Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

Resumo

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Resumo

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Introdução

Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) ^1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma ^2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose ³ e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados ^4.

Em proliferação de células de mamíferos, mitocondrial de ATP é gerado através da fosforilação oxidativa (FOX) construção (cadeia de transporte de electrões), o qual é composto por 5 complexos de multi-subunidades; Complexo I - V complexo (CI-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): oxidorredutase ubiquinona ou complexo I (CI) é a maior e menos compreendido dos cinco complexos de ^5. O complexo Consists de 45 subunidades, das quais 14 formam o núcleo catalítico. Uma vez montado, o complexo assume uma estrutura em forma de L com um braço saliente na matriz e o outro braço incorporado na membrana interna ^6,7. Mutações em subunidades de IC são a causa de uma variedade de doenças mitocondriais ^8. Um IC funcionalmente eficiente em OXPHOS é necessário não só para a respiração mitocondrial geral ^9, mas também para a progressão do ciclo celular bem sucedida ^10. Unravelling os mecanismos subjacentes ao funcionamento deste complexo de enzima ligada à membrana na saúde e na doença pode permitir o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e estratégias terapêuticas avançadas. Em um estudo recente, verificou-se que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria na / (mitose) fase M (Gap 2) G2 e fosforila subunidades CI para aumentar a produção de energia mitocondrial, potencialmente, para compensar o aumento das necessidades energéticas das células durante celular ciclo de ^11. Aqui nós showcase procedimentos experimentais e estratégias que podem ser usados ​​para estudar a translocação mitocondrial de cinases em contrário nucleares / citoplasmáticas, os seus substratos mitocondriais, bem como consequências funcionais da sua localização mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como um exemplo.

A constatação de que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria, quando necessário solicitado os estudos de sobre-expressão específicas de mitocôndrias e knockdown deste complexo. Para conseguir a expressão específica de mitocôndrias de proteínas, pode-se adicionar uma sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) no N-terminal da proteína de interesse. Mitocôndrias alvo sequências permitem a ordenação das proteínas mitocondriais na mitocôndria onde eles residem normalmente ^12. Temos usado uma sequência de direccionamento 87 mitocôndrias de base derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) e clonado-lo em Green Fluorescent Protein (GFP) tagged CyclinB1 ou vermelho fluorescenteProtein (RFP) tagged Cdk1 contendo plasmídeos no quadro. Este método permitiu-nos atingir CyclinB1 e Cdk1 na mitocôndria, que alterou a expressão mitocondrial destas proteínas sem afetar sua piscina nuclear. Por fluorescente marcação destas proteínas, fomos capazes de monitorar a sua localização em tempo real. Da mesma forma, nós introduzimos MTS em um plasmídeo contendo marcado-RFP dominante negativo Cdk1, o que nos permitiu bater especificamente para baixo a expressão mitocondrial e funções de Cdk1. É essencial para distinguir entre as funções mitocondriais e nucleares das quinases que têm localizações dupla como Cdk1. Engenharia MTS para o N-terminal destas cinases funcionais duais oferece uma grande estratégia que é fácil de ser utilizado e eficaz.

Desde Cdk1 é uma quinase do ciclo celular, que é fundamental para determinar a progressão do ciclo celular quando Cdk1 está localizada dentro da mitocôndria. Para conseguir isso, nós utilizamos uma nova metod para monitorizar o conteúdo em ADN em células. Os métodos tradicionais incluem a utilização de BrdU (bromodesoxiuridina), um análogo da timidina sintética, que incorpora-se no ADN sintetizado de novo durante a fase S do ciclo celular para substituir timidina. Em seguida, as células que estão a replicar o seu DNA activamente pode ser detectada utilizando anticorpos anti-BrdU. Uma desvantagem deste método é que ele exige a desnaturação de ADN para fornecer acesso para o anticorpo BrdU por métodos agressivos como tratamento com ácido ou calor, o que pode resultar em inconsistência entre os resultados ^13,14. Alternativamente, utilizou-se uma abordagem semelhante para monitorar as células que se dividem activamente com um análogo da timidina diferente, EdU. detecção EdU não requer desnaturação DNA dura como o tratamento detergente suave permite que o reagente de detecção para acessar o EdU no DNA recém-sintetizado. O método EdU provou ser mais confiável, consistente e com potencial para a análise de alto rendimento ^15.

Finalmente, to determinar os substratos mitocondriais de Cdk1, usamos uma ferramenta proteômica chamado 2D DIGE, que é uma versão avançada do eletroforese em gel clássico bidimensional. Electroforese bidimensional separa as proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na primeira dimensão e o peso molecular na segunda. Uma vez que as modificações pós-traducionais, tais como fosforilação afectar o ponto isoeléctrico e o peso molecular das proteínas, géis 2D podem detectar diferenças entre os estados de fosforilação de proteínas nas amostras diferentes. O tamanho (área e intensidade) de proteína acaba alterações com o nível de expressão de proteínas, permitindo a comparação quantitativa entre múltiplas amostras. Usando este método, fomos capazes de diferenciar as proteínas fosforiladas no tipo selvagem contra células que expressam CDK1 segmentada por mitocôndrias mutantes. Os spots de proteínas específicas que mostraram no tipo selvagem, mas estavam faltando no mutante preparação Cdk1 segmentada por mitocôndrias foram isoladas eidentificado através de espectrometria de massa.

Nos geles 2D tradicionais, corantes de trifenilmetano são utilizados para visualizar as proteínas no gel. 2D DIGE usa rótulos proteína fluorescente com um efeito mínimo sobre a mobilidade eletroforética de proteínas. Diferentes amostras de proteínas podem ser marcados com diferentes corantes fluorescentes, misturados entre si e separadas por os géis idênticos, permitindo que a co-electroforese de amostras múltiplas com uma única gel ^16. Isto minimiza as variações de gel-a-gel, o que é um problema crítico nos estudos proteómica à base de gel.

Protocolo

1. Isolamento de mitocôndrias de células de cultura

1. Preparação de tampão de isolamento de células (IBC) Tampão
   1. