Approches expérimentales pour l'étude mitochondrial Localisation et fonction d'une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1

Résumé

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Résumé

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Introduction

Chez les mammifères, la progression du cycle cellulaire dépend d'événements hautement ordonnés contrôlés par des cyclines et des kinases cycline-dépendantes (CDK) ^1. Grâce à son cytoplasmique, nucléaire, et la localisation centrosomale, CyclinB1 / Cdk1 est capable de synchroniser différents événements dans la mitose, comme l' éclatement de l' enveloppe nucléaire et la séparation centrosome ^2. CyclinB1 / Cdk1 protège les cellules contre l' apoptose mitose ³ et favorise la fission mitochondriale, une étape critique pour une répartition égale des mitochondries des cellules filles nouvellement formées ^4.

Dans la prolifération des cellules de mammifères, mitochondriale d'ATP est généré par la phosphorylation oxydative (OXPHOS) la machine (chaîne de transport d'électrons), qui est composée de 5 complexes de sous-unités multiples; Complexe I - V complexe (CI-CV). Nicotinamide adénine dinucléotide (NADH): ubiquinone oxydoréductase ou complexe I (CI) est le plus grand et le moins bien compris des cinq complexes ^5. Le c complexeonsists de 45 sous-unités, dont 14 forment le noyau catalytique. Une fois assemblé, le complexe prend une structure en forme de L avec une branche qui pénètre dans la matrice et l'autre bras noyé dans la membrane interne de ^6,7. Les mutations dans les sous - unités de CI sont à l'origine d'une variété de troubles mitochondriaux ^8. Un CI fonctionnellement efficace OXPHOS est nécessaire non seulement pour la respiration mitochondriale globale ^9, mais aussi pour la cellule réussie progression du cycle ^10. Démêler les mécanismes sous-jacents au fonctionnement de ce complexe enzymatique liée à la membrane dans la santé et la maladie pourrait permettre le développement de nouvelles procédures de diagnostic et des stratégies thérapeutiques de pointe. Dans une étude récente, nous avons constaté que le / complexe Cdk1 de CyclinB1 translocation dans les mitochondries dans le G2 / (mitose) phase (Gap 2) M et phosphoryle sous-unités CI pour améliorer la production d'énergie mitochondriale, ce qui pourrait compenser les besoins énergétiques accrus de cellules pendant la cellule cycle de ^11. Ici, nous SHOwcase procédures expérimentales et les stratégies qui peuvent être utilisés pour étudier la translocation mitochondriale des kinases autrement nucléaires / cytoplasmiques, leurs substrats mitochondriaux ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur localisation mitochondriale utilisant CyclinB1 / Cdk1 comme un exemple.

La constatation que le / complexe Cdk1 de CyclinB1 translocation dans les mitochondries en cas de besoin incité les études de surexpression et knockdown de ce complexe spécifique de mitochondries. Pour parvenir à une expression spécifique des mitochondries de protéines, on peut ajouter une séquence de ciblage mitochondrial (MTS) à l'extrémité N-terminale de la protéine d'intérêt. Mitochondrie séquences de ciblage permettent le tri des protéines mitochondriales dans les mitochondries où ils résident normalement ^12. Nous avons utilisé une séquence de ciblage 87 mitochondries de base dérivé du précurseur du cytochrome humain sous-unité c oxydase 8A (COX8) et cloné dans Green Fluorescent Protein (GFP) -tagged CyclinB1 ou rouge fluorescentProtein (RFP) -tagged Cdk1 contenant des plasmides dans le cadre. Cette méthode nous a permis de cibler CyclinB1 et Cdk1 dans les mitochondries, en changeant spécifiquement l'expression mitochondrial de ces protéines sans affecter leur piscine nucléaire. Par marquage par fluorescence ces protéines, nous avons été en mesure de suivre leur localisation en temps réel. De même, nous avons introduit MTS dans un plasmide contenant DP-tagged dominante Cdk1 négative, ce qui nous a permis de frapper spécifiquement vers le bas l'expression mitochondrial et les fonctions de Cdk1. Il est essentiel de faire la distinction entre les fonctions mitochondriales et nucléaires des kinases qui ont deux localisations comme Cdk1. Ingénierie MTS dans la N-terminale de ces kinases fonctionnelles double offre une grande stratégie qui est facile à employer et efficace.

Etant donné que Cdk1 est une kinase du cycle cellulaire, il est essentiel de déterminer la progression du cycle cellulaire lorsque Cdk1 est localisé dans les mitochondries. Pour ce faire, nous avons utilisé une nouvelle méthod pour surveiller la teneur en ADN dans les cellules. Les méthodes traditionnelles comprennent l'utilisation de la BrdU (bromodésoxyuridine), un analogue de la thymidine synthétique, qui incorpore dans l'ADN nouvellement synthétisé au cours de la phase S du cycle cellulaire pour remplacer thymidine. Ensuite, les cellules qui se répliquent activement leur ADN peuvent être détectés en utilisant des anticorps anti-BrdU. Un inconvénient de cette méthode est qu'elle nécessite la dénaturation de l' ADN pour fournir un accès pour l'anticorps BrdU par des méthodes chimiques comme le traitement de l' acide ou de la chaleur, ce qui peut entraîner une incompatibilité entre les résultats ^13,14. Sinon, nous avons utilisé une approche similaire pour surveiller les cellules qui se divisent activement avec un analogue de la thymidine différente, EdU. la détection EdU ne nécessite pas sévère dénaturation de l'ADN en tant que traitement de détergent permet au réactif de détection pour accéder à la EdU dans l'ADN nouvellement synthétisé. La méthode EdU a prouvé être plus fiable, cohérente et avec un potentiel d'analyse à haut débit ^15.

Enfin, le to déterminer les substrats mitochondriaux de Cdk1, nous avons utilisé un outil de protéomique appelé 2D-DIGE, qui est une version avancée de l'électrophorèse sur gel à deux dimensions classique. électrophorèse bidimensionnelle sépare les protéines en fonction de leur point isoélectrique dans la première dimension et un poids moléculaire dans le second. Etant donné que des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation affectent le point isoélectrique et le poids moléculaire des protéines, des gels 2D peuvent détecter les différences entre les états de phosphorylation de protéines dans les différents échantillons. La taille (surface et intensité) de la protéine voit des changements au niveau des protéines d'expression, ce qui permet une comparaison quantitative entre plusieurs échantillons. En utilisant cette méthode, nous avons été en mesure de différencier les protéines phosphorylées en type sauvage par rapport aux cellules mutantes mitochondries ciblées Cdk1 exprimant. Les taches de protéines spécifiques qui ont montré dans le type sauvage, mais il manquait dans le mutant Cdk1 préparation des mitochondries ciblées ont été isolées etidentifié par spectrométrie de masse.

Dans les gels 2D traditionnels, les colorants triphénylméthane sont utilisés pour visualiser les protéines sur le gel. 2D-DIGE utilise des étiquettes de protéines fluorescentes avec un effet minimal sur la protéine mobilité électrophorétique. Des échantillons de protéines différentes peuvent être marqués avec différents colorants fluorescents, mélangés entre eux et séparés par des gels identiques, ce qui permet le co-électrophorèse des échantillons multiples sur un seul gel ^16. Cela permet de minimiser les variations de gel de gel, ce qui est un problème critique dans les études protéomiques à base de gel.

Protocole

1. Isolement des mitochondries de cellules cultivées

1. Préparation d'isolement tampon pour cellules (IBc) Buffer
   1. Préparer 0,1 M de Tris / MOPS (tris (hydroxyméthyl) aminométhane / 3- (N - morpholino) propanesulfonique): dissoudre 12,1 g de Tris dans 800 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 7,4 à l' aide MOPS poudre, ajouter de l' eau distillée jusqu'à un total volume de 1 L et conserver à 4 ^o C.
   2. Préparer 0,1 M d'EGTA (éthylène glycol bis (éther 2-aminoéthyl) tétraacétique) / Tris: Dissoudre 38,1 g d'EGTA dans 800 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 7,4 en utilisant une poudre de Tris, ajouter de l'eau distillée jusqu'à un volume total de 1 litre et stocker à 4 ^o C.
   3. Préparer 1 M sucrose: dissoudre 34,23 g de saccharose dans 100 ml d'eau distillée, faire 20 ml aliquotes et conserver à -20 ^° C
   4. Préparer un tampon _{de c} IB: préparer 100 ml de tampon IB _c par addition de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS et 1 ml de 0,1 M d' EGTA / Tris à 20 ml; 1 M de saccharose. Ajouter de l'eau distillée jusqu'à un volume total de 100 ml. Ajuster le pH à 7,4.
2. Préparation du tampon de lyse cellulaire
   1. Préparer le tampon de lyse contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA (acide éthylène diamino), 1 mM d'EGTA, 1% de Triton-X-100, 2,5 Pyrophosphate mM de sodium, 1 mM de β- glycérophosphate, orthovanadate de sodium 1 mM. Ajouter des inhibiteurs de proteinases 1 pg / ml de leupeptine et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle) juste avant utilisation.
3. L' isolement des mitochondries
   1. Récolte de 3 x 10 ⁷ cellules avec de la glace froide 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4 et centrifugation des cellules à 600 xg pendant 10 min à 4 ^° C Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon IB _c glacée.
   2. Homogénéiser les cellules en utilisant un broyeur de tissus de verre / verre pour environ 10 min. Transférer le broyat dans un tube de 15 ml et on centrifuge à 600 g pendant 10 min à 4 ^o C. Pour les mitochondries fonctionnelles, utiliser le couplage verre / téflon comme il est moins dommageable pour les mitochondries que le broyeur de tissus de verre / verre.
   3. Recueillir le surnageant dans 1,5 ml tubes et centrifuger à 7000 xg pendant 10 min à 4 ^° C Transférer le surnageant dans un tube de 1,5 ml et enregistrer en tant que protéines cytosol.
   4. Laver le culot (mitochondries) deux fois avec 200 pi IB _c tampon et centrifugeuse glacée à 7000 xg pendant 10 min à 4 ^° C
   5. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans le tampon de lyse cellulaire et de l' utiliser immédiatement ou conserver à -80 ^° C pour une utilisation future. Si les mitochondries fonctionnelles sont nécessaires, remettre en suspension le culot dans le tampon restant après élimination du surnageant. La dilution de la fraction mitochondriale peut en outre entraîner la perte de la fonction des mitochondries. Stocker sur la glace et utiliser la préparation in 1 - 3 heures pour obtenir les meilleurs résultats.
   6. Soniquer le culot remis en suspension pendant trente salves 3 sec dans unbain de glace, centrifugeuse à 10.000 xg pendant 5 min, puis enregistrez le surnageant comme la fraction mitochondriale.

2. Co-immunocoloration de Cdk1, CyclinB1 et COXIV, une protéine mitochondriale Resident

1. Cultivez 5 x 10 ⁴ cellules sur des lamelles dans 24 puits de plaques O / N ou jusqu'à 70% de confluence. Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 500 ul glacée 1 x PBS, pH 7,4.
2. Fixer les cellules avec 500 ul glacé paraformaldéhyde 4% à température ambiante pendant 10 min. Aspirer la solution de fixage et laver les cellules avec 500 ul de PBS 1 x 3 fois, 5 minutes à chaque fois avec une agitation douce à température ambiante.
3. Perméabiliser les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans 500 pl de PBS pendant 5 min à température ambiante. Aspirer la solution et laver les cellules 3 fois, 5 min chacun avec 500 ul de PBS. Ajouter la solution de blocage (500 ul, 1% de SAB (sérumalbumine bovine) dans du PBS contenant 1% de Tween 20) pendant 30 min à température ambiante.
4. Diluer les anticorps primaires 1: 250 (v: v) dans 5001; l de solution de blocage et incuber les cellules avec des anticorps primaires souhaitées soulevées dans différentes espèces afin d'éviter la signalisation croisée (CyclinB1 (souris) et COXIV (lapin) ou Cdk1 (souris) et COXIV (lapin) à température ambiante pendant 30 - 60 min ou O / N à 4 ^o C.
5. On lave les lamelles couvre-objet avec 500 ul de 1 x PBS trois fois, cinq minutes à chaque fois, puis laisser incuber avec l'anticorps secondaire dilué 1: 1000 dans 500 ul de solution de blocage à température ambiante pendant 1 heure suivie d'un lavage avec 500 ul de PBS 3 fois, 5 minutes à chaque fois.
6. Monter les lamelles avec 20 pi de solution de montage anti-fade et sceller les lames avec du vernis à ongles. Image les diapositives à l' aide d' un microscope à fluorescence immédiatement ou garder dans l'obscurité à 4 ^° C pendant 1 - 2 semaines.

3. Sodium Carbonate Extraction des mitochondries Intact

1. Cultivez environ 20 x 10 ⁷ cellules, récolte, laver une fois avec du PBS et isoler les mitochondries comme décrit dans la section 1. Divisez mitochondrial isolats en deux parts avant la dernière centrifugation pour sédimenter les mitochondries (avant l'étape 1.3.4); d'économiser la moitié à être utilisé comme la mitochondrie totale (étape 3.2), utiliser l'autre moitié pour l'extraction du carbonate de sodium (en suivant les étapes 3.3 à 3.6) pour séparer les protéines liées solubles et membranaires.
2. Lyser le total mitochondries culot avec 30 ul de tampon de lyse cellulaire et de stocker le lysat à -80 ^° C jusqu'à leur utilisation en immunotransfert.
3. Ajouter 250 ul de 0,1 M de Na ₂ CO ₃ (carbonate de sodium), pH 11,0, l'autre moitié du culot mitochondrial et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes.
4. Centrifugeuse à 100.000 xg pendant 20 min. Recueillir le surnageant et passez à l'étape 3.5. Lyser le culot en utilisant 30 ul de tampon de lyse cellulaire et de traitement par ultrasons comme dans l'étape 1.3.6. Conserver à -80 ^° C jusqu'à son utilisation en immunoblot.
5. Ajouter un volume égal de 20% d'acide trichloracétique fraîchement préparé (TCA) au surnageant pour précipiter les protéines et de garder sur la glace pendant 30 min.
6. centrifuge à 15 000 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant, dissoudre le culot dans 80 ul de tampon de lyse cellulaire et conserver à -80 ^° C jusqu'à son utilisation en immunoblot.

4. Séparation des intérieures et extérieures Membranes de mitochondries (Isolement de mitoplastes)

1. Cultivez environ 20 x 10 ⁷ cellules, récolte, laver une fois avec du PBS et isoler les mitochondries comme décrit dans la section 1. Séparer les fractions mitochondriales en 10 portions égales avant la dernière centrifugation pour sédimenter les mitochondries (avant l' étape 1.3.4).
2. Dissoudre chaque culot dans 30 ul de la concentration du tampon de saccharose hypotonique indiquée (1 mM d'EDTA, 10 mM de MOPS / KOH (hydroxyde de potassium), à pH 7,2, la concentration de saccharose allant de 25 à 200 mM), avec ou sans 50 pg / ml de trypsine ( voir le tableau 1) et incuber 30 min sur la glace.
3. Ajouter 3 ul de 10 mM de PMSF (pour atteindre une concentration finale de 1 mM de PMSF) à la trypsine contenant des flacons pour arrêter til digestion par la trypsine et incuber sur de la glace pendant 10 min.
4. Centrifugeuse à 14.000 xg à 4 ^° C pendant 10 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, lyser le culot dans 30 ul de tampon de lyse cellulaire, sonication comme à l' étape 1.3.6, et conserver à -80 ^o C.

5. Construction des mitochondries ciblées GFP / RFP-tagged CyclinB1 / Cdk1 vecteurs et confirmation de leur localisation mitochondriale

1. Cloner les mitochondries séquence cible (MTS, dérivé du précurseur du cytochrome humain sous-unité c oxydase 8A (COX8) entre les nucléotides 76 - 161) dans le cadre dans l'extrémité N-terminale de la GFP ou RFP au niveau des sites Nhel et BamHI du plasmide pEGFP-N1 ou pERFP vecteurs -n1 en utilisant des techniques moléculaires standards de clonage.
2. Lors de la conception des amorces de PCR pour les gènes et CyclinB1 CDK1, ajouter des sites d'enzymes de restriction Bam HI de reconnaissance (en gras) à l'extrémité 5 'des amorces de PCR.
   Forward Cdk1 BamH15 'ACG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Inverser Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   Forward CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   Inverser CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
3. Amplifier les gènes CDK1 et CyclinB1 utilisant ces amorces suivant des techniques standard. Digérer les produits de PCR avec 1 pi d'enzyme de restriction BamHI à 37 ° C pendant 2 heures. Exécuter les produits de digestion sur un gel d'agarose à 1%. En utilisant une lame de rasoir, couper les fragments d'ADN corrects sur -sized et on purifie l'ADN à partir du gel en utilisant un kit d'extraction de gel.
4. Digest 1 pg de MTS-pEGFP-N1 et les plasmides MTS-pERFP-N1 avec 1 pi d'enzyme BamHI à 37 ° C pendant 2 heures. Ajouter 1 pl de Calf-Intesintestinal phosphatase alcaline (CIP) pendant 30 min à 37 ° C. Exécuter les produits de digestion sur un gel d'agarose à 1% et on purifie les plasmides linéaires à partir du gel comme à l'étape 5.3.
5. Mettre en place une réaction de ligature en ajoutant 1 ul de plasmide obtenu à l' étape 5.4 et 5 pi de Cdk1 ou CyclinB1 à l' étape 5.3 à 3 pi de tampon de ligase, 0,5 ul de ligase de T4 et 20,5 ul de dH ₂ O. Incuber O / N à 4 ° C.
6. Transformer Escherichia coli DH5a compétentes les cellules avec 10 pl de mélange de ligature en suivant les techniques standards et cultiver les bactéries sur 10 mg / ml de kanamycine LB contenant des plaques d' agar - agar O / N à 37 ° C pour obtenir des colonies.
7. Choisissez-en une colonie de O / N plaques adultes à l'aide d'une pointe de pipette stérile, insérer la pointe dans 5 ml de kanamycine-LB contenant le tube et incuber O / N. Isoler le plasmide en utilisant des kits miniprep selon le protocole du fabricant, et la séquence du plasmide en utilisant des techniques standard.
8. Transfecter MCF1 croissance exponentielleLes cellules de 0A (1,5 x 10 ⁴ cellules ensemencées sur des plaques à 96 puits) avec MTS Cdk1-DP ou MTS CyclinB1-GFP plasmides de l' étape 5.7 de préparation d' un plasmide / transfection rapport de réactif 1: 2 (p: v, 100 ng : 0,2 pi) dans 100 pi de sérum et un milieu sans antibiotiques.
9. Incuber les cellules dans le plasmide / réactif mélange pendant 48 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ avec contrôle d'humidité (5% de _CO2, 95% d' humidité relative).
10. Préparer mM solution de mitochondriales colorants fluorescents rouge et vert 1 en dissolvant 50 ug de poudre dans 100 pi de DMSO. Diluer les solutions de stock 1: 400 dans PBS 1x pour obtenir 2,5 uM solutions de travail. Les solutions mères sont conservées à -20 ° C pendant un an.
11. Mélanger 2 ul de 2,5 uM de colorant rouge avec 98 ul de milieu de culture pour préparer une concentration finale de 50 nM.
12. Remplacez le milieu de culture cellulaire de CyclinB1-GFP portant des cellules MCF10A (générées à l'étape 5.8) avec un colorant rouge contenant du milieu pendant 2 min. Répétez lamême procédure avec un colorant vert pour les cellules portant MCF10A Cdk1-DP.
13. Laver deux fois avec 100 pi 1 x PBS pour se débarrasser de la solution de coloration en excès, ajouter 100 ul PBS 1x à la plaque de 96 puits.
14. Visualiser les mitochondries et CyclinB1-GFP (excitation à 488 nm et par l'émission à 494-536 nm) et Cdk1-DP (excitation de 560 nm et émission à 565-620 nm) sur des plaques à 96 puits sous microscope à fluorescence à un grossissement de 40X.

