Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Riepilogo

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Abstract

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Introduzione

Nei mammiferi, la progressione del ciclo cellulare dipende da eventi altamente ordinate controllati da cicline e chinasi ciclina-dipendenti (CDK) ^1. Attraverso la sua citoplasmatica, nucleare, e la localizzazione centrosomica, CyclinB1 / Cdk1 è in grado di sincronizzare i diversi eventi in mitosi, come ripartizione membrana nucleare e la separazione centrosome ^2. CyclinB1 / Cdk1 protegge le cellule in mitosi contro l'apoptosi ³ e promuove fissione mitocondriale, un passaggio fondamentale per un'equa distribuzione dei mitocondri delle cellule figlie di nuova formazione ^4.

In proliferazione cellule di mammifero, mitocondriale ATP viene generato tramite fosforilazione ossidativa (OXPHOS) macchinari (catena di trasporto degli elettroni), che si compone di 5 complessi multi-subunità; complesso I - V complesso (CI-CV). Nicotinamide adenina dinucleotide (NADH): ubichinone ossidoriduttasi o complesso I (CI) è il più grande e meno compreso dei cinque complessi ^5. Il complesso consists di 45 subunità, di cui 14 costituiscono il nucleo catalitico. Una volta assemblato, il complesso assume una struttura a forma di L con un braccio che sporge nella matrice e l'altro braccio incorporato nella membrana interna ^6,7. Le mutazioni in subunità CI sono la causa di una varietà di disturbi mitocondriali ^8. Un CI funzionalmente efficiente in OXPHOS è necessaria non solo per la respirazione mitocondriale nel complesso ^9, ma anche per la progressione del ciclo cellulare di successo ^10. Svelare i meccanismi alla base del funzionamento di questo complesso enzimatico di membrana in salute e malattia potrebbe consentire lo sviluppo di nuove procedure diagnostiche e strategie terapeutiche avanzate. In un recente studio, abbiamo trovato che il / nel complesso Cdk1 CyclinB1 trasloca nei mitocondri nel (Gap 2) G2 / (mitosi) fase M e fosforila subunità CI per aumentare la produzione di energia mitocondriale, potenzialmente per compensare l'aumento del fabbisogno energetico delle cellule durante cella ciclo ^11. Qui abbiamo showcase procedure sperimentali e strategie che possono essere utilizzati per studiare traslocazione mitocondriale di chinasi altrimenti nucleari / citoplasmatici, loro substrati mitocondriali nonché conseguenze funzionali della loro localizzazione mitocondriale utilizzando CyclinB1 / Cdk1 come esempio.

La constatazione che il / nel complesso Cdk1 CyclinB1 trasloca nei mitocondri quando necessario richiesto studi di sovraespressione specifici mitocondri e atterramento di questo complesso. Per raggiungere-specifico espressione mitocondri delle proteine, si può aggiungere un mitocondri di targeting sequenza (MTS) in N-terminale della proteina di interesse. I mitocondri di targeting sequenze consentono lo smistamento delle proteine ​​mitocondriali nei mitocondri dove normalmente risiedono ^12. Abbiamo usato una sequenza di mira 87 mitocondri di base derivato dal precursore di citocromo c ossidasi subunità umana 8A (COX8) e clonati in Green Fluorescent Protein (GFP) -tagged CyclinB1 o rosso fluorescenteProteine ​​(RFP) -tagged Cdk1 contenenti plasmidi nel telaio. Questo metodo ci ha permesso di indirizzare CyclinB1 e Cdk1 nei mitocondri, in particolare modificando l'espressione di queste proteine ​​mitocondriali senza compromettere la loro piscina nucleare. Con codifica fluorescenti queste proteine, siamo stati in grado di monitorare la loro localizzazione in tempo reale. Allo stesso modo, abbiamo introdotto MTS in un plasmide contenente RFP-tag dominante negativo Cdk1, che ci ha permesso di battere specificamente verso il basso l'espressione mitocondriale e le funzioni di Cdk1. È essenziale distinguere tra le funzioni mitocondriali e nucleari delle chinasi che hanno localizzazioni doppi come Cdk1. Ingegneria MTS nel N-terminale di queste chinasi funzionali duali offre una grande strategia che è facile da impiegare ed efficace.

Poiché Cdk1 è una chinasi del ciclo cellulare, è fondamentale per determinare la progressione del ciclo cellulare quando Cdk1 è localizzato nei mitocondri. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un nuovo method per monitorare il contenuto di DNA nelle cellule. I metodi tradizionali includono utilizzando BrdU (bromodeoxyuridine), un analogo sintetico della timidina, che incorpora nel DNA di nuova sintesi nella fase S del ciclo cellulare per sostituire timidina. Quindi le cellule che sono attivamente replicano il loro DNA possono essere rilevati utilizzando anticorpi anti-BrdU. Uno svantaggio di questo metodo è che richiede denaturazione del DNA per fornire l'accesso per l'anticorpo BrdU mediante metodi dure come trattamento acido o di calore, che può provocare incoerenza tra i risultati ^13,14. In alternativa, abbiamo utilizzato un approccio simile per monitorare le cellule in divisione attiva con un diverso analogico timidina, edu. rilevamento EdU non richiede aspra denaturazione del DNA come trattamento detergente neutro consente il reagente di rilevamento per accedere al EdU nel DNA di nuova sintesi. Il metodo EdU ha dimostrato di essere più affidabile, coerente e con un potenziale di analisi ad alta produttività ^15.

Infine, to determinare i substrati mitocondriali di Cdk1, abbiamo utilizzato uno strumento chiamato proteomica 2D-DIGE, che è una versione avanzata del classico gel elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi bidimensionale separa le proteine ​​in base al loro punto isoelettrico nella prima dimensione e peso molecolare nel secondo. Poiché modificazioni post-traduzionali come fosforilazione influenzano il punto isoelettrico e peso molecolare delle proteine, gel 2D possono rilevare le differenze tra stati di fosforilazione di proteine ​​all'interno diversi campioni. Le dimensioni (area e intensità) di proteine ​​ha visto cambiamenti con il livello di espressione di proteine, permettendo il confronto quantitativo tra più campioni. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di differenziare le proteine ​​fosforilate in wild-type contro le cellule mitocondri mirati mutanti CDK1 che esprimono. Gli spot proteici specifici che hanno mostrato nel tipo cinghiale ma mancavano nel mutante di preparazione Cdk1 mitocondri mirati sono stati isolati eidentificati tramite spettrometria di massa.

In gel 2D tradizionali, coloranti trifenilmetano vengono utilizzati per visualizzare le proteine ​​sul gel. 2D-DIGE utilizza etichette proteina fluorescente con un effetto minimo sulla mobilità elettroforetica delle proteine. Diversi campioni proteici possono essere etichettati con coloranti fluorescenti differenti, mescolati insieme e separate da gel identiche, consentendo co-elettroforesi di campioni multipli in un unico gel ^16. Questo minimizza le variazioni gel-to-gel, che è un problema critico nella proteomica studi a base di gel.

Protocollo

1. Isolamento dei mitocondri da cellule in coltura

1. Preparazione di isolamento Buffer per le celle (IBC) Buffer
   1. Preparare 0,1 M Tris / MOPS (tris (idrossimetil) aminometano / 3- (N -morpholino) propanosulfonico): Sciogliere 12.1 g di Tris in 800 ml di acqua distillata, regolare il pH a 7,4 utilizzando MOPS polvere, aggiungere acqua distillata per un totale volume di 1 L e conservare a 4 ^° C.
   2. Preparare 0,1 M EGTA (etilene glicole bis (2-amminoetil etere) tetraacetico) / Tris: Sciogliere 38.1 g di EGTA in 800 ml di acqua distillata, regolare il pH a 7,4 con Tris polvere, aggiungere acqua distillata fino ad un volume totale di 1 L e conservare a 4 ^° C.
   3. Preparare 1 M saccarosio: Sciogliere 34.23 g di saccarosio in 100 ml di acqua distillata, fare 20 ml aliquote e conservare a -20 ^° C.
   4. Preparare IB tampone _C: Preparare 100 ml di IB _c tampone con l'aggiunta di 10 ml di 0,1 M Tris / MOPS e 1 ml di 0,1 M EGTA / Tris a 20 ml; Di 1 M di saccarosio. Aggiungere acqua distillata fino ad un volume totale di 100 ml. Regolare il pH a 7,4.
2. Preparazione di Cell Lysis Buffer
   1. Preparare il tampone di lisi contenente 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (etilene diammino tetraacetico), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM sodio pirofosfato, 1 mM β- glicerofosfato, 1 mM di sodio orthovanadate. Aggiungere inibitori della proteinasi 1 mg / ml e 1 mm leupeptina PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoruro) a destra prima dell'uso.
3. L'isolamento di mitocondri
   1. Harvest 3 x 10 ⁷ cellule con 1x ghiacciata PBS (tampone fosfato), pH 7.4 e centrifugare le cellule a 600 xg per 10 minuti a 4 ^° C. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di tampone IB _c ghiacciata.
   2. Omogeneizzare le cellule utilizzando una smerigliatrice fibra di vetro / vetro per circa 10 min. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 ml e centrifugare a 600 xg per 10 min a 4 ^° C. Per mitocondri funzionale, utilizzare l'accoppiamento di vetro / Teflon in quanto è meno dannoso per i mitocondri che la smerigliatrice fibra di vetro / vetro.
   3. Raccogliere il surnatante in provette da 1,5 ml e centrifugare a 7000 xg per 10 min a 4 ^° C. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml e salvare come proteina citosol.
   4. Lavare il pellet (mitocondri) due volte con 200 microlitri ghiacciata tampone IB _c e centrifugare a 7000 xg per 10 min a 4 ^° C.
   5. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in tampone di lisi cellulare e utilizzarlo immediatamente o conservare a -80 ^° C per un uso futuro. Se sono necessari mitocondri funzionali, risospendere il pellet nel buffer residuo dopo aver scartato il surnatante. Diluire la frazione mitocondriale ulteriormente può comportare la perdita della funzione dei mitocondri. Conservare su ghiaccio e usare la preparazione in 1 - 3 ore per i migliori risultati.
   6. Sonicare il pellet risospeso per trenta raffiche a 3 sec in unbagno di ghiaccio, centrifugare a 10.000 xg per 5 min, e salvare il surnatante come frazione mitocondriale.

2. Co-immunostaining di Cdk1, CyclinB1 e COXIV, una proteina mitocondriale residente

1. Crescere 5 x 10 ⁴ cellule su vetrini a 24 pozzetti O / N o fino al 70% di confluenza. Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 500 microlitri ghiacciata 1 x PBS, pH 7,4.
2. Fissare le cellule con 500 microlitri ghiacciata 4% paraformaldeide a temperatura ambiente per 10 min. Aspirare la soluzione di fissaggio e lavare le cellule con 500 ml 1 x PBS 3 volte, 5 minuti ciascuno con delicata agitazione a temperatura ambiente.
3. Permeabilize le cellule con 0,2% Triton X-100 in 500 pl di PBS per 5 minuti a RT. Aspirare la soluzione e lavare le cellule 3 volte, 5 minuti ciascuno con 500 microlitri di PBS. Aggiungere la soluzione di bloccaggio (500 microlitri, 1% BSA (albumina sierica bovina) in PBS contenente 1% Tween 20) per 30 minuti a RT.
4. Diluire gli anticorpi primari 1: 250 (v: v) a 5001; l di soluzione di blocco e incubare le cellule con anticorpi primari desiderati sollevate in specie diverse per evitare la segnalazione croce (CyclinB1 (mouse) e COXIV (coniglio) o Cdk1 (mouse) e COXIV (coniglio) a temperatura ambiente per 30-60 minuti o O / N a 4 ^° C.
5. Lavare i coprioggetti con 500 ml di 1 x PBS 3 volte, 5 min ciascuno e poi incubare con l'anticorpo secondario diluito 1: 1000 in 500 ml di blocco soluzione a temperatura ambiente per 1 ora seguita da un lavaggio con 500 microlitri PBS 3 volte, 5 minuti ciascuno.
6. Montare i vetrini con 20 ml di soluzione di montaggio anti-sbiadimento e sigillare i vetrini con smalto. Immagine le diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza subito o mantenere al buio a 4 ^° C per 1 - 2 settimane.

3. carbonato di sodio Estrazione di mitocondri intatti

1. Grow circa 20 x 10 ⁷ cellule, raccolta, lavare una volta con PBS e isolare i mitocondri come descritto nel paragrafo 1. Divide mitocondriale isolati in due parts prima dell'ultimo centrifugazione per far sedimentare i mitocondri (prima fase 1.3.4); save mezzo per essere usato come il totale mitocondri (passo 3.2), utilizzare l'altra metà per l'estrazione di carbonato di sodio (seguenti passaggi 3,3-3,6) per separare le proteine ​​legate solubili e di membrana.
2. Lyse i mitocondri totale di pellet con 30 ml di buffer di lisi cellulare e memorizzare il lisato a -80 ^° C fino al momento in immunoblotting.
3. Aggiungere 250 pl di 0,1 M Na ₂ CO ₃ (carbonato di sodio), pH 11,0, per l'altra metà del pellet mitocondriale e incubare su ghiaccio per 30 min.
4. Centrifugare a 100.000 xg per 20 min. Raccogliere il surnatante e passare al punto 3.5. Lyse il pellet con 30 ml di buffer di lisi cellulare e ultrasuoni come al punto 1.3.6. Conservare a -80 ^° C fino al momento in immunoblotting.
5. Aggiungere un volume uguale del 20% di acido tricloroacetico fresco (TCA) al supernatante per precipitare le proteine ​​e mantenere in ghiaccio per 30 min.
6. centrifuge a 15.000 xg per 10 min. Eliminare il surnatante, sciogliere il precipitato in 80 ml ​​di buffer di lisi cellulare e conservare a -80 ^° C fino al momento in immunoblotting.

4. Separazione di interno ed esterno membrane dei mitocondri (Isolamento di mitoplasti)

1. Grow circa 20 x 10 ⁷ cellule, raccolta, lavare una volta con PBS e isolare i mitocondri come descritto nel paragrafo 1. Separare le frazioni mitocondriali in 10 parti uguali prima dell'ultima centrifugazione per far sedimentare i mitocondri (prima del punto 1.3.4).
2. Sciogliere ogni pellet in 30 microlitri della concentrazione indicata di tampone saccarosio ipotonico (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (idrossido di potassio), pH 7,2; concentrazione di saccarosio da 25 - 200 mm) con o senza 50 ug / ml di tripsina ( vedere Tabella 1) e incubare 30 min in ghiaccio.
3. Aggiungere 3 ml di 10 mM PMSF (per raggiungere una concentrazione finale di 1 mM PMSF) alla tripsina contenente flaconi per fermare tegli tripsina digestione e incubare in ghiaccio per 10 min.
4. Centrifugare a 14.000 xga 4 ^° C per 10 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, lisare il pellet in 30 ml di tampone di lisi cellulare, ultrasuoni come al punto 1.3.6, e conservare a -80 ^° C.

