Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

Resumen

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Resumen

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Introducción

En los mamíferos, la progresión del ciclo celular depende de eventos altamente ordenadas controlados por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) ^1. A través de su citoplasmática, nuclear, y la localización centrosómicas, CyclinB1 / Cdk1 es capaz de sincronizar diferentes eventos en la mitosis tales como rotura de la envuelta nuclear y la separación del centrosoma ^2. CyclinB1 / Cdk1 protege a las células contra la apoptosis mitótico ³ y promueve la fisión mitocondrial, un paso crítico para una distribución equitativa de las mitocondrias de las células hijas recién formadas ^4.

En la proliferación de células de mamíferos, mitocondrial ATP se genera a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) maquinaria (cadena de transporte de electrones), que se compone de 5 complejos de múltiples subunidades; complejo I - complejo V (IC-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): ubiquinona oxidorreductasa o complejo I (CI) es la más grande y menos comprendido de los cinco complejos ^5. El complejo consists de 45 subunidades, 14 de los cuales forman el núcleo catalítico. Una vez montado, el complejo adopta una estructura en forma de L con un brazo que sobresale en la matriz y el otro brazo incrustado en el ^6,7 membrana interna. Las mutaciones en las subunidades de CI son la causa de una variedad de trastornos mitocondriales ^8. Se requiere un CI funcionalmente eficiente en la fosforilación oxidativa, no sólo para la respiración mitocondrial general ^9, sino también para la progresión del ciclo celular con éxito ^10. Desentrañar los mecanismos que subyacen al funcionamiento de este complejo enzimático unido a la membrana en la salud y la enfermedad podría permitir el desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y estrategias terapéuticas avanzadas. En un estudio reciente, se ha encontrado que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria en el G2 (mitosis) fase M (Gap 2) / y fosforila subunidades IC para mejorar la producción de energía mitocondrial, potencialmente, para compensar el aumento de las necesidades de energía de las células durante celular ciclo de ^11. Aquí nos Showcase procedimientos experimentales y las estrategias que se pueden utilizar para estudiar la translocación mitocondrial de quinasas de otro modo núcleo / citoplasma, sus sustratos mitocondrial, así como consecuencias funcionales de su localización mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como un ejemplo.

El hallazgo de que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria cuando sea necesario se le solicite los estudios de sobreexpresión y desmontables de este complejo-mitocondria específica. Para conseguir la expresión-mitocondria específico de proteínas, se puede añadir una secuencia de mitocondrias de orientación (MTS) en el N-terminal de la proteína de interés. Las mitocondrias de orientación secuencias permiten la clasificación de las proteínas mitocondriales en las mitocondrias, donde residen normalmente ^12. Hemos utilizado una secuencia dirigida a las mitocondrias 87 de base procedentes del precursor de la citocromo oxidasa subunidad humana c 8A (COX8) y se clonó en Green Fluorescent Protein (GFP)-etiquetados CyclinB1 o rojo fluorescenteProteína (RFP)-etiquetados Cdk1 que contiene plásmidos en el marco. Este método nos ha permitido también identificar los CyclinB1 y Cdk1 en la mitocondria, cambiando específicamente la expresión mitocondrial de estas proteínas sin afectar a su piscina nuclear. Mediante el etiquetado con fluorescencia estas proteínas, hemos sido capaces de controlar su localización en tiempo real. Del mismo modo, hemos introducido MTS en un plásmido que contiene RFP-etiquetados dominante Cdk1 negativo, lo que permitió a la detonación específicamente por la expresión mitocondrial y funciones de Cdk1. Es esencial distinguir entre las funciones mitocondriales y nucleares de las quinasas que tienen localizaciones duales como Cdk1. Ingeniería MTS en el N-terminal de estas quinasas duales funcionales ofrece una gran estrategia que es fácil de ser empleado y eficaz.

Desde Cdk1 es un ciclo celular quinasa, es fundamental para determinar la progresión del ciclo celular cuando Cdk1 se localiza en las mitocondrias. Para lograr esto, hemos utilizado un nuevo method para supervisar el contenido de ADN en las células. Los métodos tradicionales incluyen el uso de BrdU (bromodesoxiuridina), un análogo de timidina sintético, que incorpora en el ADN recién sintetizado durante la fase S del ciclo celular para sustituir timidina. A continuación, las células que están replicando activamente su ADN se pueden detectar usando anticuerpos anti-BrdU. Una desventaja de este método es que requiere la desnaturalización del ADN para proporcionar acceso para el anticuerpo BrdU por métodos agresivos como tratamiento con ácido o calor, que pueden resultar en inconsistencia entre los resultados de ^13,14. Alternativamente, se utilizó un enfoque similar para monitorear las células que se dividen activamente con un análogo de la timidina diferente, edu. EdU detección no requiere desnaturalización del ADN duras como tratamiento detergente suave permite que el reactivo de detección para acceder a la UDE en el ADN recién sintetizado. El método EdU ha demostrado ser más fiable, consistente y con un potencial de análisis de alto rendimiento ^15.

Finalmente, to determinar los sustratos mitocondriales de Cdk1, se utilizó una herramienta de proteómica llamado 2D-DIGE, que es una versión avanzada de la electroforesis bidimensional en gel clásico. Dos electroforesis dimensional separa las proteínas en función de su punto isoeléctrico en la primera dimensión y el peso molecular en el segundo. Desde modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación afectan el punto isoeléctrico y el peso molecular de las proteínas, geles 2D pueden detectar las diferencias entre los estados de fosforilación de las proteínas dentro de las diferentes muestras. El tamaño (área e intensidad) de la proteína de spots de cambios con el nivel de expresión de las proteínas, lo que permite la comparación cuantitativa entre múltiples muestras. Usando este método, hemos sido capaces de diferenciar las proteínas fosforiladas en el tipo salvaje frente a las células que expresan Cdk1 mitocondrias orientada mutantes. Se aislaron las manchas de proteínas específicas que mostraron en el tipo salvaje, pero faltaban en el mutante preparación Cdk1 mitocondrias y las orientadas poridentificado mediante espectrometría de masas.

En los geles en 2D tradicionales, colorantes de trifenilmetano se utilizan para visualizar las proteínas en el gel. 2D-DIGE utiliza etiquetas de la proteína fluorescente con un efecto mínimo sobre la movilidad electroforética de proteínas. Diferentes muestras de proteína pueden ser marcadas con diferentes colorantes fluorescentes, mezclados entre sí y separadas por los geles idénticos, lo que permite la co-electroforesis de múltiples muestras en un solo gel ^16. Esto minimiza las variaciones de gel a gel, lo cual es un problema crítico en estudios de proteómica a base de gel.

Protocolo

1. Aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas

1. Preparación de aislamiento de células Buffer (IBC) Buffer
   1. Preparar 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N morfolino) propanosulfónico): Disolver 12,1 g de Tris en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando MOPS en polvo, añadir agua destilada hasta un total volumen de 1 L y se almacena a 4 ^° C
   2. Preparar 0,1 M EGTA (etilenglicol bis (éter de 2-aminoetil) tetraacético) / Tris: Disolver 38,1 g de EGTA en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando polvo de Tris, añadir agua destilada hasta un volumen total de 1 l y almacenar a 4 ^° C.
   3. Preparar 1 M de sacarosa: Disolver 34,23 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada, hacer alícuotas de 20 ml y se almacena a -20 ^° C.
   4. Preparar tampón _C IB: Preparar 100 ml de IB _c Buffer por adición de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS y 1 ml de 0,1 M EGTA / Tris a 20 ml; De 1 M de sacarosa. Añadir agua destilada hasta un volumen total de 100 ml. Ajustar el pH a 7,4.
2. Preparación de Tampón de Lisis Celular
   1. Preparar el tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM (ácido etilen diamino), EGTA 1 mM, 1% de Triton-X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM β- glicerofosfato, 1 mM ortovanadato de sodio. Añadir inhibidores de proteinasa 1 mg / ml de leupeptina y PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) justo antes de su uso.
3. Aislamiento de mitocondrias
   1. Cosecha 3 x 10 ⁷ células con enfriado con hielo 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4 y centrifugar las células a 600 xg durante 10 min a 4 ^° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón IB _c 5 ml enfriado con hielo.
   2. Homogeneizar las células utilizando un triturador de tejidos de vidrio / vidrio durante aproximadamente 10 min. Transferir el homogeneizado a un tubo de 15 ml y centrifugar a 600 g durante 10 millasn a 4 ^° C. Para mitocondrias funcional, se utiliza el acoplamiento de vidrio / teflón, ya que es menos perjudicial para mitocondrias que el triturador de tejidos de vidrio / vidrio.
   3. Recoger el sobrenadante en tubos de 1,5 ml y centrifugar a 7000 xg durante 10 min a 4 ^° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml y guardar como proteína de citosol.
   4. Lavar el sedimento (mitocondrias) dos veces con tampón IB _c enfriado con hielo 200 l y se centrifuga a 7000 xg durante 10 min a 4 ^° C.
   5. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en el tampón de lisis celular y usarlo inmediatamente o almacenar a -80 ^° C para su uso futuro. Si se necesitan las mitocondrias funcionales, volver a suspender el sedimento en el tampón restante después de descartar el sobrenadante. La dilución de la fracción mitocondrial adicional puede resultar en la pérdida de la función de las mitocondrias. Almacenar en hielo y el uso de la preparación in 1 - 3 horas para obtener mejores resultados.
   6. Sonicar el sedimento se volvió a suspender durante treinta ráfagas de 3 seg en unabaño de hielo, se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min, y guardar el sobrenadante como la fracción mitocondrial.

2. Co-inmunotinción de Cdk1, CyclinB1 y COXIV, una proteína mitocondrial Residente

1. Crecer 5 x 10 ⁴ células en cubreobjetos en placas de 24 pocillos O / N o hasta el 70% de confluencia. Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 500 l enfriado en hielo 1 x PBS, pH 7,4.
2. Fijar las células con 500 l enfriado en hielo paraformaldehído al 4% a TA durante 10 min. Aspirar la solución de fijación y se lavan las células con 500 l 1 x PBS 3 veces, 5 minutos cada uno con agitación suave a temperatura ambiente.
3. Permeabilizar las células con 0,2% Triton X-100 en 500 l de PBS durante 5 min a TA. Aspirar la solución y se lavan las células 3 veces, 5 minutos cada uno con 500 l de PBS. Añadir la solución de bloqueo (500 l, 1% de BSA (albúmina de suero bovino) en PBS que contenía 1% de Tween 20) durante 30 min a TA.
4. Diluir los anticuerpos primarios 1: 250 (v: v) en 5001; l de solución de bloqueo e incubar las células con anticuerpos primarios deseados planteadas en diferentes especies para evitar la señalización de cruz (CyclinB1 (ratón) y COXIV (conejo) o Cdk1 (ratón) y COXIV (conejo) a TA durante 30 - 60 min o O / N a 4 ^° C.
5. Lavar los cubreobjetos con 500 l de 1 x PBS 3 veces, 5 minutos cada uno y luego se incuba con el anticuerpo secundario diluido 1: 1000 en 500 l solución a TA durante 1 h seguido de lavado con 500 l de PBS 3 veces, 5 min cada bloqueo.
6. Montar el cubreobjetos con 20 l de solución de montaje anti-fade y sellar las diapositivas con esmalte de uñas. Imagen de las diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia de inmediato o se mantienen en la oscuridad a 4 ^° C durante 1 - 2 semanas.

3. Carbonato de Sodio La extracción de mitocondrias intactas

1. Crecer de aproximadamente 20 x 10 ⁷ células, cosecha, lavado una vez con PBS y aislar las mitocondrias como se describe en la sección 1. mitocondrial Divide en dos aislamientos parts antes de la última centrifugación para sedimentar las mitocondrias (antes del paso 1.3.4); salvo un medio para ser utilizado como la mitocondria total (paso 3.2), utilizar el otro medio para la extracción de carbonato de sodio (siguiendo los pasos 3.3 a 3.6) para separar las proteínas unidas solubles y de membrana.
2. Lyse las mitocondrias total del pellet con 30 l de tampón de lisis celular y almacenar el lisado a -80 ^° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.
3. Añadir 250 l de 0,1 M Na ₂ CO ₃ (carbonato de sodio), pH 11,0, a la otra mitad de la pastilla mitocondrial e incubar en hielo durante 30 min.
4. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante y proceda al paso 3.5. Lyse el sedimento usando 30 l de tampón de lisis celular y se somete a ultrasonidos como en el paso 1.3.6. Almacenar a -80 ^° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.
5. Añadir un volumen igual de 20% de ácido tricloroacético recién hecho (TCA) al sobrenadante para precipitar las proteínas y mantener en hielo durante 30 min.
6. CentrifUGE a 15.000 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante, disolver el precipitado en 80 l de tampón de lisis celular y se almacena a -80 ^° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.

4. La separación de membranas interior y exterior de las mitocondrias (Aislamiento de Mitoplasts)

1. Crecer de aproximadamente 20 x 10 ⁷ células, cosecha, lavado una vez con PBS y aislar las mitocondrias como se describe en el apartado 1. Separar las fracciones mitocondriales en 10 porciones iguales antes de la última centrifugación para sedimentar las mitocondrias (antes de la etapa 1.3.4).
2. Disolver cada sedimento en 30 l de la concentración indicada de tampón de sacarosa hipotónica (EDTA 1 mM, 10 mM MOPS / KOH (hidróxido de potasio), pH 7,2; concentración de sacarosa que oscila desde 25 hasta 200 mM) con o sin 50 mg / ml de tripsina ( véase la Tabla 1) y se incuba 30 min en hielo.
3. Añadir 3 l de PMSF 10 mM (para llegar a una concentración final de PMSF 1 mM) a la tripsina que contiene viales para detener tque la digestión con tripsina y se incuba en hielo durante 10 min.
4. Centrifugar a 14.000 xga 4 ^° C durante 10 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, lisar el precipitado en 30 l de tampón de lisis celular, se somete a ultrasonidos como en el paso 1.3.6, y se almacena a -80 ^° C

5. Construcción de mitocondrias-dirigida de GFP / RFP-etiquetados CyclinB1 / Cdk1 vectores y la confirmación de su localización mitocondrial

1. Clonar la mitocondria secuencia de direccionamiento (MTS; derivado del precursor de la citocromo humano c oxidasa subunidad 8A (COX8) entre los nucleótidos 76 - 161) en marco en el extremo N-terminal de GFP o RFP en los sitios NheI y BamHI del pEGFP-N1 o pERFP vectores -N1 utilizando técnicas de clonación molecular estándar.
2. En el diseño de cebadores de PCR para genes CyclinB1 y Cdk1, añadir BamHI sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (en negrita) al extremo 5 'de los cebadores de PCR.
   Reenviar BamH1 Cdk15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Revertir Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   Adelante CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   Revertir CyclinB1 BamH1 5 'TGG ATA ATC CTG CAC CAC CTT TGC AGC C
3. Amplificar los genes Cdk1 y CyclinB1 utilizando estos cebadores siguiendo técnicas estándar. Digerir los productos de PCR con 1 l de enzima de restricción BamHI a 37 ° C durante 2 hr. Ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1%. El uso de una cuchilla de afeitar, cortar los fragmentos de ADN -sized correctas y purificar el ADN del gel usando un kit de extracción de gel.
4. Digerir 1 g de MTS-pEGFP-N1 y plásmidos MTS-pERFP-N1 con 1 l de enzima BamHI a 37 ° C durante 2 horas. Añadir 1 l de Calf-Intestinal fosfatasa alcalina (CIP) durante 30 minutos a 37 ° C. Ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1% y purificar plásmidos lineales de gel como en el paso 5.3.
5. Configurar una reacción de unión mediante la adición de 1 l de plásmido a partir del paso 5.4 y 5 l de Cdk1 o CyclinB1 del Paso 5.3 a 3 l de tampón ligasa, 0,5 l de T4 ligasa, y 20,5 l de _dH2O Incubar O / N a 4 ° C.
6. Transformar Escherichia coli DH5a competentes células con 10 l de mezcla de ligación siguiendo las técnicas estándar y crecer las bacterias en 10 mg / ml de kanamicina que contiene placas de agar LB O / N a 37 ° C para obtener colonias.
7. Escoja una colonia de O / N placas adultos utilizando una punta de pipeta estéril, inserte la punta en un 5 ml de kanamicina-LB que contiene el tubo e incubar S / N. Aislar el plásmido utilizando kits de miniprep de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la secuencia del plásmido utilizando técnicas estándar.
8. Transfectar crecimiento exponencial MCF1Células 0A (1,5 x 10 ⁴ células sembradas en placas de 96 pocillos) con MTS-Cdk1-RFP o MTS-CyclinB1-GFP plásmidos de Paso 5.7 mediante la preparación de una relación de reactivo de plásmido / transfección de 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 l) en 100 l de suero y medio libre de antibióticos.
9. Se incuban las células en el plásmido mezcla / reactivo durante 48 horas a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ con control de humedad (5% de CO _2, 95% de humedad relativa).
10. Preparar 1 mM solución madre de tintes fluorescentes rojos y verdes mitocondriales mediante la disolución de 50 g de polvo en 100 l de DMSO. Diluir las soluciones madre 1: 400 en PBS 1x para obtener 2,5 M soluciones de trabajo. Las soluciones madre pueden ser almacenadas a -20 ° C durante un año.
11. Mezcle 2 l de 2,5 M de colorante rojo con 98 l de medio de cultivo para preparar una concentración final de 50 nM.
12. Sustituir el medio de cultivo celular de CyclinB1-GFP teniendo células MCF10A (generados en la etapa 5.8) con el tinte rojo que contiene medio de 2 min. Repite elmismo procedimiento con colorante verde para las células MCF10A rodamiento Cdk1-RFP.
13. Lavar dos veces con 100 l 1 x PBS para deshacerse del exceso de solución de tinción, se añaden 100 l de PBS 1x a la placa de 96 pocillos.
14. Visualizar la mitocondria y CyclinB1-GFP (excitación por 488 nm y emisión a 494 hasta 536 nm) y Cdk1-RFP (excitación por 560 nm y emisión a 565 hasta 620 nm) en placas de 96 pocillos bajo el microscopio fluorescente a un aumento de 40X.

6. Identificación de proteínas diferencialmente fosforilados a través de 2D-DIGE

1. Preparación de la muestra
   1. Aislar las mitocondrias y la lisis de las fracciones mitocondriales como en el paso 1.3. Añadir un volumen igual de 20% de TCA (ácido tricloroacético en agua) a cada muestra y agitar durante 15 seg. Incubar las muestras en hielo durante 30 min como las proteínas precipitan fuera de la solución.
   2. Centrifugar las muestras a 9.300 xga 4 ° C durante 5 min, eliminar el sobrenadante y añadir 60 l de acetona fría (100%), seguido decentrifugación a 9300 xga 4 ° C durante 5 min.
   3. Repita el paso de lavado acetona (Paso 6.1.2) una vez más, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las muestras en 50 l de tampón de etiquetado DIGE (7 M urea, tiourea 2 M, 4% CHAPS, Tris 30 mM, pH 8,5).
2. Preparar el tintes fluorescentes
   1. Preparar la solución madre: Disolver colorantes (5 nmol) en 5 l de formamida fresca de dimetilo (DMF) a una concentración final de 1 nmol / l. La solución madre de tinte a -20 ^° C hasta su uso durante unos meses.
   2. Preparar la solución de trabajo: Permitir a los tintes para establecer a temperatura ambiente durante 5 min. Diluir 1 l de colorante con 4 l de DMF a una concentración final de 200 pmol / l. Mantener en hielo durante el uso. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a -20 ^° C durante 3 semanas.
3. Las proteínas de la etiqueta
   1. Mezclar 1 l de solución de colorante por 12,5 g de proteína de trabajo. Ampliar según sea necesario. Para los estándares agrupados, agregar 61; l de solución de trabajo Cy2 a 300 g de proteína agrupados.
   2. Vortex durante 30 segundos y se centrifuga a 4 ° C durante 30 segundos a 12.000 x g. Incubar en hielo en la oscuridad durante 30 min. Detener el etiquetado mediante la adición de 1 l de 10 mM de lisina por 1 l de solución de trabajo utilizados. Mezclar bien e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 min.
   3. Piscina etiquetados individualmente y mezclar las muestras con tampón de rehidratación (7 M urea, tiourea 2 M, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, azul de bromofenol). Volumen total será de 125 l.
   4. muestras de vórtice durante 30 segundos y permita que las muestras fijaron a temperatura ambiente durante 30 min. Carga 125 l de muestras sobre 7 cm pH 4-9, enfoque isoeléctrico (IEF) tiras.
4. Primera dimensión electroforesis
   1. Coloque los soportes de tira (ataúdes) en la placa de electrodos, asegurándose de que los titulares de la tira son completamente limpia y seca. Pipetear 125 muestras l en un ataúd, extendiendo uniformemente a través de todo el ataúd.
   2. usando tweezers, recogen la tira IEF, retirar con cuidado la cubierta protectora de plástico, y lo colocan (lado gel de abajo) en tampón ataúd / rehidratación. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Llenar lentamente el ataúd (1 - 1,5 ml) con aceite mineral y colocar el ataúd cubre a los ataúdes.
   3. Comience enfoque isoeléctrico siguiendo el protocolo en la Tabla 2:
      Nota: Una vez que la ejecución se ha completado, las tiras pueden ser almacenadas en tubos de plástico a -80 ^° C o directamente trasladaron a equilibración y la segunda dimensión.
5. Segunda dimensión - dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE)
   1. Equilibrio
      1. Descongelar el tampón de equilibrado SDS (8 ml por cada tira, 6 M de urea, glicerol al 30%, SDS al 2%). Pesar ditiotreitol (DTT; 10 mg TDT por 1 ml de tampón de equilibrio SDS). Disolver la TDT en 4 ml tampón de equilibrado SDS.
      2. Pesar IAA (yodoacetamida, 25 mg de IAA por 1 ml de tampón de equilibrio SDS).Disolver IAA en 4 ml tampón de equilibrado SDS.
      3. Derretir 1 ml de sellado solución de agarosa en un baño de agua para su uso posterior.
      4. Si se congelaron las tiras, permitir que se descongelen por completo. Coloque las tiras de gel de lado arriba en la bandeja reswelling. Añadir 4 ml de tampón de equilibrado SDS con DTT a cada tira y se incuba durante 15 min con agitación suave.
      5. Retirar todo el tampón de equilibrado SDS con TDT. Añadir 4 ml de tampón de equilibrado SDS con IAA a cada tira y se incuba durante otros 15 min con agitación suave. Después del equilibrado con el tampón de IAA, se vierte el tampón de equilibrado de SDS.
   2. SDS-PAGE
      1. Desenvolver minigeles, retire el peine y enjuague el gel y los pocillos con _ddH2O Retire la cinta blanca en la parte inferior del gel antes de ejecutar. Orientar correctamente la tira en el gel, gel de orientación es fundamental para el corte in situ.
      2. Coloque la plana gel en barra con la placa pequeña arriba y de arriba hacia gel de correoxperimenter. Coloque la tira sobre la placa de altura con el extremo anódico (++ terminar con el código de barras) que mira hacia el lado izquierdo de la gel. Usando una regla, empujar lentamente la tira hacia abajo sobre la superficie del gel. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire entre la banda y el gel. Colocar el gel en un soporte de la placa de vidrio.
      3. Añadir 1 ml de solución de agarosa de sellado caliente para la apertura de la cassette. Asegúrese de que todas las burbujas de aire se presionan a cabo usando una regla plana. Montar el aparato y correr el gel a una constante de 125 V durante 90 min.
      4. Cuando el gel se haya ejecutado, colocar el gel en un generador de imágenes biomoleculares con 2 ml _ddH2O y escanear el gel en el modo de adquisición de fluorescencia con láser de 635 nm de excitación y 665 nm de emisión filtro.
   3. La tinción fosfoproteína
      1. Fijar el gel con 50% de metanol y la mezcla de ácido acético al 10% (10 ml) durante 30 min dos veces. Lavar con 10 ml de agua durante 10 minutos tres veces y mancha con 10 ml fosfoproteína mancha durante 60-90 min, seguido dedecoloración con 10 ml de solución decolorante durante 30 minutos tres veces.
      2. Lavar con 10 ml de agua 5 min dos veces y la imagen de gel con un escáner de gel láser a 532 nm / 560 nm de excitación / emisión.
   4. La digestión de proteínas e Identificación
      1. Impuestos Especiales toda la expresados ​​diferencialmente manchas de proteínas desde el gel en pocillos de la microplaca utilizando un spot-selector de robot de acuerdo con las especificaciones del fabricante, y añadir bicarbonato de amonio 100 mM (2 ml) durante 1 hora a RT a destain las piezas de gel. Deshidratar con 2 ml 100% de acetonitrilo se lava dos veces y se seca en un concentrador de vacío durante 30 min.
      2. Rehidratar las piezas de gel con 100 l de 13 ng / l tripsina porcina modificada en bicarbonato de amonio 50 mM durante 16 horas a 37 ° C. Recoger los sobrenadantes y extraer aún más las proteínas con 100 l de ácido trifluoroacético 5% en 50% de acetonitrilo durante 30 min.
      3. Concentrar los péptidos de hasta 5 l mediante vacío concent centrífugarator y analizar con láser asistida por matriz de desorción ionización - tiempo de vuelo - tandem análisis espectrometría de masas (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

7. In Vitro Ensayo de quinasa

1. Preparación de sustratos
   1. I (IC) subunidades sub-clon complejas (NDUFV1, NDUFV3, Ndufs2, NDUFB6, y NDUFA12), que se identifican como blancos Cdk1 diferencialmente fosforilados, en pGEX-5X-1 vectores que generan glutatión-S-transferasa (GST)-etiquetados expresión bacteriana plásmidos ^11. Purificar subunidades IC utilizando las columnas de alta afinidad de glutatión siguiendo el protocolo a continuación.
      1. Cultura GST-tagged subunidad CI que contiene Escherichia coli cepa BL-21 en medio Luria-Bertani (LB) caldo con 50 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ^° C hasta una densidad óptica (DO) de 0,6 se alcanzó. Añadir isopropil-BD-tio-galactopiranósido (IPTG) al cultoure a una concentración final de 0,1 mM, y se incuba durante un 3 h adicionales.
      2. Centrifugar a 600 xg durante 10 min para recoger las bacterias y volver a suspender en 5 ml de 1 x tampón de PBS que contiene 5 mM de DTT 1 x cóctel inhibidor de proteinasa, y 0,1% de lisozima. Lyse las células por sonicación durante veinte 5 s ráfagas, y eliminar los restos celulares por centrifugación a 600 xg durante 10 min.
      3. Recoger el sobrenadante e incubar con cuentas de 4B de glutatión-agarosa en una relación en volumen de 4: 1 (sobrenadante: perla) durante 1 hora a RT.
      4. La elución de las proteínas de fusión GST de las perlas con 3 ml de tampón de glutatión elución (10 mM de glutatión reducido en 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) y someter las proteínas eluidas a diálisis en tubo de membrana porosa molecular (peso molecular de corte 12 -14 kiloDaltons) con EDTA 1 x PBS / 1 mM. Almacenar las proteínas purificadas a - 80 ^° C
2. Cdk1 Ensayo de quinasa
   1. Antes de iniciar el culo quinasaay, establecer bloques de calentamiento a 30 ° C y 100 ° C. Descongelar complejo comercial CyclinB1 / Cdk1 enzima y los sustratos sobre hielo.
   2. Preparar la mezcla de reacción en hielo. Desde ³² isótopos P ATP está involucrado, preparar todas las mezclas de reacción en tubos de 1,5 ml de muestra con tapones de rosca que contiene una junta tórica para evitar la propagación de la radiactividad.
      Precaución: Siga las normas de protección de materiales radiactivos. Utilice un niño de 8 mm de espesor de plexiglás de blindaje y el trabajo por lo menos en condiciones de independencia mutua. Limpie cualquier área contaminada con agua.
   3. Preparar un tampón de reacción 30 l que contiene 1 x tampón de Cdk1 (50 mM Tris-HCl, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, 0,01% de Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM ATP frío, 0,1 Ci ³² P ATP, 2 unidades de CyclinB1 / Cdk1 y 6 g de proteína sustrato. Ajuste el volumen a 30 l con _ddH2O Para la reacción de control positivo, reemplazar el sustrato con 0,01 mM de histona H1, un sustrato CyclinB1 / Cdk1 bien conocido.
      1. Para contro negativol reacciones, (1) reemplazar el sustrato con única proteína GST y (2) reemplazar el sustrato con 0,01 mM de histona H1 + 0,5 M RO-3306, un inhibidor selectivo de Cdk1.
   4. Mezclar bien con la pipeta y se centrifuga para llevar todo el líquido al fondo del tubo, lo que minimiza el riesgo de contaminación. Incubar a 30 ° C durante 60 min.
   5. Añadir 6 l de tampón de muestra SDS 5x para detener la reacción y desnaturalizar a 100 ^° C durante 10 min. muestras analizadas, el 10% SDS-PAGE gel a 160 V durante 2 horas, o hasta frente de colorante ha alcanzado el final del gel. Transferencia de gel sobre un papel de cromatografía y envolver con papel film.
      Precaución: Todo el líquido en contacto con radioisótopos debe ser tratado como residuo radiactivo y desecharse en un bidón de 5 galones poli proporcionada por los servicios de salud y seguridad ambiental de acuerdo con las directrices institucionales.
   6. Exponer el gel a una película de rayos X durante 1 día o hasta 1 semana a -20 ^° C, dependiendo de la actividad específica del radioisótopo utilizadoy la enzima.

8. mutagénesis dirigida al sitio para generar dominante Cdk1 Negativo (D146N)

1. Diseño cebadores de mutagénesis; dos cebadores, complementarios entre sí, que contiene el sitio mutante (G serán sustituidos por un nucleótido para codificar N en lugar de D aminoácido) flanqueada por 20 bases en cada lado ^11.
2. Preparar un 50 l Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) mezcla que contenía tampón de reacción 1x, dNTPs 2,5 mM, 10 mM de los cebadores (directa e inversa), 40 ng de la plantilla, y _ddH2O Añadir 2,5 U de ADN polimerasa en la reacción.
3. Ejecutar el siguiente programa de PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 seg, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 ciclos (Nota: 68 ° C tiempo de incubación se determina por el tamaño del ADN se requiere 1 min / kb de ADN ≤ 10 kb Para el ADN más grande, 2 min / kb, más 10 segundos por ciclo..). Siga por 68 ° C 7 min y mantener a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
4. Añadir2 l de la enzima de restricción Dpn I (10 U / l) y 5,7 l Dpn I buffer, se mezclan bien con suave toque con el dedo e incubar la reacción a 37 ^° C durante 1 hora.
5. Transferencia de 10 l Dpn I tratados con productos de PCR en 50 l de células competentes DH5a para la transformación. Incubar en hielo durante 30 min, seguido de 45 segundos de choque térmico a 42 ^° C y 5 min en hielo. Añadir 500 l de LB y agitar a 37 ^° C durante 1 hora antes de placas en placas de agar LB. Incubar O / N a 37 ^° C.
6. Escoja una colonia de la O / N cultiva placas de agar utilizando una punta de pipeta estéril de color amarillo, la caída de la punta en un tubo que contiene 5 ml de LB, y crecer O / N en un agitador C 37 ^°. Aislar el plásmido utilizando un kit miniprep y la secuencia del plásmido para confirmar la mutación de acuerdo con el protocolo del fabricante.

9. Determinación del ciclo celular de fase longitudes con EdU Ensayo de incorporación

1. Clasificación celular
   1. Transfect 2 x 10 ⁵ células con los vectores indicados (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-peso-RFP o MTS-Cdk1-dn-RFP) en una placa de 6 pocillos usando 1: 2 (w: v , 2,5 mg: 5 relación l) de ADN: reactivo de transfección mezcla preparada en 2,5 ml de suero y medio de cultivo libre de antibióticos durante 48 horas. ordenar las células vivas que expresan establemente las proteínas GFP-etiquetados CyclinB1 Cdk1 y RFP-etiquetados mediante citómetro de flujo.
      1. Lavar las células con 1 x PBS, añadir 100 l de tripsina en el plato y se incuba a 37 ^° C durante 5 min. Añadir 2 ml de medio de cultivo para recoger las células y pasar a través de un filtro de 70 micras para generar una suspensión de células individuales. Se lava la suspensión de células individuales con 500 l de 1% suero de ternera fetal en PBS (FCS / PBS) antes de cargarlos en citómetro de flujo.
      2. Configurar los parámetros de clasificación siguientes protocolos establecidos compuerta ¹⁸ para las células doble positivas teñidas con tanto GFP y RFP. Recoger las células clasificadas que sale del citómetro en un tubo contaiNing medio de cultivo celular y el uso de estas células para el análisis de la progresión del ciclo celular con el etiquetado EdU pulso-caza como en el protocolo 9.2.
2. La medición de la duración del ciclo celular usando el ensayo de EdU Etiquetado Citometría de Flujo
   1. Se siembran las células ordenados en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 10 ⁵ células por pocillo y la cultura de O / N a 37 ^° C en una incubadora de CO _2. Añadir EdU al medio de cultivo a una concentración final de 25 mM. Incubar a 37 ^° C en una incubadora de CO ₂ durante 1 hora.
   2. Lavar las células con 1% de BSA en 500 l de PBS y recoger en un tubo de 1,5 ml a intervalos de 2 horas para un total de 10 a 12 hr.
   3. centrifugar las células a 350 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante. Desalojar el sedimento por adición de 100 l de solución de fijación (proporcionado por el fabricante en el kit de marcaje de EDU) durante 15 min a RT y mezclar bien.
   4. Lavar las células con 1 ml de 1% de BSA en PBS tres veces. Arregla ellas células de nuevo con 0,5 ml de 70% de etanol O / N a 4 ^° C.
      Nota: El etanol fijación es crítica para extinguir la fluorescencia de GFP / RFP interna debido a la expresión de proteínas recombinantes con etiqueta.
   5. Centrifugar las células de nuevo a 350 xg durante 5 min y se lava el sedimento con 1 ml de BSA 1% en PBS una vez. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de permeabilización (0,1% Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml RNasa A en PBS) durante 20 min a TA.
   6. Lavar las células con 1 ml de 1% de BSA en PBS una vez. Añadir 0,5 ml de mezcla de reacción en cada tubo y mezclar bien. Incubar mezcla de reacción a TA durante 30 min en la oscuridad.
   7. Lavar con 1 ml de 1% BSA en PBS una vez y el ADN mancha con 50 mg / ml de yoduro de propidio (PI) en 1 ml de BSA 1% en PBS.
   8. Analizar las células por citometría de flujo para seguir la población EdU-positivo. Presente gráfico de puntos de dispersión de las células marcadas con EdU teñidas para contenido de ADN (tinción PI, eje X) y Edu (Alexa 647 de tinción, eje Y).
      1. Utilizar el canal de APC para AlexA647-edu utilizando un filtro de paso de banda de 670/30 con todos los presentes luz inferior a 685 nm golpear ese filtro; y ficoeritrina (PE) de canal para PI con un filtro de paso de banda de 581/15 delante de ella con todos los presentes luz inferior a 600 nm golpear ese filtro.
      2. Introduzca las primeras células tubulares que contiene en la citometría de flujo y el uso de una estrategia de compuerta estándar para la adquisición: Parcela FSC-Zona X SSC-Área de la morfología seguido por PI (canal PE) X Alexa647-EDU (canal APC) para la tinción de células. datos de registro para todos los tubos uno por uno adquisición de 10.000 eventos por muestra.
      3. Determinar la distribución de fase del ciclo celular de las células y las longitudes de fase utilizando una citometría de flujo de software de análisis de datos siguiendo los protocolos establecidos ^11,30.

Resultados

Sub-localización mitocondrial de CyclinB1 y Cdk1

extracción de carbonato de sodio se utiliza para determinar si una proteína se encuentra dentro de la mitocondria o en la superficie exterior, a saber, la membrana exterior. Una vez que se muestra una proteína de localizar dentro de la mitocondria, mas la determinación de la sub-localización mitocondrial puede realizarse a través mitoplasting combinado co...

Discusión

Al igual que las proteínas destinadas a otros orgánulos subcelulares, las proteínas mitocondriales dirigida poseen señales de orientación dentro de su estructura primaria o secundaria que los dirigen hacia el orgánulo con la ayuda de elaborada de translocación de proteínas y plegadoras ^21,22. Las mitocondrias de orientación secuencias (MTS) obtenidos a partir de las proteínas residentes exclusivamente mitocondriales tales como COX8 se pueden añadir al extremo N-terminal de cualquier secuencia de ge...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956