6. Identification des protéines différentiellement phosphorylée via 2D-DIGE

1. La préparation des échantillons
   1. Isoler mitochondries et lyser fractions mitochondriales comme à l'étape 1.3. Ajouter un volume égal de 20% de TCA (acide trichloroacétique dans de l'eau) à chaque échantillon et vortexer pendant 15 secondes. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 30 minutes, les protéines précipitent hors de la solution.
   2. Centrifuger les échantillons à 9300 xg à 4 ° C pendant 5 minutes, retirer le surnageant et ajouter 60 ul d'acétone froide (100%), suivie parcentrifugation à 9 300 x g à 4 ° C pendant 5 min.
   3. Répétez l'étape de lavage à l'acétone (étape 6.1.2) un de plus de temps, retirer le surnageant et remettre en suspension les échantillons dans 50 pi de tampon d'étiquetage DIGE (7 M d'urée, 2 M thiourée, 4% de CHAPS, Tris 30 mM, pH 8,5).
2. Préparer le Fluorescent Dyes
   1. Préparer la solution de stock: Dissoudre les colorants (5 nmol) dans 5 pi de diméthyle frais formamide (DMF) à une concentration finale de 1 nmol / ul. Conserver la solution stock colorant à -20 ^° C jusqu'à utilisation pendant quelques mois.
   2. Préparer la solution de travail: Permettre aux colorants pour régler à température ambiante pendant 5 min. Diluer 1 pl de colorant avec 4 ul de DMF à une concentration finale de 200 pmol / ul. Gardez sur la glace lors de l'utilisation. Remarque: La solution de travail peut être conservé à -20 ^° C pendant 3 semaines.
3. Les protéines d'étiquetage
   1. Mélanger 1 pi de solution de travail de colorant par 12,5 pg de protéine. Intensifier au besoin. Pour les normes mises en commun, ajouter 61; l de solution de travail Cy2 à 300 pg de protéine mis en commun.
   2. Vortex pendant 30 secondes et centrifuger à 4 ° C pendant 30 secondes à 12.000 x g. Incuber sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min. Arrêtez l'étiquetage en ajoutant 1 pl de lysine mM par 1 pi de solution de travail utilisés 10. Bien mélanger et incuber sur de la glace dans l'obscurité pendant 10 min.
   3. Piscine étiquetés individuellement des échantillons et mélanger avec un tampon de réhydratation (7 M d'urée, 2 M thiourée, 4% de CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, bleu de bromophénol). Le volume total sera de 125 pi.
   4. Des échantillons de vortex pendant 30 secondes et laisser les échantillons fixés à la température ambiante pendant 30 min. Charge de 125 pi d'échantillons 7 cm pH SUR DES 4-9, isoélectrofocalisation (IEF) bandes.
4. Première Dimension Electrophoresis
   1. Placez les supports de bande (cercueils) sur la plaque d'électrode, assurant que les supports de bande sont complètement propres et secs. Pipeter 125 échantillons ul dans un cercueil, étaler uniformément sur l'ensemble du cercueil.
   2. Utilisation de tweezers, ramasser la bande IEF, retirez soigneusement le couvercle de protection en plastique, et placez-le (côté gel vers le bas) dans le tampon cercueil / réhydratation. Éviter d'emprisonner des bulles d'air. Remplir lentement le cercueil (1 - 1,5 ml) avec de l'huile minérale et placer le cercueil couvre sur les cercueils.
   3. Commencer isoélectrofocalisation en suivant le protocole dans le tableau 2:
      Remarque: Une fois la course terminée, les bandes peuvent être stockés dans des tubes en plastique à -80 ^o C ou directement passés à l' équilibration et la deuxième dimension.
5. Deuxième dimension - dodécylsulfate de sodium-gel de Polyacrylamide (SDS-PAGE)
   1. équilibration
