Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

Резюме

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Аннотация

Фагоцитоз является фундаментальным процессом, через который врожденные иммунные клетки поглощают бактерии, апоптоза клеток или других инородных частиц для того, чтобы убивать или нейтрализовать проглоченного материала, или представить его в качестве антигенов и инициировать адаптивные иммунные реакции. РН фагосом является критическим параметром регулирования деление или слияние с endomembranes и активации протеолитических ферментов событий, которые позволяют фагоцитарная вакуоль, чтобы созреть в деструкции органелл. Кроме того, перемещение ^Н + необходим для производства высоких уровней активных форм кислорода (ROS), которые необходимы для эффективного уничтожения и сигнализации на другие ткани хозяина. Многие внутриклеточных возбудителей подорвать фагоцитарную убийство путем ограничения подкисление phagosomal, подчеркнув важность рН в фагосом биологии. Здесь мы опишем логометрического метод для измерения рН в phagosomal нейтрофилов с использованием флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) меченных зимозаном в фагоцитарной ТаргETS, и изображения живых клеток. Анализ основан на флуоресценции FITC свойств, который гасили кислом рН при возбуждении при 490 нм, но не при возбуждении при 440 нм, что позволяет количественно определить соотношение рН-зависимой, а не абсолютной флуоресценции, из одного красителя. Подробный протокол выполнения калибровки красителя месте и конверсии в соотношении реальных значений рН также предоставляется. Одноместный красителях логометрических методы, как правило, считается выше одной длины волны или двойной красителя псевдо-пропорциональный протоколов, так как они менее чувствительны к возмущениям, таких как отбеливание, изменение фокуса, лазерные изменения и неравномерное маркировку, которые искажают измеряемый сигнал. Этот метод может быть легко модифицирован для измерения рН в других фагоцитирующих клеточных типов, и зимозан можно заменить любым другим амина, содержащего частицы, из инертных бисера для живых микроорганизмов. Наконец, этот метод может быть адаптирован, чтобы сделать использование других флуоресцентных зондов, чувствительных к различным диапазонам рН или другой phagosomДеятельность аль, что делает его обобщенное протокол для функциональной визуализации в фагосом.

Введение

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material^1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O₂^- and its derivative reactive oxygen species (ROS) ^2,4.

The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes ^5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na⁺/H⁺ exchanger or ClC family Cl^-/H⁺ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H⁺ translocation ^9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils ^4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba ^13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H⁺ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H⁺ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme ^17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH ^22-24.

In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing ^25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism ²⁸. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)¹¹, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later ^29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH ^31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions ³³.

Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH ^34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies ³⁶, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses.

Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH ¹⁹. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm ³⁷. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

протокол

О себе этика: Все манипуляции животных проводились в строгом соответствии с руководящими принципами Исследовательского комитета животных из Университета Женевы.

1. Подготовка фагоцитарной Цели

1. Добавьте 20 мг сухого зимозаном 10 мл стерильной фосфатно-солевой буфер (PBS). Вихревые и тепло в водяной бане кипения в течение 10 мин. Прохладный и центрифуге при 2000 мкг в течение 5 мин.
2. Удалить супернатант, ресуспендируют в 1 мл PBS и гомогенат в течение 10 мин на водяной бане ультразвуком. Перевести 500 мкл до двух 1,5 мл пробирки. Центрифуга при 11000 мкг в течение 5 мин.
3. Повторите мыть с 500 мкл PBS. Вареные зимозан может быть аликвоты, замораживали и хранили при -20 ° С.
4. Промыть зимозаном дважды в 500 мкл свежеприготовленного 0,1 М _Na 2 CO _3, рН 9,3, как описано выше (этап 1.2).
5. Ресуспендируют в 490 мкл После последней промывки. Добавить 10 мкл 10 мг / мл FITC, растворенного в диметилсульфоксиде sulfoxidе (ДМСО), вихревые, накрыть фольгой и инкубируют при перемешивании в течение 4 ч при комнатной температуре.
6. Для удаления несвязанного красителя, мыть, как описано выше (шаг 1.2), сначала с 0,5 мл ДМСО + 150 мкл PBS, затем 0,5 мл ДМСО + 300 мкл PBS, а затем 0,5 мл ДМСО + 450 мкл PBS, а затем PBS в одиночку.
7. Граф зимозаном использованием гемоцитометра. Добавить 1 мкл зимозаном 500 мкл PBS, вихря, затем добавить 10 мкл на краю гемоцитометра камеру, где он встречает покровное находиться над центральной сетки. Установите гемоцитометра на ярко-поля микроскопа, снабженного целью 20X.
8. Сосредоточьтесь на верхней левом углу, содержащей 16 квадратов и рассчитывать все зимозаном частиц в этой области, используя руки Tally счетчик. Повторите с правом нижнем углу. Рассчитывают концентрацию зимозаном используя следующее уравнение: зимозан концентрации = Count / 2 х 500 х 10 ⁴ зимозаном / мл. Маркированный зимозан может быть аликвоты, замораживали и хранили при -20 ° С.
9. Opsonize меченого зимозаном Wiго кролика против зимозаном антитело при разведении 1: 100. Вихревые и инкубировать в течение 1 часа в водяной бане при 37 °. Промыть 500 мкл PBS, как описано выше (этап 1.2).
   Примечание: Озвучивание настоятельно рекомендуется, особенно после опсонизации, а зимозан имеет тенденцию к образованию комков, которые могут сделать анализ более трудным позже. Опсонизация с 65% об / об крысы или человеческой сыворотки могут быть использованы в качестве альтернативы.
10. Граф зимозаном помощью гемоцитометра, как описано в шагах 1,7-1,8, и разбавить до 100 х 10 ⁶ частиц / мл. Опсонизация с другими фагоцитирующих стимуляторов, таких как дополнение или нет опсонизация, может быть альтернативно выполнено.

2. Live Video микроскопия

1. Изолировать первичных нейтрофилы мыши, как описано подробно в другом месте ^38.
   1. В качестве альтернативы, можно использовать любой тип клеток фагоцитарной. Хранить нейтрофилов на льду в Roswell Park Memorial института (RPMI 1640) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (об / об), 200 Е пенициллина / streptomyciN, при концентрации 10 х 10 ⁶ клеток / мл до готовности к использованию. Другие типы клеток могут быть посеяны 1-4 дней раньше.
2. Добавить 2 х 10 ⁵ (20 мкл) нейтрофилов к центру 35 мм со стеклянным дном тарелки, распространение капельным путем добавления 50 мкл среды и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин, чтобы позволить клетки придерживаться.
3. Добавить 1 мл сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) нагревают до 37 ° С, содержащей специфический ингибитор MPO 4-аминобензойной гидразида (4-ABH, 10 мкМ). Неспецифические ингибиторы MPO, такие как азид натрия (5 мм), также могут быть использованы, но были недавно предложили оказывать дополнительные неспецифические эффекты на рН ^39.
4. Установите блюдо на флуоресценции Widefield микроскопа, снабженного 37 ° С системы отопления и нефти целью 40X. Инкубируйте клетки без изображения в течение 10 мин, чтобы позволить клетки и оборудование для уравновешивания.
5. Настройте параметры микроскопа приобрести имидж передачи ярко-поле [PHAсебе или дифференциального интерференционного контраста (ДИК), если имеется] с 440 нм или 490 нм возбуждения и 535 нм излучения каждые 30 сек.
6. Отрегулируйте время экспозиции и частоты сбора в соответствии с микроскопа системы, чтобы избежать слишком много фотообесцвечивание и фототоксичность и в зависимости от экспериментальных задаваемых вопросов. Начните получения изображения.
7. Через 2 мин, добавить 10 х 10 ⁶ (50 мкл) опсонизированным зимозаном FITC-к центру блюда. Регулировка целевой: коэффициенты клеток в зависимости от типа фагоцитов и цели используется.
8. Продолжить изображений в течение 30 мин. Через 30 мин остановить приобретение покадровой и запустить таймер. Перемещение на сцену и захватить 10 или более снимков в различных областях в целях изображения других фагосом, все в пределах 5 мин.

