mediante la herramienta de selección poligonal óvalo alrededor fagosomas, y añadirlos a la gerente ROI haciendo clic en Análisis> Herramientas> Administrador ROI> Agregar. Mida su relación de intensidad zimosán haciendo clic en Más> Multi-Medida y de-seleccionar la una fila por cada rebanada de casilla.
   6. Para las películas de lapso de tiempo, los fagosomas pista uno a la vez mediante la elaboración de un retorno de la inversión, tecleando Ctrl + M para medir cada punto de tiempo, y moviendo el retorno de la inversión cuando sea necesario para realizar un seguimiento de los valores de intensidad con el tiempo. Copie las mediciones de la ventana Resultados en una hoja de cálculo.
      Nota: El análisis de los 15 (5 cursos de tiempo por experimento x 3) experimentos independientes es ideal, pero más o menos puede ser necesaria en función de la variabilidad observada. Salvando las regiones de interés es siempre recomendable. Algunos paquetes de software permiten regi imagentración y actualización dinámica de rendimiento de la inversión, facilitando de esta parte del análisis.
2. La conversión de fluorescencia para valores de pH
   1. Medir la relación 490/440 para fagosomas en las películas a intervalos de calibración como se describe en la sección 4.1.
   2. En una hoja de cálculo, trazar los valores de la relación con el tiempo, y calcular los valores medios de relación de todos los fagosomas dentro del campo de visión (por lo general, entre 5-20) a partir de 5 puntos de tiempo dentro de la mitad del período de tiempo correspondiente a cada calibración pH solución. (Véanse también las cajas de color rojo en la figura 5A.)
   3. Trazar estos medios 490/440 valores de la relación contra el pH medido real. Combine por lo menos 3 calibraciones independientes en un solo gráfico. Use un paquete de software estadístico o numérica para realizar una regresión no lineal (curva de mejor ajuste), por lo general a una ecuación sigmoidal.
      Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación utilizada fue una sigmoidal Boltzmann [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], donde los valores de Y son los 490/440 ratios, X son los valores de pH y la parte superior, inferior parámetros V50 y pendiente son calculados por el software.
   4. Utilice la ecuación obtenida para transformar valores de la relación de pH.
      Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación obtenida para la curva de calibración en presencia de azida de sodio es 490/440 = 1,103 + Ratio [(2,89 a 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Resolviendo para pH da la siguiente ecuación: pH = 6.993 - 0,9291 * [ln ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))].

Resultados

Los siguientes son resultados representativos de un experimento en el que el pH phagosomal de los neutrófilos primarios de ratón aislado de la médula ósea de tipo salvaje o Hvcn1 ^{- / -} los ratones fueron comparados. Para un experimento exitoso, es importante obtener suficientes fagosomas dentro del campo de visión durante toda la duración de la película de lapso de tiempo, evitando al mismo tiempo demasiados fagosomas, que más tarde serán más difíciles de segmento durante el an?...

Discusión

Aunque más lento que los métodos alternativos, como la espectroscopia y FACS, que emplean una estrategia similar de uso de un colorante sensible al pH, junto a los objetivos, pero miden el pH promedio de una población de fagosomas, microscopía ofrece varias ventajas. En primer lugar es que interna y externa obligado, pero no interiorizada, las partículas pueden ser fácilmente distinguido sin tener que añadir otros productos químicos, tales como tripán azul o anticuerpos, para calmar o etiquetar partículas exte...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymosan A powder	Sigma-Aldrich	Z4250	Various providers exist
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F7250	Various providers exist
Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Toxic, use gloves, various providers exist
Diphenyleneiodonium chloride (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Toxic, use gloves, various providers exist
Concanamycin A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Toxic, use gloves, various providers exist
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Toxic, use gloves, various providers exist
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14200-075	Various providers exist
Hank's balance salt solution	Life Technologies	14025092	Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Various providers exist
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
N-Methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Various providers exist
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Absolute Ethanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted
Sonicating water bath	O. Kleiner AG		A sonicator may be used instead, various instrument providers exist
Heamocytometer	Marienfeld GmbH		Various instrument providers exist
Widefield live imaging microscope	Carl Zeiss AG		Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.
Peristaltic pump (Dynamax RP-1)	Rainin		Various instrument providers exist
pH meter	Schott Gerate GmbH		Various instrument providers exist
Manual Counter	Milian SA		Various instrument providers exist