      1. Décongeler le tampon d'équilibrage SDS (8 ml par bande, 6 M d'urée, 30% de glycérol, 2% SDS). Peser dithiothréitol (DTT, 10 mg de DTT par 1 ml de tampon d'équilibration SDS). Dissoudre DTT dans 4 ml de SDS tampon d'équilibrage.
      2. Peser IAA (iodoacétamide, 25 mg IAA par 1 ml de tampon d'équilibration SDS).Dissoudre l'IAA dans 4 ml de SDS tampon d'équilibrage.
      3. Faire fondre 1 ml d'étanchéité solution d'agarose dans un bain d'eau pour une utilisation ultérieure.
      4. Si les bandes ont été gelés, leur permettre de décongeler complètement. Placer les bandes côté gel vers le haut dans le bac de regonflement. Ajouter 4 ml de tampon d'équilibration SDS avec la TNT à chaque bande et incuber pendant 15 min en agitant doucement.
      5. Verser tout le tampon d'équilibration SDS avec la TNT. Ajouter 4 ml de tampon d'équilibration SDS avec IAA à chaque bande et incuber pendant 15 min en agitant doucement. Après équilibrage avec le tampon de l'AAI, verser le tampon d'équilibrage SDS.
   2. SDS-PAGE
      1. Déballer mini - gels, retirez le peigne et rincer le gel et les puits avec ddH ₂ O. Retirer le ruban blanc au fond du gel avant de courir. Orientez la bande sur le gel correctement, l'orientation de gel est essentiel pour la coupe du spot.
      2. Placez le plat de gel sur le comptoir avec la petite plaque et le dessus de gel face experimenter. Posez la bande sur la plaque de haut avec l'extrémité anodique (++ fin avec le code à barres) tournée vers le côté gauche du gel. En utilisant une règle, poussez lentement la bande vers le bas sur la surface du gel. Éviter d'emprisonner des bulles d'air entre la bande et le gel. Placer le gel dans une position de plaque de verre.
      3. Ajouter 1 ml de solution d'agarose de scellage à chaud à l'ouverture de la cassette. Assurez-vous que toutes les bulles d'air sont pressés à l'aide d'une règle plate. Assembler l'appareil et exécuter le gel à une 125 V constante pendant 90 min.
      4. Lorsque le gel fin de l' exécution, placer le gel sur un système d' imagerie biomoléculaire avec 2 ml ddH ₂ O et analyser le gel dans le mode d'acquisition de la fluorescence à 635 nm laser d'excitation et 665 nm , filtre d'émission.
   3. phosphoprotéine coloration
      1. Fixer deux fois le gel avec 50% de methanol et le mélange d'acide acétique à 10% (10 ml) pendant 30 min. Laver avec 10 ml d'eau pendant 10 min trois fois et tache avec 10 ml phosphoprotéine tache pendant 60-90 min, suivi pardétachage avec 10 ml Destain solution pendant 30 minutes trois fois.
      2. Laver avec 10 ml d'eau 5 min à deux reprises et l'image du gel avec un gel scanner laser à 532 nm / 560 nm Excitation / Emission.
   4. Protein Digestion et identification
      1. Accise tous les différentiellement exprimé des taches de protéines du gel dans des puits de microplaques en utilisant un spot-picker robotique selon les spécifications du fabricant, et ajouter mM de bicarbonate d'ammonium 100 (2 ml) pendant 1 heure à température ambiante à décolorer les morceaux de gel. Déshydrater avec 2 ml de 100% d'acétonitrile laver deux fois et sec dans un concentrateur sous vide pendant 30 min.
      2. Réhydrater les morceaux de gel avec 100 pi de 13 ng / ul trypsine porcine modifiée dans 50 mM de bicarbonate d'ammonium pour 16 heures à 37 ° C. Recueillir le surnageant et extraire en outre les protéines avec 100 pi d'acide trifluoroacétique à 5% dans 50% d'acétonitrile pendant 30 min.
      3. Concentrer les peptides jusqu'à 5 ul par centrifugation sous vide concentrateur et d' analyser avec laser assistée par matrice désorption Ionisation - temps de vol - tandem analyse de spectrométrie de masse (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

