Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Zusammenfassung

Phagozytose ist ein grundlegender Prozess, durch den angeborenen Immunzellen zu verschlingen Bakterien, apoptotischen Zellen oder andere Fremdkörper, um zu töten oder zu neutralisieren, die verschluckt Material oder um sie als Antigene zu präsentieren und zu initiieren adaptiven Immunantwort. Der pH der Phagosomen ist ein kritischer Parameter zur Regelung Spaltung oder Fusion mit Endomembranen und Aktivierung der proteolytischen Enzyme, Ereignisse, die phagozytischen Vakuolen in eine abbau Organell ausreifen. Zusätzlich wird die Translokation von H ⁺ zur Herstellung hoher Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die für eine effiziente Töten und Signalisierung zu anderen Wirtsgeweben erforderlich. Viele intrazelluläre Pathogene zu untergraben phagocytic Tötung durch Begrenzung phagosomalen Versauerung, der die Bedeutung der pH-Wert im Phagosom Biologie. Hier beschreiben wir eine ratiometrische Verfahren zur Messung phagosomalen pH in Neutrophilen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem Zymosan als phagozytischen targets, und Live-Cell-Imaging. Der Test basiert auf der Fluoreszenzeigenschaften von FITC, die durch saure pH abgeschreckt wird, wenn bei 490 nm angeregt wird, aber nicht, wenn sie bei 440 nm angeregt wird, so dass die Quantifizierung von einer pH-abhängigen Verhältnis statt der absoluten Fluoreszenz eines einzelnen Farbstoffs. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung einer in situ-Farbstoff Kalibrierung und Umwandlung des Verhältnisses realen pH-Werten ist ebenfalls vorgesehen. Single-Farbstoff ratiometrische Verfahren werden im Allgemeinen als überlegen einzigen Wellenlänge oder Dual-Farbstoff pseudo-ratiometrische Protokolle, da sie weniger empfindlich auf Störungen, wie beispielsweise Bleich sind, konzentrieren sich ändert, Laser-Variationen und unebene Kennzeichnung, die das Messsignal verfälschen. Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden, um in anderen pH phagozytischen Zelltypen zu messen und Zymosan durch jede andere aminhaltige Teilchen ersetzt werden, von inerten Kügelchen zu lebenden Mikroorganismen. Schließlich kann dieses Verfahren angepaßt werden, um die Verwendung von anderen fluoreszierenden Sonden empfindlich auf unterschiedliche pH-Bereiche oder andere phagosom machenal-Aktivitäten, so dass es eine allgemeine Protokoll für die funktionelle Bildgebung des Phagosomen.

Einleitung

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material^1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O₂^- and its derivative reactive oxygen species (ROS) ^2,4.

The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes ^5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na⁺/H⁺ exchanger or ClC family Cl^-/H⁺ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H⁺ translocation ^9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils ^4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba ^13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H⁺ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H⁺ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme ^17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH ^22-24.

In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing ^25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism ²⁸. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)¹¹, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later ^29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH ^31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions ³³.

Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH ^34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies ³⁶, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses.

Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH ¹⁹. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm ³⁷. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

Protokoll

Ethik Hinweise: Alle Tier Manipulationen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierforschungsausschuss der Universität Genf durchgeführt.

1. Herstellung von Phagozytische Ziele

1. Werden 20 mg getrocknetes Zymosan bis 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Wirbel und in einem kochenden Wasserbad für 10 min. Kühl und Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min.
2. Entfernen Sie den Überstand resuspendieren in 1 ml PBS und beschallen für 10 Minuten in einem Wasserbad Ultraschallgerät. Übertragen Sie 500 ul zu zwei 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min.
3. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 500 ul PBS. Die gekochten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert.
4. Zweimal waschen Zymosan in 500 ul frisch hergestellte 0,1 M Na _{2 CO 3,} pH 9,3, wie oben beschrieben (Schritt 1.2).
5. Resuspendieren in 490 & mgr; l nach dem letzten Waschen. Zugabe von 10 ul 10 mg / ml FITC in Dimethylsulfoxid gelöst sulfoxide (DMSO), Wirbel, mit Folie abdecken, und Inkubation unter Rühren 4 Stunden bei RT.
6. Um ungebundene Farbe zu entfernen, wie oben (Schritt 1.2) waschen, zuerst mit 0,5 ml DMSO + 150 & mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 300 & mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 450 & mgr; l PBS, dann PBS alleine.
7. Graf Zymosan mit einem Hämocytometer. 1 ul Zymosan zu 500 ul PBS, Wirbel, dann werden 10 & mgr; l an den Rand des Hämocytometer Kammer, wo es das Deckglas über das zentrale Netz platziert erfüllt. Montieren Sie das Hämocytometer auf einer Hellfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv ausgestattet.
8. Konzentrieren Sie sich auf der oberen linken Ecke, die 16 Plätze und zählt alle Zymosan Partikel in diesem Bereich mit einem Handtallykostenzähler. Wiederholen Sie mit der rechten unteren Ecke. Berechnen die Zymosan-Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung: Zymosan Konzentration = Count / 2 x 500 x 10 ⁴ Zymosan / ml. Markierten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert.
9. Opsonisieren das markierte Zymosan with ein Kaninchen-Anti-Zymosan Antikörper bei 1: 100 Verdünnung. Vortex und Inkubation für 1 Stunde in einem 37 ° C Wasserbad. Mit 500 & mgr; l PBS waschen, wie oben beschrieben (Schritt 1.2).
   Hinweis: Die Beschallung ist sehr zu empfehlen, vor allem nach Opsonisierung, wie Zymosan neigt dazu, Klumpen, die später auf der Analyse erschweren kann bilden. Opsonisierung mit 65% v / v Ratten- oder Humanserum kann als Alternative verwendet werden.
10. Zählen Zymosan mit einem Hämocytometer wie in den Schritten 1.7-1.8 beschrieben, und mit Wasser auf 100 x 10 ^{& sup6; Teilchen} / ml. Opsonisierung mit anderen phagozytischen Stimulatoren wie Komplement oder keinen Opsonierung kann alternativ durchgeführt werden.

2. Live Video-Mikroskopie

1. Isolieren primäre Maus Neutrophilen, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben ^38.
   1. Alternativ können Sie jede phagozytischen Zelltyp. Halten Neutrophilen auf Eis in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5% fötalem Kälberserum (v / v), 200 U Penicillin / streptomyci ergänztn, in einer Konzentration von 10 x ¹⁰ 6 Zellen / ml bis zur Verwendung. Andere Zelltypen kann 1-4 Tage vor ausgesät werden.
2. In ² × 10 5 (20 ul) von Neutrophilen an der Mitte einer 35 mm Glasbodenschale, verbreiten sie den Tropfen durch Zugabe von 50 ul Medium und bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Zellen zu haften.
3. 1 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) bis 37 ° C, die die spezielle MPO-Inhibitor 4-Amino-hydrazid (4-ABH, 10 & mgr; M) erwärmt. Unspezifische MPO-Inhibitoren, wie Natriumazid (5 mM), können ebenfalls verwendet werden, jedoch wurden kürzlich vorgeschlagen, um zusätzliche nicht-spezifischen Effekte auf pH ³⁹ auszuüben.
4. Montieren Sie den Teller auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem 37 ° C Heizungsanlage und einem 40X Öl-Objektiv ausgestattet. Inkubieren Zellen ohne Bildgebung für 10 Minuten, damit Zellen und Anlagen ins Gleichgewicht.
5. Passen Sie die Mikroskopeinstellungen, um eine TEM-Hellfeldbild zu erwerben [phase oder Differentialinterferenzkontrast (DIC), falls verfügbar] mit 440 nm oder 490 nm Anregungs- und 535 nm Emissions alle 30 sec.
6. Die Belichtungszeit und die Erfassungsfrequenz entsprechend dem Mikroskopsystem zu viel Photobleichen und Phototoxizität und in Abhängigkeit von den experimentellen Fragen gestellt vermeiden. Start der Bildaufnahme.
7. Nach 2 min, fügen Sie 10 x 10 ⁶ (50 ul) opsonisiertes FITC-Zymosan in die Mitte der Schale. Einstellen target: Zellverhältnissen in Abhängigkeit von der Art von Phagozyten und Ziel verwendet.
8. Weiterhin Bildgebung für 30 min. Nach 30 Minuten beenden Sie den Zeitraffer-Akquisition und starten Sie einen Timer. Bewegen Sie die Bühne und erfassen 10 oder mehr Snapshots in unterschiedlichen Sicht für Bild in anderen Phagosomen, alle innerhalb von 5 min.

3. Kalibrierung und Kontrollexperimente

1. Vorbereitung der pH Kalibrierlösungen (Rezepturen sind in Tabelle 1 beschrieben) vor dem Tag des Experiments und gefrier in 10 ml-Aliquots.Tauen die Kalibrierungslösungen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Den pH-Wert mit einem pH-Meter und Aufzeichnung der tatsächlichen pH-Wert der Lösungen.
2. Montieren Sie eine peristaltische Pumpe an der Bodenschale Glas vor der Bildaufnahme und führen Sie Live-Videomikroskopie, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben.
3. Am Ende der 30 Minuten Erfassungsperiode schalten Sie die Pumpe auf, um die Lösung in der Schale zu entfernen, fügen Sie 1 ml der erste Kalibrierungslösung und die Pumpe stoppen.
4. Warten Sie, bis das Signal stabilisiert, in der Regel 5 min. Wiederholen Sie mit die Eichlösungen.
   1. Zuführen mindestens eine Kalibrierung pro Versuchstag und kalibrieren, beginnend mit dem höchsten pH-Wert und arbeiten sequentiell auf den niedrigsten, sowie ausgehend von dem niedrigsten pH-Wert und arbeiten sequentiell in Richtung der Höhe.
5. Als Kontrolle wurden 100 ul 100 uM NADPH-Oxidase-Hemmer diphenyl propionium Iodid (DPI) in HBSS, um Zellen in der Bodenschale Glas verdünnt in 900 & mgr; l HBSS, undInkubation für 10 min.
6. Starten Akquisition und fügen Zymosan wie oben (Schritt 2.7). Nach 15 min der Phagozytose, mit 10 ul 10 uM V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A (ConcA) in HBSS verdünnt und weiter Bildgebung für weitere 15 min.

4. Analyse

1. Analyse von Zeitraffer-Filmen und Phagosom Snapshots.
   Hinweis: Die folgenden Anweisungen spezifisch für ImageJ sind. Schritt-für-Schritt-Anleitungen können in Abhängigkeit von der verwendeten Software unterschiedlich sein, aber die in diesem Abschnitt beschriebenen Funktionen sind in den meisten professionellen Bildanalyse-Software.
   1. Öffnen Sie die Bilder mit professionellen Bildanalyse-Software. Subtrahieren Sie den Hintergrund in der 490-Kanal, indem ein kleines Quadrat ROI mit dem Quadrat Polygon Auswahl-Werkzeug in einem Bereich, wo es keine Zellen, und klicken Sie auf Plugins> BG Subtraktion von ROI. Dann laden Sie die gleiche ROI auf der 440-Kanal, indem Sie auf Bearbeiten> Auswahl> Auswahl wiederherstellen und wiederholen.
   2. Machen Sie eine 32-Bit-Verhältnis Bild des 490 Kanal geteilt durch die 440-Kanal, indem Sie Prozess> Bild Calculator ..., eine entsprechende Bilder in den Image1 und Image2 Dropdown-Menüs, wählen Sie dann 'Teilen' im Dropdown-Menü Bedienung und die Überprüfung der 32-bit (float) Ergebnis Kontrollkästchen.
   3. Ändern Sie die Farbcodierung Verweistabelle auf ein Verhältnis-kompatiblen Farbcodierung, indem Sie auf Bild> Lookup Tables> Rainbow RGB. Threshold das Verhältnis Bild, um es durch Anklicken zu beseitigen Bild 0 und unendlich Pixel> Anpassen> Schwellenwert .... Passen Sie die Bildlaufleisten, so dass Zymosan in rot angezeigt wird, und klicken Sie auf Anwenden, sicherstellen, dass die Set Hintergrundpixel Kontrollkästchen NaN, um ausgewählt.
   4. Kombinieren Sie dieses Verhältnis Stapel mit der Hellfeld-Kanal in einem Mehrkanal-Verbund indem Sie auf Bild> Farbe> Merge Kanäle, und die Auswahl der Hellfeldbild in der grauen Kanal Dropdown-Menü und das Verhältnis Bild im Grünkanal im Dropdown-Menü, und Auswählen desHalten Sie Quellbilder Check-Box. Scannen Sie die Zeitraffer-Filme oder Snapshots, um festzustellen, die Phagosomen analysiert werden sollen. Die Hellfeldkanal ist sinnvoll, für diese.
   5. Zeichnen Sie Bereiche von Interesse (ROI) mit dem ovalen Polygon-Auswahl-Werkzeug in der Umgebung von Phagosomen und fügen Sie sie der ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren> Tools> ROI Manager> hinzufügen. Messen Sie ihren Zymosan Intensitätsverhältnis, indem Sie auf Mehr> Multi-Measure und Abwahl der eine Zeile pro Stück Kontrollkästchen.
   6. Für Zeitraffer-Filme, Phagosomen Spur ein zu einer Zeit, indem eine ROI, tippen Sie Strg + M zu jedem Zeitpunkt zu messen, und das Bewegen des ROI, wenn notwendig, um Intensitätswerte über die Zeit zu verfolgen. Kopieren Sie die Messungen aus dem Ergebnisfenster in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
      Anmerkung: Analyse von 15 (5 Zeitverläufe pro Experiment x 3) unabhängigen Experimenten ist ideal, aber in Abhängigkeit von der beobachteten Variabilität kann mehr oder weniger erforderlich sein. Speichern der ROIs wird immer empfohlen. Einige Softwarepakete ermöglichen Bild registration und dynamische Aktualisierung von ROIs, diesen Teil der Analyse zu erleichtern.
2. Umwandlung von Fluoreszenz auf pH-Werte
   1. Messen Sie das Verhältnis 490/440 für Phagosomen in den Kalibrierungs Zeitraffer-Filme, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.
   2. In einer Tabellenkalkulation, zeichnen die Verhältniswerte über die Zeit und berechnet die Durchschnittsverhältniswerte von allen Phagosomen innerhalb des Sichtfeldes (gewöhnlich 5-20) 5 Zeitpunkten innerhalb der Mitte der Zeitperiode entsprechend jedem pH-Kalibrierung Lösung. (Siehe auch die roten Kästen in 5A.)
   3. Zeichnen Sie diese durchschnittlich 490/440 Ratio-Werte gegenüber dem tatsächlich gemessenen pH-Wert. Kombinieren Sie mindestens 3 unabhängigen Kalibrierungen in einem einzigen Graphen. Verwenden Sie einen statistischen oder numerische Software-Paket, um eine nichtlineare Regression (Best-Fit-Kurve) durchführen, in der Regel an einen sigmoidalen Gleichung.
      Hinweis: Zum Beispiel in 5B die Gleichung verwendet wurde, war eine Boltzmann sigmoidal [Y = Bottom + ((Oben-Unten)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], wobei Y-Werte sind die 490/440-Verhältnisse, X sind die pH-Werte und die Oben, Unten, sind V50 und Steigungsparameter von der Software berechnet.
   4. Verwenden Sie die erhaltene Gleichung zur Verhältniswerte um pH zu verwandeln.
      Hinweis: Zum Beispiel in 5B die für die Eichkurve in Gegenwart von Natriumazid erhalten Gleichung 490/440 Verhältnis = 1,103 + [(2,89 bis 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Die Auflösung nach pH ergibt die folgende Gleichung: pH = 6,993 - 0,9291 * [LN ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))].

Ergebnisse

Die folgenden sind repräsentative Ergebnisse für ein Experiment, wo die phagosomalen pH-Wert der primären Maus Neutrophile aus dem Knochenmark von Wildtyp oder isoliert Hvcn1 ^{- / -} Mäuse wurden verglichen. Für ein erfolgreiches Experiment ist es wichtig, genug Phagosomen im Sichtfeld während der gesamten Dauer des Zeitraffer-Film zu erhalten, bei gleichzeitiger Vermeidung zu viele Phagosomen, die später sein wird schwieriger Segment während der Bildanalyse. 1 schema

Diskussion

Obwohl zeitaufwendiger als alternative Verfahren, wie Spektroskopie und FACS, die eine ähnliche Strategie unter Verwendung eines pH-empfindlichen Farbstoff, Ziele gekoppelt einzusetzen, sondern messen die durchschnittliche pH-Wert einer Population von Phagosomen, bietet mikroskopische mehrere Vorteile. Erste ist, dass innere und äußere gebunden, aber nicht internalisierten Partikel können leicht unterschieden werden, ohne andere Chemikalien, wie Trypan-Blau oder Antikörper hinzuzufügen, Abschreckhärtung oder Etik...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymosan A powder	Sigma-Aldrich	Z4250	Various providers exist
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F7250	Various providers exist
Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Toxic, use gloves, various providers exist
Diphenyleneiodonium chloride (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Toxic, use gloves, various providers exist
Concanamycin A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Toxic, use gloves, various providers exist
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Toxic, use gloves, various providers exist
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14200-075	Various providers exist
Hank's balance salt solution	Life Technologies	14025092	Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Various providers exist
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
N-Methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Various providers exist
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Absolute Ethanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted
Sonicating water bath	O. Kleiner AG		A sonicator may be used instead, various instrument providers exist
Heamocytometer	Marienfeld GmbH		Various instrument providers exist
Widefield live imaging microscope	Carl Zeiss AG		Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.
Peristaltic pump (Dynamax RP-1)	Rainin		Various instrument providers exist
pH meter	Schott Gerate GmbH		Various instrument providers exist
Manual Counter	Milian SA		Various instrument providers exist