3. Калибровка и контрольные эксперименты

1. Подготовка к калибровке рН решения (рецепты описаны в таблице 1) до дня эксперимента и заморозить в 10 мл аликвоты.Растаяйте калибровочных растворов и теплой до 37 ° С на водяной бане. Проверяют рН с помощью рН-метра и записывать фактическую рН растворов.
2. Установите перистальтического насоса на дно стакана блюдо до получения изображения и выполнять живого видео микроскопии, как описано выше (раздел 2).
3. В конце периода сбора 30 мин повернуть насос на удалить решение в чашке, добавить 1 мл первого раствора калибровки и останавливает насос.
4. Подождите, пока сигнал не стабилизируется, как правило, 5 мин. Повторите с каждой калибровочного раствора.
   1. Выполнение по крайней мере, один калибровочный за день эксперимента, и калибровки, начиная с самой высокой рН и работает последовательно с самым низким, а также начиная с самой низкой рН и последовательно работает в направлении самой высокой.
5. В качестве контроля, добавляют 100 мкл 100 мкМ йодида ингибитор НАДФН-оксидазы дифенил propionium (ДОИ) разводят в HBSS в клетки в 900 мкл HBSS в стеклянным дном блюда, иинкубировать в течение 10 мин.
6. Начните приобретение и добавить зимозаном, как описано выше (шаг 2.7). Через 15 мин фагоцитоза, добавить 10 мкл 10 мкМ V-АТФазы ингибитора concanamycin A (CONCA), разбавленный в HBSS и продолжают визуализации в течение дополнительных 15 мин.

4. Анализ

1. Анализ покадровой фильмов и фагосомы снимков.
   Примечание: Следующие инструкции являются специфическими для ImageJ. Шаг за шагом инструкции могут широко варьироваться в зависимости от используемого программного обеспечения, но функции, описанные в этом разделе, доступны в большинстве профессиональных программ для анализа изображений.
   1. Откройте изображение с профессиональным программным обеспечением для анализа изображений. Вычтите фон в 490 канала, рисуя небольшую квадратную ROI с квадратной инструмент выбора многоугольника в области, где нет никаких клеток и нажав Плагины> BG вычитание из ROI. Тогда загрузите же ROI на 440 канала, нажав кнопку Изменить> Выбор> Восстановить выделенные и повторите.
   2. Сделайте соотношение 32-битное изображение в 490 канала, деленная на 440 канала, нажав процесса> Image Calculator ..., выбрав соответствующие изображения в раскрывающихся меню Image1 и image2, выбрав 'Divide' в раскрывающемся меню Операция и проверки результатов флажок 32-бит (с плавающей точкой).
   3. Изменение справочной таблицы цвета кодирования в колоризации отношение-совместимый, нажав на изображение> таблицы поиска> Радуга RGB. Порог отношение изображения по ликвидации 0 и бесконечность пикселей, нажав изображение> Adjust> Threshold .... Отрегулируйте полосы прокрутки, так что зимозан отображается красным цветом и нажмите кнопку Применить, убедившись, что набор фоновых пикселей флажок NaN в выборе.
   4. Добавьте к этому отношение стек с каналом ярко-поля в многоканальной композита, нажав изображение> Цвет> Объединить каналы, и выбора изображения ярко-поля в меню серым выпадающего канала и отношение изображения в выпадающем меню зеленый коридор, и выбравДержите исходные изображения флажок. Сканирование покадровой фильмы или снимки, чтобы определить, который фагосомы которые должны быть проанализированы. Канал ярко-поле полезно для этого.
   5. Нарисуйте регионы процентной (ROI), используя овальную полигон инструмент выбора вокруг фагосом, и добавить их к менеджеру ROI, нажав Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI> Добавить. Измерьте их отношение зимозаном интенсивности, нажав Дополнительно> Multi-Мера и де-выбору одной строке на срез флажке.
   6. Для покадровой фильмы, трек Фагосомы по одному, опираясь окупаемости инвестиций, набрав Ctrl + M, чтобы измерить каждый момент времени, и перемещение ROI, когда необходимо отслеживать значения интенсивности в течение долгого времени. Скопируйте измерения в окне результатов в программное обеспечение электронной таблицы.
      Примечание: Анализ 15 (5 времени курсов в эксперименте х 3) независимых экспериментов является идеальным, но более или менее может потребоваться в зависимости от изменчивости наблюдается. Сохранение трансформирования всегда рекомендуется. Некоторые программные пакеты позволяют изображения RegiStration и динамическое обновление трансформирования, облегчая эту часть анализа.
2. Переход от флуоресценции в значениях рН
   1. Измерьте соотношение 490/440 для фагосом в калибровочных покадровой фильмов, как описано в разделе 4.1.
   2. В таблице, участок значения соотношения с течением времени, и вычислить средние значения соотношении от всех фагосомах в поле зрения (обычно, 5-20) от 5 временных точках в пределах середине периода времени, соответствующего каждой калибровки рН решение. (Смотрите также красные коробки на рисунке 5а.)
   3. Участок эти средние значения 490/440 соотношение против фактического измеряемого рН. Комбинат по крайней мере 3 независимых калибровки в одном графике. Используйте статистическую или числовое пакет программного обеспечения для выполнения нелинейной регрессии (лучше подходит кривая), как правило, сигмоидальной уравнения.
      Примечание: Например, на рисунке 5В уравнение использовали сигмоидальной Больцмана [Y = Низ + ((верх-низ)/ (1 + EXP ((V50-Х) / Наклон))], где значения Y являются 490/440 отношения, Х являются значения рН и сверху, снизу, V50 и наклон параметры, рассчитанные с помощью программного обеспечения.
   4. Используйте полученное уравнение для преобразования значения соотношения рН.
      Примечание: Например, на фиг.5В уравнение получено для калибровочной кривой в присутствии азида натри 490/440 Коэффициент = 1,103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6,993-рН) /0.9291)] . Решение для рН дает следующее уравнение: рН = 6,993 - 0,9291 * [Ln ((1,178 / (Коэффициент-1,103)) - 1))].

Результаты

Ниже приведены представительные результаты эксперимента, где phagosomal рН первичных нейтрофилов мыши, выделенных из костного мозга дикого типа или Hvcn1 ^{- / -} мышей по сравнению. Для успешного эксперимента, важно, чтобы получить достаточное количество Фагосомы в поле зрения в...

Обсуждение

Хотя больше времени, чем альтернативных методов, таких, как спектроскопии и FACS, которые используют подобную стратегию использования конфиденциальной рН красителя в сочетании с целями, но измеряют среднее значение рН населением фагосом, микроскопия имеет ряд преимуществ. Первое, что в?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymosan A powder	Sigma-Aldrich	Z4250	Various providers exist
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F7250	Various providers exist
Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Toxic, use gloves, various providers exist
Diphenyleneiodonium chloride (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Toxic, use gloves, various providers exist
Concanamycin A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Toxic, use gloves, various providers exist
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Toxic, use gloves, various providers exist
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14200-075	Various providers exist
Hank's balance salt solution	Life Technologies	14025092	Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Various providers exist
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
N-Methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Various providers exist
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Absolute Ethanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted
Sonicating water bath	O. Kleiner AG		A sonicator may be used instead, various instrument providers exist
Heamocytometer	Marienfeld GmbH		Various instrument providers exist
Widefield live imaging microscope	Carl Zeiss AG		Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.
Peristaltic pump (Dynamax RP-1)	Rainin		Various instrument providers exist
pH meter	Schott Gerate GmbH		Various instrument providers exist
Manual Counter	Milian SA		Various instrument providers exist