7. Essai de kinase in vitro

1. Préparation des substrats
   1. Complexe Sous-clone I (CI) sous-unités (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 et NDUFA12), qui sont identifiés comme cibles Cdk1 différentiellement phosphorylée, dans pGEX-5X-1 vecteur pour générer glutathion-S-transférase (GST) -tagged expression bactérienne plasmides ^11. Purifier sous-unités CI en utilisant les colonnes de glutathion d'affinité élevée suivant le protocole ci-dessous.
      1. Culture étiquetée GST unité CI contenant la souche Escherichia coli BL-21 dans le milieu Luria-Bertani (LB) avec 50 ug / ml d'ampicilline dans un shaker à 37 ^° C jusqu'à une densité optique (DO) de 0,6 a été atteint. Ajouter isopropylique-bD-thio-galactopyranoside (IPTG) au culteure à une concentration finale de 0,1 mM, et on incube pendant une 3 heures supplémentaires.
      2. Centrifuger à 600 g pendant 10 min pour recueillir les bactéries et les remettre en suspension dans 5 ml de 1 x tampon de PBS contenant 5 mM de DTT, 1 x cocktail inhibiteur de protéinase, et 0,1% de lysozyme. Lyse des cellules par sonication pendant vingt 5 s éclate, et enlever les débris cellulaires par centrifugation à 600 xg pendant 10 min.
      3. Recueillir le surnageant et laisser incuber avec des billes de glutathion-agarose 4B dans un rapport volumique de 4: 1 (surnageant: Perle) pendant 1 heure à température ambiante.
      4. Éluer les protéines de fusion GST à partir des billes avec 3 ml de tampon glutathion d'élution (10 mM de glutathione réduite dans 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0) et soumettre les protéines éluées à une dialyse dans un tube de membrane poreuse moléculaire (masse moléculaire de coupure de 12 -14 kilodaltons) avec 1 x PBS / EDTA 1 mM. Stocker les protéines purifiées à - 80 ^o C.
2. CDK1 Dosage de kinase
   1. Avant de commencer l'âne kinaseay, définir des blocs de chauffage à 30 ° C et 100 ° C. Thaw commerciale CyclinB1 / complexe enzymatique Cdk1 et des substrats sur la glace.
   2. Préparer le mélange de réaction sur de la glace. Depuis ³² P ATP isotope est impliqué, préparer tous les mélanges de réaction dans 1,5 ml tubes échantillons avec des bouchons à vis contenant un joint torique pour empêcher la propagation de la radioactivité.
      Attention: Suivez les règles de protection des matières radioactives. Utilisez un 8 mm plexiglas épais blindage et le travail au moins à la longueur d'un bras. Essuyez toute la zone contaminée avec de l'eau.
   3. Préparer un tampon de réaction de 30 ul contenant 1 x tampon Cdk1 (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 1 mM d' EGTA, 0,01% de Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM d' ATP froid, 0,1 pCi de ^32P ATP, 2 unités de CyclinB1 / Cdk1 et 6 pg de protéine de substrat. Réglez le volume à 30 pi avec ddH ₂ O. Pour la réaction de contrôle positif, remplacer le substrat avec 0,01 mM Histone H1, un CyclinB1 substrat bien connu / Cdk1.
      1. Pour contro négativel réactions, (1) remplacer le substrat avec une protéine seulement de la TPS et (2) remplacer le substrat avec 0,01 mM Histone H1 + 0,5 uM RO-3306, un inhibiteur de la Cdk1 sélective.
   4. Bien mélanger avec la pipette et la centrifugeuse pour amener la totalité du liquide à la base du tube, ce qui minimise le risque de contamination. Incuber à 30 ° C pendant 60 min.
   5. Ajouter 6 ul de tampon d'échantillon SDS 5x pour arrêter la réaction et dénaturés à 100 ^° C pendant 10 min. Exécutez des échantillons sur les 10% gel SDS-PAGE à 160 V pendant 2 heures, ou jusqu'à ce que le colorant avant a atteint la fin du gel. Transfert gel sur un papier de chromatographie et envelopper d'une pellicule plastique.
      Attention: Tout liquide en contact avec des radioisotopes doivent être traités comme des déchets radioactifs et éliminés dans un poly bombonne de 5 gallons fournies par les services de santé et de sécurité de l'environnement, conformément aux directives institutionnelles.
   6. Exposer le gel à un film radiographique pendant 1 jour , ou jusqu'à 1 semaine à -20 ^° C en fonction de l'activité spécifique du radio - isotope utiliséet l'enzyme.

8. La mutagenèse dirigée pour générer dominante Cdk1 négatif (de D146N)

1. amorces Conception de mutagenèse; deux amorces qui sont complémentaires les unes aux autres, contenant le site mutant (G sera remplacé par un nucleotide code pour N au lieu de l' acide D aminé) flanqué de 20 bases de chaque côté ^11.
2. Préparer un 50 pi Polymerase Chain Reaction mélange (PCR) contenant un tampon de réaction 1x, mM dNTP 2,5, 10 uM d'amorces ( à la fois avant et arrière), 40 ng de la matrice, et ddH ₂ O. Ajouter 2,5 U d'ADN polymerase dans la réaction.
3. Exécuter le programme de PCR suivant: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 sec, 55 ° C, 30 min, 68 ° C 6 min; 16 cycles (NB: 68 ° C durée d'incubation est déterminée par la taille de l'ADN 1 min / kb est nécessaire pour l'ADN ≤ 10 kb Pour agrandir l'ADN, 2 minutes / kb, plus 10 secondes par cycle..). Suivi de 68 ° C 7 min et maintenir à 4 ° C jusqu'à utilisation.
4. Ajouter2 pl de Dpn I enzyme de restriction (10 U / ul) et 5,7 ul Dpn I buffer, bien mélanger avec robinet douce avec le doigt et incuber la réaction à 37 ^° C pendant 1 heure.
5. Transférer 10 ul Dpn I-traité des produits de PCR dans 50 pi de cellules compétentes DH5a pour la transformation. Incuber sur la glace pendant 30 min, puis 45 sec de choc thermique à 42 ^° C et 5 min sur la glace. Ajouter 500 pi de LB et agiter à 37 ^° C pendant 1 h avant l' étalement sur ​​des plaques d'agar-LB. Incuber O / N à 37 ^o C.
6. Choisissez une colonie de l'O / N cultive des plaques d' agar en utilisant une pointe de pipette jaune stérile, déposer la pointe dans un tube contenant 5 ml de LB, et de croître O / N dans un 37 ^o C shaker. Isoler le plasmide en utilisant un kit miniprep et la séquence du plasmide pour confirmer la mutation selon le protocole du fabricant.

9. Détermination du cycle cellulaire Phase Longueurs avec EdU Incorporation Assay

1. tri cellulaire
   1. Transfect 2 x 10 ⁵ cellules avec des vecteurs indiqués (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-DP ou MTS-Cdk1-dn-RFP) dans une plaque à 6 puits en utilisant 1: 2 (w: v , 2,5 pg: 5 pi) rapport de l'ADN: transfection réactif mélange préparé dans 2,5 ml de sérum et de milieux de culture sans antibiotique pendant 48 heures. cellules de tri en direct exprimant de manière stable les protéines CyclinB1 GFP-tagged Cdk1 et RFP marqués par cytométrie de flux.
      1. Laver les cellules avec 1 x PBS, ajouter 100 pi de trypsine dans le moule et laisser incuber à 37 ^° C pendant 5 min. Ajouter 2 ml de milieux de culture pour recueillir les cellules et les passer à travers un filtre de 70 um pour générer une suspension cellulaire unique. Laver la suspension cellulaire unique avec 500 pi de 1% de sérum de veau foetal dans du PBS (FCS / PBS) avant de les charger sur cytométrie de flux.
      2. Mettre en place les paramètres de tri suivant des protocoles établis ¹⁸ gating pour les cellules doubles positives colorées à la fois avec la GFP et RFP. Recueillir les cellules triées sortant du cytomètre dans un tube containing milieu de culture cellulaire et à utiliser ces cellules pour l'analyse de la progression du cycle cellulaire avec un étiquetage EdU pulse-chase que dans le protocole 9.2.
2. Mesure de la longueur du cycle cellulaire en utilisant le test EdU Étiquetage cytométrie de flux
   1. Cellules de semences triées dans des plaques 6 puits à une densité de 2,5 x 10 ⁵ cellules par puits et culture O / N à 37 ^° C dans un incubateur CO _2. Ajouter EdU au milieu de culture à une concentration finale de 25 uM. Incuber à 37 ^° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 1 heure.
   2. Laver les cellules avec 1% de BSA dans 500 ul de PBS et les recueillir dans un tube de 1,5 ml à des intervalles de 2 h pour un total de 10-12 heures.
   3. Centrifuger les cellules à 350 g pendant 5 min, jeter le surnageant. Déloger le culot en ajoutant 100 pi de solution de fixation (fournie par le fabricant dans le kit de marquage EdU) pendant 15 min à température ambiante et bien mélanger.
   4. Laver les cellules avec 1 ml de BSA à 1% dans du PBS trois fois. Fixer lecellules à nouveau avec 0,5 ml d'éthanol à 70% O / N à 4 ^o C.
      Remarque: la fixation de l'éthanol est essentielle pour étancher la fluorescence GFP / RFP interne due à l'expression recombinante étiquetée protéine.
   5. Centrifuger les cellules à nouveau à 350 g pendant 5 min et laver le culot avec 1 ml de BSA à 1% dans du PBS une fois. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de perméabilisation (0,1% de Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml de RNase A dans du PBS) pendant 20 min à température ambiante.
   6. Laver les cellules avec 1 ml de BSA à 1% dans du PBS une fois. Ajouter 0,5 mL de réaction cocktail dans chaque tube et bien mélanger. Incuber le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité.
   7. Laver avec 1 ml de BSA à 1% dans du PBS et une fois que l'ADN tache avec 50 pg / ml d'iodure de propidium (PI) dans 1 ml de BSA à 1% dans du PBS.
   8. Analyser les cellules par cytométrie de flux pour suivre la population EdU-positive. Présent terrain scatter de points de cellules EdU marqués colorées pour la teneur en ADN (PI coloration, axe X) et EdU (Alexa 647 coloration, l'axe Y).
      1. Utilisez le canal APC pour AlexA647-EdU utilisant un filtre passe-bande de 670/30 avec toute la lumière présente moins de 685 nm frapper ce filtre; et phycoérythrine (PE) canal pour PI avec un filtre passe-bande de 581/15 à l'avant de celui-ci avec toute lumière présente moins de 600 nm frapper ce filtre.
      2. Insérez les premières cellules du tube contenant dans la cytométrie en flux et utiliser une stratégie de déclenchement standard pour l'acquisition: Terrain FSC-Zone X SSC-Zone pour la morphologie suivie par PI (canal PE) X Alexa647-EdU (canal APC) pour la coloration des cellules. Enregistrer les données pour tous les tubes un par un acquérant 10.000 événements par échantillon.
      3. Déterminer la distribution de phase du cycle cellulaire des cellules et des longueurs de phase en utilisant une cytométrie de flux logiciel d'analyse des données selon des protocoles établis ^11,30.

Résultats

Localisation sous-mitochondrial de CyclinB1 et Cdk1

l'extraction du carbonate de sodium est utilisé pour déterminer si une protéine se trouve à l'intérieur de la mitochondrie ou sur la surface extérieure, à savoir la membrane externe. Une fois une protéine est représentée à localiser l'intérieur des mitochondries, en outre la détermination de la sous-mitochondrial localisation peut se ...

Discussion

Comme les protéines destinées à d' autres organites sous - cellulaires, les protéines mitochondriales cible possèdent des signaux de ciblage au sein de leur structure primaire ou secondaire qui les dirigent vers l'organite avec l'assistance de translocation de protéines complexes et plieuses ^21,22. Mitochondrie séquences de ciblage (MTS) obtenues à partir des protéines résidentes exclusivement mitochondriales telles que COX8 peuvent être ajoutés à extrémité N-terminale d'une sé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956