5. Costruzione di mitocondri mirati GFP / RFP-tagged CyclinB1 / Cdk1 vettori e conferma della loro localizzazione mitocondriale

1. Clonare i mitocondri di targeting sequenza (MTS, derivato dal precursore del citocromo umano c ossidasi subunità 8A (COX8) tra i nucleotidi 76 - 161) nella cornice nella N-terminale della GFP o RFP in siti NheI e BamHI di pEGFP-N1 o pERFP vettori -n1 utilizzando tecniche standard di clonazione molecolare.
2. Nel progettare primer PCR per i geni CyclinB1 e Cdk1, aggiungere siti BamHI enzimi di restrizione riconoscimento (grassetto) al 5 'dei primer PCR.
   Forward Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Reverse Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   Forward CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   Reverse CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
3. Amplificare i geni CDK1 e CyclinB1 utilizzando questi primer secondo tecniche standard. Digerire i prodotti di PCR con 1 ml di enzima di restrizione BamHI a 37 ° C per 2 ore. Eseguire i prodotti della digestione su un gel di agarosio 1%. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare i frammenti di DNA -sized corretti fuori e purificare il DNA dal gel utilizzando un kit di estrazione gel.
4. Digest 1 mg di MTS-pEGFP-N1 e plasmidi MTS-pERFP-N1 con 1 ml di BamHI enzima a 37 ° C per 2 ore. Aggiungere 1 ml di Calf-Intesfonodale fosfatasi alcalina (CIP) per 30 minuti a 37 ° C. Eseguire i prodotti della digestione su un gel di agarosio 1% e purificare plasmidi lineari da gel come al punto 5.3.
5. Impostare una reazione legatura con l'aggiunta di 1 ml di plasmide dal punto 5.4 e 5 ml di Cdk1 o CyclinB1 dal punto 5.3 a 3 ml di tampone ligasi, 0,5 ml di T4 ligasi, e 20,5 ml di dH ₂ O. Incubare O / N a 4 ° C.
6. Transform Escherichia coli DH5α cellule competenti con 10 ml di miscela di ligasi seguenti tecniche standard e crescere i batteri in 10 mg / ml kanamicina contenenti piastre di agar LB O / N a 37 ° C per ottenere colonie.
7. Scegliere una colonia da O / N piastre coltivato con una punta di pipetta sterile, inserire la punta in un 5 ml di tubo kanamicina-LB contenenti e incubare O / N. Isolare il plasmide utilizzando kit Miniprep secondo il protocollo del produttore, e la sequenza del plasmide utilizzando tecniche standard.
8. Trasfezione in crescita esponenziale MCF1Cellule 0A (1,5 x 10 ⁴ cellule seminate su piastre a 96 pozzetti) con MTS-Cdk1-RFP o MTS-CyclinB1-GFP plasmidi dal punto 5.7 per la preparazione di un / trasfezione Rapporto reagente plasmide di 1: 2 (w: v, 100 ng : 0.2 ml) in 100 ml di siero e mezzo privo di antibiotico.
9. Incubare le cellule nel plasmide mix / reagente per 48 ore a 37 ° C in un incubatore CO ₂ con controllo dell'umidità (5% CO _2, 95% di umidità relativa).
10. Preparare 1 mM soluzione madre di coloranti fluorescenti rosso e verde mitocondriali sciogliendo 50 mg di polvere in 100 ml di DMSO. Diluire le soluzioni madre 1: 400 in PBS 1x per ottenere 2,5 micron soluzioni di lavoro. Le soluzioni madri possono essere conservati a -20 ° C per un anno.
11. Mescolare 2 ml di 2,5 micron di colorante rosso con 98 ml di terreno di coltura per preparare una concentrazione finale 50 nm.
12. Sostituire il terreno di coltura di cellule di CyclinB1-GFP cuscinetto cellule MCF10A (generate al passo 5.8) con colorante rosso contenente mezzo per 2 min. ripetere lastessa procedura con colorante verde per le cellule MCF10A cuscinetto Cdk1-RFP.
13. Lavare due volte con 100 ml 1 x PBS per sbarazzarsi della soluzione colorante in eccesso, aggiungere 100 ml di PBS 1x per la piastra a 96 pozzetti.
14. Visualizza la mitocondri e CyclinB1-GFP (eccitazione da 488 nm ed emissione a 494-536 nm) e Cdk1-RFP (eccitazione da 560 nm ed emissione a 565-620 nm) su piastre da 96 pozzetti al microscopio a fluorescenza a 40X di ingrandimento.

6. Individuazione di differenziale fosforilate proteine ​​mediante 2D-DIGE

1. Preparazione del campione
   1. Isolare mitocondri e lisare frazioni mitocondriali, come nel passo 1.3. Aggiungere un volume uguale del 20% TCA (acido tricloroacetico in acqua) per ogni campione e vortex per 15 secondi. Incubare campioni in ghiaccio per 30 min come le proteine ​​precipitano dalla soluzione.
   2. Centrifugare i campioni a 9.300 xg a 4 ° C per 5 minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 60 ml di acetone freddo (100%) seguita dacentrifugazione a 9.300 xg a 4 ° C per 5 min.
   3. Ripetere la fase di lavaggio acetone (Fase 6.1.2) ancora una volta, rimuovere il surnatante e risospendere i campioni in 50 microlitri di buffer etichettatura DIGE (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
2. Preparare il coloranti fluorescenti
   1. Preparare soluzione madre: sciogliere i coloranti (5 nmol) in 5 ml di dimetil formammide fresco (DMF) ad una concentrazione finale di 1 nmol / ml. Conservare la soluzione di riserva di colorante a -20 ^° C fino al momento dell'uso per alcuni mesi.
   2. Preparare la soluzione di lavoro: Consentire coloranti per impostare a temperatura ambiente per 5 min. Diluire 1 ml di tintura con 4 ml di DMF ad una concentrazione finale di 200 pmol / ml. Tenere in ghiaccio durante l'uso. Nota: La soluzione di lavoro può essere conservato a -20 ^° C per 3 settimane.
3. Proteine ​​Label
   1. Mescolare 1 ml di soluzione di colorante per 12,5 mcg di proteine. Scalare in base alle esigenze. Per gli standard pool, aggiungere 61; l di soluzione di lavoro Cy2 a 300 mg di proteine ​​messe in comune.
   2. Vortex per 30 secondi e centrifugare a 4 ° C per 30 secondi a 12000 x g. Incubare in ghiaccio al buio per 30 min. Fermare l'etichettatura con l'aggiunta di 1 ml di 10 mm lisina per 1 ml di soluzione di lavoro utilizzati. Mescolare bene e incubare in ghiaccio al buio per 10 minuti.
   3. Pool etichettato singolarmente campioni e mescolare con il tampone di reidratazione (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, blu bromofenolo). Il volume totale sarà di 125 ml.
   4. campioni Vortex per 30 secondi e consentono di impostare i campioni a temperatura ambiente per 30 min. Carico 125 ml di campioni Onto 7 centimetri pH 4-9, isoelettrofocalizzazione (IEF) strisce.
4. Prima elettroforesi Dimension
   1. Posizionare i premibandella (bare) sulla piastra dell'elettrodo, assicurandosi che i titolari della striscia sono completamente puliti e asciutti. Pipettare 125 campioni microlitri in una bara, diffondendo in modo uniforme su tutta la bara.
   2. utilizzando TweezeRS, sollevare la striscia IEF, con attenzione rimuovere il coperchio di protezione in plastica, e posizionarlo (lato gel verso il basso) nel buffer bara / reidratazione. Evitare di inglobare bolle d'aria. Riempire lentamente bara (1 - 1,5 ml) con olio minerale e posizionare la bara si estende sulle bare.
   3. Iniziare isoelettrofocusing seguendo il protocollo nella Tabella 2:
      Nota: Una volta completata l'analisi, le strisce possono essere conservati in provette di plastica a -80 ^° C o direttamente passati a equilibrazione e la seconda dimensione.
5. Seconda Dimensione - dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE)
   1. Equilibration
      1. Scongelare buffer di equilibrio SDS (8 ml per strip, 6 M urea, 30% glicerolo, 2% SDS). Pesare ditiotreitolo (DTT; 10 mg DTT per 1 ml di tampone di equilibratura SDS). Sciogliere DTT in 4 ml di SDS tampone di equilibratura.
      2. Pesare IAA (Iodoacetamide, 25 mg di IAA per 1 ml di tampone di equilibratura SDS).Sciogliere IAA in 4 ml di SDS tampone di equilibratura.
      3. Sciogliere 1 ml di tenuta soluzione di agarosio in un bagno d'acqua per un uso successivo.
      4. Se le strisce sono stati congelati, permettere loro di scongelare completamente. Luogo fasce laterali gel up nel vassoio reswelling. Aggiungere 4 ml di tampone equilibrio SDS con DTT ad ogni striscia e incubare per 15 minuti agitando delicatamente.
      5. Eliminare tutto il buffer di equilibrio SDS con DTT. Aggiungere 4 ml di tampone equilibrio SDS con IAA ad ogni striscia e incubare per altri 15 minuti agitando delicatamente. Dopo il raggiungimento dell'equilibrio con il buffer di IAA, versare del buffer di equilibrio SDS.
   2. SDS-PAGE
      1. Unwrap mini gel, rimuovere il pettine e sciacquare il gel e pozzetti con DDH ₂ O. Rimuovere il nastro bianco sul fondo del gel prima di eseguire. Orientare correttamente la striscia sul gel, orientamento gel è fondamentale per il taglio posto.
      2. Posizionare il piatto gel sul bancone con la piastrina e superiore del gel di fronte experimenter. Posizionare la striscia sulla piastra alto con estremità anodica (++ terminare con il codice a barre) rivolto verso il lato sinistro del gel. Utilizzando un righello, spingere lentamente la striscia verso il basso sulla superficie del gel. Evitare di inglobare bolle d'aria tra la Striscia e il gel. Posizionare il gel in un supporto lastra di vetro.
      3. Aggiungere 1 ml di soluzione di tenuta agarosio caldo per l'apertura della cassetta. Assicurarsi che tutte le bolle d'aria vengono premuti utilizzando un righello piatta. Montare l'apparecchiatura ed eseguire il gel a una costante 125 V per 90 min.
      4. Quando il gel termina l'esecuzione, posizionare il gel su un imager biomolecolare con 2 ml DDH ₂ O e la scansione del gel in modalità di acquisizione di fluorescenza con 635 nm laser di eccitazione e 665 nm filtro per le emissioni.
   3. fosfoproteina colorazione
      1. Fissare il gel con il 50% di metanolo e la miscela di acido acetico al 10% (10 ml) per 30 minuti due volte. Lavare con 10 ml di acqua per 10 minuti tre volte e macchia con 10 ml fosfoproteina macchia 60 - 90 min, seguito dadecolorazione con 10 ml Decolorare soluzione per 30 minuti tre volte.
      2. Lavare con 10 ml di acqua 5 minuti due volte e l'immagine del gel con uno scanner laser gel a 532 nm / 560 nm di eccitazione / emissione.
   4. Digestione delle proteine ​​e identificazione
      1. Accise tutto il differenziale espresso spot proteici dal gel in pozzetti utilizzando un robot spot-selettore secondo le specifiche del produttore, e aggiungere 100 mM bicarbonato di ammonio (2 ml) per 1 ora a temperatura ambiente per Decolorare i pezzi di gel. Disidratare con 2 ml 100% acetonitrile lavare due volte e asciugare in un concentratore a vuoto per 30 min.
      2. Reidratare i pezzi di gel con 100 ml di 13 ng / ml modificato tripsina porcina in 50 mM bicarbonato di ammonio per 16 ore a 37 ° C. Raccogliere i surnatanti ed estrarre ulteriormente le proteine ​​con 100 ml di acido trifluoroacetico 5% in 50% acetonitrile per 30 min.
      3. Concentrare i peptidi fino a 5 ml dal vuoto centrifuga concentratore e analizzare con Matrix Assisted Laser desorbimento di ionizzazione - Time of Flight - tandem analisi spettrometria di massa (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

7. In Vitro Kinase Assay

1. Preparazione di substrati
   1. Sotto-clone del complesso I (CI) subunità (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, e NDUFA12), che sono identificati come obiettivi differenziale fosforilate Cdk1, in pGEX-5X-1 vettore per generare glutatione-S-transferasi (GST) -tagged espressione batterico plasmidi ^11. Purificare subunità spontanea che fanno uso delle colonne di glutatione ad alta affinità seguito il protocollo di seguito.
      1. Culture GST-etichettato CI subunità contenente Escherichia coli ceppo BL-21 in Luria-Bertani (LB) brodo con 50 ug / ml di ampicillina in un agitatore a 37 ^° C fino ad una densità ottica (OD) di 0,6 è stato raggiunto. Aggiungere isopropilico-BD-tio-galactopyranoside (IPTG) al cultoure ad una concentrazione finale di 0,1 mM, ed incubare per altri 3 ore.
      2. Centrifugare a 600 xg per 10 minuti per raccogliere i batteri e risospendere in 5 ml di 1 x PBS contenente 5 mM di DTT, 1 x inibitore proteinasi cocktail, e 0,1% lisozima. Lyse le cellule mediante ultrasuoni per una ventina di 5 s scoppia, e rimuovere i residui di cellule per centrifugazione a 600 xg per 10 min.
      3. Raccogliere il surnatante e incubare con perline 4B glutatione-agarosio in un rapporto in volume di 4: 1 (surnatante: bead) per 1 ora a RT.
      4. Eluire proteine ​​GST-fusione delle perline con 3 ml di tampone glutatione eluizione (10 mM glutatione ridotto in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) e sottoporre le proteine ​​eluite per dialisi molecolare tubo membrana porosa (peso molecolare cut-off 12 -14 kilodaltons) con 1 x PBS / 1 mM EDTA. Conservare le proteine ​​purificate a - 80 ^° C.
2. Cdk1 Kinase Assay
   1. Prima di iniziare l'asino chinasiay, impostare blocchi di riscaldamento a 30 ° C e 100 ° C. Scongelare commerciale CyclinB1 / complesso enzimatico Cdk1 e substrati su ghiaccio.
   2. Preparare la miscela di reazione in ghiaccio. Dal ³² P ATP isotopo è coinvolto, preparare tutte le miscele di reazione in provette da 1,5 ml di esempio con tappi a vite contiene un anello O per prevenire la diffusione di radioattività.
      Attenzione: Seguire le norme di protezione dei materiali radioattivi. Utilizzare un 8 mm plexiglas di spessore di schermatura e di lavoro almeno a normali condizioni di mercato. Pulire qualsiasi zona contaminata con acqua.
   3. Preparare un tampone di reazione di 30 microlitri contenente 1 x Cdk1 tampone (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM ATP fredda, 0,1 pCi ³² P ATP, 2 unità di CyclinB1 / Cdk1 e 6 mg di proteine ​​substrato. Regolare il volume di 30 ml con DDH ₂ O. Per reazione di controllo positivo, sostituire il supporto con 0,01 mm istone H1, un noto CyclinB1 / substrato Cdk1.
      1. Per Contro negativoL reazioni, (1) Sostituire il substrato con proteine ​​GST solo e (2) sostituire il substrato con 0,01 mm istone H1 + 0,5 micron RO-3306, un inibitore selettivo Cdk1.
   4. Mescolare bene con la pipetta e centrifugare per portare tutto il liquido al fondo della provetta, minimizzando il rischio di contaminazione. Incubare a 30 ° C per 60 min.
   5. Aggiungere 6 ml di tampone campione SDS 5x per bloccare la reazione e denaturate a 100 ^° C per 10 min. Esegui campioni su 10% gel SDS-PAGE a 160 V per 2 ore, o fino a fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel. Trasferire il gel su un cromatografia su carta e avvolgere con pellicola trasparente.
      Attenzione: Tutti liquido in contatto con radioisotopi devono essere trattati come rifiuti radioattivi e smaltiti in un 5 galloni poly damigiana fornite dai servizi sanitari e di sicurezza ambientale secondo le linee guida istituzionali.
   6. Esporre il gel alla pellicola a raggi x per 1 giorno o fino a 1 settimana a -20 ^° C a seconda della specifica attività di radioisotopi usatoe l'enzima.

8. mutagenesi sito-diretta per generare dominante Cdk1 negativo (D146N)

1. primer design mutagenesi; due primers, complementari fra loro, contenente il sito mutante (G sarà sostituito da un nucleotide per codificare per N invece di amminoacido D) fiancheggiato da 20 basi su ogni lato ^11.
2. Preparare un 50 microlitri Polymerase Chain Reaction (PCR) miscela contenente tampone di reazione 1x, 2,5 mM dNTP, 10 micron di primer (sia in avanti che indietro), 40 ng del modello, e DDH ₂ O. Aggiungere 2,5 U di DNA polimerasi nella reazione.
3. Eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 sec, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 cicli (Nota: 68 ° C il tempo di incubazione è determinata dalle dimensioni del DNA è richiesto 1 min / kb DNA ≤ 10 kb Per DNA più grande, 2 min / kb più 10 sec per ciclo..). Seguire da 68 ° C 7 min e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso.
4. Aggiungere2 ml di Dpn I enzima di restrizione (10 U / ml) e 5,7 ml Dpn I tampone, miscelare bene con lieve colpetto con il dito e incubare la reazione a 37 ^° C per 1 ora.
5. Trasferire 10 ml Dpn I trattati PCR prodotti in 50 ml di cellule competenti DH5α per trasformazione. Incubare in ghiaccio per 30 minuti, seguita da 45 sec shock termico a 42 ^° C e 5 min in ghiaccio. Aggiungere 500 ml di LB e agitare a 37 ^° C per 1 h prima di placcatura su piastre LB-agar. Incubare O / N a 37 ^° C.
6. Scegli una colonia dal O / N cresciuto piastre di agar utilizzando una sterile gialla punta della pipetta, far cadere la punta in una provetta contenente 5 ml di LB, e crescere O / N in C shaker 37 ^°. Isolare plasmide utilizzando un kit miniprep e la sequenza del plasmide per confermare mutazione, secondo il protocollo del produttore.

9. Determinazione del ciclo cellulare fase lunghezze con EdU incorporazione Assay

1. cell sorting
   1. Transfect 2 x 10 ⁵ cellule con vettori indicati (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-RFP o MTS-Cdk1-dn-RFP) in una piastra da 6 pozzetti con 1: 2 (w: v , 2.5 mg: 5 ml) rapporto tra DNA: Transfection Reagent miscela preparata in 2,5 ml di siero e dei media cultura libera antibiotico per 48 ore. celle di ordinamento dal vivo esprimono stabilmente le proteine ​​CyclinB1 GFP-tagged Cdk1 e RFP-tag tramite citofluorimetro.
      1. Lavare le cellule con 1 x PBS, aggiungere 100 ml di tripsina nel piatto e incubare a 37 ^° C per 5 min. Aggiungere 2 ml di terreni di coltura per raccogliere le cellule e farli passare attraverso un filtro 70 micron per generare una sospensione di cellule singole. Lavare la sospensione cellulare singola con 500 ml di 1% siero fetale di vitello in PBS (FCS / PBS) prima di caricarli sul citofluorimetro.
      2. Impostare i parametri di ordinamento seguenti protocolli stabiliti ¹⁸ gating per le cellule doppio positive colorate sia con GFP e RFP. Raccogliere le cellule ordinati in uscita dal citometro in un tubo contaiNing mezzo di coltura cellulare e utilizzare queste cellule per l'analisi della progressione del ciclo cellulare con etichettatura EdU pulse-chase come nel protocollo 9.2.
2. Misurazione della lunghezza del ciclo cellulare con il saggio EdU Labeling Citometria a Flusso
   1. Cellule Seed filtrate a 6 pozzetti ad una densità di 2,5 x 10 ⁵ cellule per pozzetto e cultura O / N a 37 ^° C in un incubatore CO _2. Aggiungere EdU al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 25 pM. Incubare a 37 ^° C in un incubatore CO ₂ per 1 ora.
   2. Lavare le cellule con 1% BSA in 500 microlitri di PBS e raccoglierli in una provetta da 1,5 ml ad intervalli di 2 hr per un totale di 10 - 12 ore.
   3. cellule centrifugare a 350 xg per 5 minuti, scartare il surnatante. Sloggiare i pellet aggiungendo 100 ml di soluzione di fissaggio (fornito dal produttore all'interno del kit di etichettatura UDE) per 15 minuti a temperatura ambiente e mescolare bene.
   4. Lavare le cellule con 1 ml di 1% BSA in PBS per tre volte. fissare lacellule di nuovo con 0,5 ml di etanolo al 70% O / N a 4 ^° C.
      Nota: fissaggio etanolo è fondamentale per placare la fluorescenza GFP / RFP interna dovuta alla espressione della proteina ricombinante-tag.
   5. Centrifugare le cellule di nuovo a 350 xg per 5 minuti e lavare il pellet con 1 ml di 1% BSA in PBS volta. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone permeabilizzazione (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNasi A in PBS) per 20 minuti a RT.
   6. Lavare le cellule con 1 ml di 1% BSA in PBS volta. Aggiungere 0,5 ml di cocktail di reazione in ciascuna provetta e mescolare bene. Incubare miscela di reazione a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
   7. Lavare con 1 ml di 1% BSA in PBS volta e DNA macchia con 50 ug / ml di ioduro di propidio (PI) in 1 ml di 1% BSA in PBS.
   8. Analizzare le cellule mediante citometria di flusso per seguire la popolazione edu-positivo. Presente dot plot dispersione di cellule edu-etichettati colorate per il contenuto di DNA (PI colorazione, asse X) e EdU (Alexa 647 di colorazione, asse Y).
      1. Utilizzare il canale APC per AlexA647-EDU utilizzando un filtro passa banda 670/30 con tutti i presenti la luce meno di 685 nm colpire quel filtro; e ficoeritrina (PE) canale per PI con un filtro passa banda 581/15 davanti con tutti i presenti luce inferiore a 600 nm colpire quel filtro.
      2. Inserire il primo tubolare contenente nella citometria a flusso e utilizzare una strategia di gating standard per l'acquisizione: Plot FSC Area X SSC-Area per la morfologia seguito da PI (canale PE) X Alexa647-EDU (canale APC) per la colorazione delle cellule. Dati record per tutti i tubi uno per uno l'acquisizione di 10.000 eventi per campione.
      3. Determinare la distribuzione di fase del ciclo cellulare delle cellule e lunghezze di fase utilizzando un citofluorimetro software di analisi dati seguenti protocolli stabiliti ^11,30.

Risultati

Localizzazione sub-mitocondriale di CyclinB1 e Cdk1

estrazione di carbonato di sodio viene utilizzato per determinare se una proteina si trova all'interno dei mitocondri o sulla superficie esterna, cioè della membrana esterna. Una volta che una proteina è indicata per localizzare all'interno dei mitocondri, ulteriore determinazione di localizzazione sub-mitocondriale può essere effettuato tramite mi...

Discussione

Come le proteine ​​destinate ad altri organuli subcellulari, le proteine ​​mitocondriali mirato possiedono segnali di targeting all'interno della loro struttura primaria o secondaria che li dirigono al organello con l'assistenza di translocating proteine ​​elaborato e piegatrici ^21,22. I mitocondri di targeting sequenze (MTS) ottenuti da proteine ​​residenti esclusivamente mitocondriali come COX8 possono essere aggiunti al N-terminale della sequenza di gene bersaglio specifiche protein...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956