Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Abstract

Phagocytosis הוא תהליך בסיסי שדרכו תאים חיסוניים מולדים לבלוע חיידקים, תאים אפופטוטיים או חלקיקים זרים אחרים כדי להרוג או לנטרל את חומר בליעה, או להציג אותה כאנטיגנים וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית. PH של phagosomes הוא פרמטר קריטי המסדיר ביקוע או היתוך עם endomembranes והפעלה של אנזימי מפרקי חלבונים, אירועים המאפשרים vacuole phagocytic להתבגר לתוך אברון נגרע. בנוסף, טרנסלוקציה של H + נדרשת לייצור רמות גבוהות של מינים תגובתי חמצן (ROS), שהם חיוניים להרג יעיל ואיתות לרקמות מארח אחרות. פתוגנים תאיים רבים לחתור תחת הרג phagocytic ידי הגבלת החמצת phagosomal, המדגיש את חשיבותו של ה- pH בביולוגיה phagosome. כאן אנו מתארים שיטה למדידת pH ratiometric phagosomal בנויטרופילים באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) -labeled zymosan כטארג phagocyticETS, וLive- תא הדמיה. Assay מבוסס על תכונות הקרינה של FITC, שהוא הרווה ידי pH חומצי כאשר נרגש ב 490 ננומטר, אך לא כאשר נרגש ב 440 ננומטר, המאפשר כימות של יחס pH תלוי, ולא הקרינה מוחלטת, של צבע אחד. פרוטוקול מפורט לביצוע בכיול צבע אתר והמרה של יחס לערכי pH האמיתי הוא גם סיפק. שיטות ratiometric חד צבע נחשבות בדרך כלל עדיפה על אורך גל בודד או פרוטוקולים פסאודו-ratiometric כפול צבע, כפי שהם פחות רגישים להפרעות כגון הלבנה, להתמקד שינויים, וריאציות לייזר, ותיוג אחיד, המעוותים את האות הנמדדת. שיטה זו ניתן לשנות בקלות למדוד pH בסוגי תאי phagocytic אחרים, וzymosan יכול להיות מוחלף על ידי כל חלקיקים המכילים אמין אחרים, מחרוזי אינרטי למיקרואורגניזמים חיים. לבסוף, בשיטה זו ניתן להתאים לעשות שימוש בבדיקות ניאון אחרים רגישות לטווחי pH שונים או phagosom האחרפעילויות אל, מה שהופך את פרוטוקול כללי להדמיה התפקודית של phagosomes.

Introduction

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O2- and its derivative reactive oxygen species (ROS) 2,4.

The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes 5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na+/H+ exchanger or ClC family Cl-/H+ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H+ translocation 9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils 4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba 13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H+ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H+ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme 17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH 22-24.

In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing 25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism 28. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)11, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later 29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH 31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions 33.

Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH 34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies 36, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses.

Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH 19. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm 37. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המניפולציות של בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות קפדניות של ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'נבה.

1. הכנת יעדי phagocytic

  1. הוסף 20 מ"ג של zymosan המיובש 10 מיליליטר שנאגרו מלוח פוספט סטרילי (PBS). מערבולת וחום באמבט מים רותח למשך 10 דקות. מגניב ו צנטריפוגות XG ב 2000 במשך 5 דקות.
  2. הסר את supernatant, resuspend ב 1 מיליליטר PBS וsonicate במשך 10 דקות באמבט המים sonicator. העבר את 500 μl לשני צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 5 דקות.
  3. חזור על לשטוף עם 500 μl PBS. Zymosan מבושל יכול להיות aliquoted, קפוא ומאוחסן ב -20 ° C.
  4. לשטוף zymosan פעמיים ב500 μl מוכן טרי 0.1 M Na 2 CO 3, pH 9.3 כאמור לעיל (שלב 1.2).
  5. גלול ב490 μl לאחר השטיפה הסופית. הוסף 10 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​מומס FITC בsulfoxid דימתילדואר (DMSO), מערבולת, מכסה בנייר כסף, ודגירה עם תסיסה במשך 4 שעות ב RT.
  6. כדי להסיר צבע מאוגד, לשטוף כאמור לעיל (שלב 1.2), ראשון עם 0.5 מיליליטר DMSO + 150 μl PBS, אז 0.5 מיליליטר DMSO + 300 μl PBS, אז 0.5 מיליליטר DMSO + 450 μl PBS, אז PBS לבד.
  7. רוזן zymosan באמצעות haemocytometer. הוסף 1 μl של zymosan 500 μl PBS, מערבולת, ולאחר מכן להוסיף 10 μl לקצה תא haemocytometer, שבו הוא פוגש את coverslip הניח על הרשת המרכזית. הר haemocytometer על מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד מטרת 20X.
  8. להתמקד בפינה השמאלית העליונה מכילה 16 ריבועים ולספור את כל חלקיקי zymosan בתחום זה באמצעות דלפק יד נקודות. חזור עם הפינה הימנית התחתונה. חשב את ריכוז zymosan באמצעות המשוואה הבאה: ריכוז Zymosan = רוזן / 2 x 500 x 10 4 zymosan / מיליליטר. zymosan שכותרתו ניתן aliquoted, קפוא ומאוחסן ב -20 ° C.
  9. Opsonize Wi zymosan הכותרתth נוגדן אנטי zymosan ארנב ב 1: 100 דילול. מערבולת דגירה עבור שעה 1 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl PBS כאמור לעיל (שלב 1.2).
    הערה: Sonication מומלץ מאוד, במיוחד לאחר opsonization, כzymosan נוטה ליצור גושים שיכולים לעשות ניתוח קשה יותר בהמשך. Opsonization עם 65% חולדה V / V או סרום אדם עשוי לשמש כחלופה.
  10. רוזן zymosan באמצעות haemocytometer כפי שמתואר בשלבים 1.7-1.8, ולדלל עד 100 x 10 6 מיליליטר / חלקיקים. Opsonization עם גירוי phagocytic אחר, כגון השלמה או לא opsonization, ניתן לבצע לחלופין.

2. חיים מיקרוסקופית וידאו

  1. לבודד נויטרופילים עכבר עיקריים כפי שתואר בפירוט במקום אחר 38.
    1. לחלופין, להשתמש בכל סוג תא phagocytic. שמרו נויטרופילים על קרח ברוזוול פרק זיכרון המכון (RPMI) מדיום 1640 בתוספת 5% בסרום עגל עוברי (V / V), 200 פניצילין U / streptomycin, בריכוז של 10 x 10 6 תאים / מיליליטר עד מוכן לשימוש. סוגי תאים אחרים יכולים להיות שנזרעו 1-4 ימים לפני.
  2. הוסף 2 x 10 5 (20 μl) של נויטרופילים למרכז צלחת זכוכית תחתונה 35 מ"מ, להפיץ את הירידה על ידי הוספת 50 μl של מדיום ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק.
  3. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) חימם עד 37 ° C המכיל hydrazide מעכב 4-aminobenzoic MPO הספציפי (4-ABH, 10 מיקרומטר). גם מעכבי MPO שאינם ספציפיים, כגון אזיד הנתרן (5 מ"מ), ניתן להשתמש אך הוצעו לאחרונה להפעיל אפקטים שאינם ספציפיים נוספים על pH 39.
  4. הר הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield מצויד במערכת חימום 37 ° C ואובייקטיביים שמן 40X. דגירה תאים בלי הדמיה במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים וציוד לאזן.
  5. התאם את הגדרות מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונת שידור בהיר שדה [PHAse או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אם קיימים] עם 440 ננומטר או 490 ננומטר עירור ופליטת 535 ננומטר כל 30 שניות.
  6. התאם זמן חשיפה ותדירות רכישה בהתאם למערכת מיקרוסקופ כדי למנוע photobleaching יותר מדי וphototoxicity ובהתאם לשאלות הניסיוניות שהתבקש. בגין רכישת תמונה.
  7. אחרי 2 דקות, להוסיף 10 x 10 6 (50 μl) opsonized FITC-zymosan למרכז הצלחת. התאם יעד: יחסי תא בהתאם לסוג של תָא בַּלעָן ויעד בשימוש.
  8. המשך הדמיה למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להפסיק את רכישת הזמן לשגות ולהתחיל טיימר. הזז את הבמה וללכוד 10 או יותר תמונות בתחומים שונים של נוף לphagosomes אחר התמונה, כל זאת במסגרת 5 דקות.

3. ניסויי כיול והבקרה

  1. הכן את פתרונות כיול pH (מתכונים מתוארים בטבלה 1) לפני היום של ניסוי ולהקפיא בaliquots 10 מיליליטר.להפשיר את פתרונות כיול וחמים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בדוק את ה- pH עם מד pH ולהקליט את ה- pH בפועל של פתרונות.
  2. הר משאבת peristaltic על צלחת תחתית הזכוכית לפני רכישת תמונה ולבצע מיקרוסקופיה וידאו החי כפי שתואר לעיל (סעיף 2).
  3. בתום תקופת הרכישה 30 דקות להפוך את המשאבה בלהסיר את הפתרון בתוך הצלחת, להוסיף 1 מיליליטר של פתרון הכיול הראשון ולעצור את המשאבה.
  4. חכה עד שהאות תתייצב, בדרך כלל 5 דקות. חזור עם כל פתרון כיול.
    1. לבצע כיול לפחות אחת ליום ניסיוני, ולכייל מתחיל עם pH הגבוה ביותר ועובד ברצף לרמה הנמוכה ביותר, כמו גם החל מה- pH הנמוך ביותר ועובד ברצף לקראת הגבוה ביותר.
  5. כביקורת, להוסיף של יודיד propionium diphenyl מעכבי מונואמין NADPH 100 מיקרומטר 100 μl (DPI) בדילול מלא בHBSS לתאים ב900 μl HBSS בצלחת תחתית הזכוכית, ודגירה של 10 דקות.
  6. התחל רכישה ולהוסיף zymosan כאמור לעיל (שלב 2.7). לאחר 15 דקות של phagocytosis, להוסיף 10 μl של 10 מיקרומטר מעכב V-ATPase concanamycin (קונקה) בדילול מלא HBSS ולהמשיך הדמיה ל-15 דקות נוספות.

4. ניתוח

  1. ניתוח של הזמן לשגות סרטים ותמונות phagosome.
    הערה: ההוראות הבאות הן ספציפיות לImageJ. צעד אחר צעד הוראות עשויות להשתנות במידה רבה בהתאם לתוכנה בשימוש, אבל הפונקציות מתוארות בסעיף זה זמינות ברוב תוכנות ניתוח תמונה מקצועיות.
    1. פתח את התמונות עם תוכנת ניתוח תמונה מקצועית. הפחת את הרקע בערוץ 490 על ידי ציור ROI כיכר קטן עם כלי בחירת מצולע מרובעים באזור שבו אין תאים, ולחיצה חיסור התוספים> BG מהחזר על ההשקעה. לאחר מכן להעלות אותו ההחזר על ההשקעה בערוץ 440 בעריכה> בחירת לחיצה> שחזור בחירה וחזור.
    2. הפוך תמונת יחס 32 סיביות של הערוץ 490 מחולק בערוץ 440 על ידי לחיצה על תהליך> מחשבון תמונה ..., בחירת התמונות המתאימות בתפריטים הנפתחים Image1 וImage2, ולאחר מכן בחירה "הפרד" בתפריט הנפתח מבצע , ובדיקה של 32 סיביות (לצוף) תיבת סימון תוצאה.
    3. שנה את הטבלה להסתכל למעלה קידוד הצבע לצבע-קידוד יחס תואם על ידי לחיצה שולחנות תמונה> בדיקה> קשת RGB. סף את תמונת היחס לחסל 0 ואינסוף פיקסלים על ידי לחיצה תמונה> התאם> סף .... התאם את פסי הגלילה כך zymosan שמופיע באדום ולחץ על החל, ולוודא פיקסלים רקע הסט לתיבת סימון נאן הוא נבחר.
    4. לשלב ערימת יחס זה עם הערוץ הבהיר שדה למרוכבים רב-ערוצים על ידי לחיצה תמונה> צבע> מיזוג ערוצים, ובחירת התמונה הבהיר השדה בתפריט הנפתח ערוץ האפור ותמונת היחס בתפריט הנפתח הערוץ הירוק, ו בחירהשמור את תמונות מקור תיבת סימון. סרוק את הזמן לשגות סרטים או תמונות כדי לקבוע אילו phagosomes הן להיות מנותח. הערוץ בהיר השדה הוא שימושי עבור זה.
    5. לצייר אזורים של העניין (ROI) באמצעות כלי בחירת מצולע הסגלגלים סביב phagosomes, ולהוסיף אותם למנהל את ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה לנתח> כלים> מנהל ROI> להוסיף. למדוד יחס עוצמת zymosan על ידי לחיצה נוסף> Multi-מדוד ודה-בחירת השורה אחת לכל תיבת סימון פרוסה.
    6. לזמן לשגות סרטים, מסלול phagosomes אחד בכל פעם על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה, הקלדת Ctrl + M כדי למדוד כל נקודת זמן, ונע ההחזר על ההשקעה בעת צורך לעקוב אחר ערכי עוצמה לאורך זמן. העתק את המדידות מחלון התוצאות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
      הערה: ניתוח של 15 (5 קורסי זמן לניסוי x 3) ניסויים בלתי תלויים היא אידיאלית, אבל פחות או יותר עשוי להידרש בהתאם להשתנות נצפתה. שמירת ROIs תמיד מומלץ. כמה חבילות תוכנה מאפשרות Regi תמונהstration ועדכון דינמי של ROIs, להקל בחלק זה של הניתוח.
  2. המרה מקרינה לערכי pH
    1. מדוד את היחס 490/440 לphagosomes בזמן לשגות סרטי הכיול, כמתואר בסעיף 4.1.
    2. בגיליון אלקטרוני, להתוות ערכי היחס לאורך זמן, ולחשב את ערכי יחס הממוצע מכל phagosomes בתוך שדה הראייה (בדרך כלל, בין 5-20) מ -5 נקודות זמן בתוך אמצע תקופת הזמן המתאים לכל כיול pH פִּתָרוֹן. (ראה גם את התיבות האדומות באיור 5 א.)
    3. עלילה ערכים אלה ממוצע 490/440 יחס נגד pH נמדד בפועל. לשלב לפחות 3 כיולים עצמאיים לגרף אחד. השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית או מספרית לבצע רגרסיה ליניארית (עקומה בכושר הטובה ביותר), בדרך כלל למשוואת sigmoidal.
      הערה: לדוגמא, באיור 5 המשוואה השתמשה הייתה sigmoidal ולצמן [Y = + תחתון ((למעלה-למטה)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], שבו ערכי Y הם 490/440 יחסים, X הם ערכי pH ולמעלה, למטה, פרמטרים V50 ומדרון מחושבים על ידי התוכנה.
    4. השתמש במשוואה שהתקבלה להפוך ערכי יחס לpH.
      הערה: לדוגמא, באיור 5 המשוואה שהתקבלה עבור עקומת הכיול בנוכחות אזיד הנתרן היא 490/440 יחס = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . פתרון לpH נותן את המשוואה הבאה: pH = 6.993-.9291 * [LN ((1.178 / (יחס-1.103)) - 1))].

תוצאות

הם הבאים תוצאות נציג לניסוי שבו ה- pH phagosomal של נויטרופילים עכבר העיקריים מבודדים ממח העצם של פרא-סוג או Hvcn1 - / - עכברים הושוו. לניסוי מוצלח, חשוב להשיג מספיק phagosomes בתוך שדה הראייה בכל משך סרט הזמן לשגות, תוך הימנעות phagosomes רב מדי, שמאוחר יותר יהיה קשה יותר ?...

Discussion

למרות זמן רב יותר מאשר שיטות חלופיות, כגון ספקטרוסקופיה וFACS, אשר מעסיקות אסטרטגיה דומה של שימוש בצבע רגיש pH מצמידים את המטרות אבל למדוד את ה- pH הממוצע של אוכלוסיית phagosomes, מיקרוסקופיה מציעה מספר יתרונות. הראשון הוא שפנימי וחיצוני קשורים, אבל לא הפנים, חלקיקים יכולים בק?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors are financially supported by the Swiss National Science Foundation through an operating grant N° 31003A-149566 (to N.D.), and The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust through a Young Investigator Subsidy (to P.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Zymosan A powderSigma-AldrichZ4250Various providers exist
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250Various providers exist
Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)Santa Cruzsc-204107Toxic, use gloves, various providers exist
Diphenyleneiodonium chloride (DPI)Sigma-AldrichD2926Toxic, use gloves, various providers exist
Concanamycin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689Toxic, use gloves, various providers exist
NigericinSigma-AldrichN7143Toxic, use gloves, various providers exist
MonensinEnzoALX-380-026-G001Toxic, use gloves, various providers exist
Phosphate buffered saline (PBS)Life Technologies14200-075Various providers exist
Hank's balance salt solutionLife Technologies14025092Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795Various providers exist
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671 Various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375Various providers exist
N-Methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004 Various providers exist
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)Sigma-Aldrich3777Various providers exist
 Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma-AldrichT1503 Various providers exist
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9333Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Various providers exist
Absolute Ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich2860Various providers exist
Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted
Sonicating water bathO. Kleiner AGA sonicator may be used instead, various instrument providers exist
HeamocytometerMarienfeld GmbHVarious instrument providers exist
Widefield live imaging microscopeCarl Zeiss AGVarious instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.  
Peristaltic pump (Dynamax RP-1)RaininVarious instrument providers exist
pH meterSchott Gerate GmbHVarious instrument providers exist
Manual CounterMilian SAVarious instrument providers exist

References

  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?. Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106phagocytosispHratiometric

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved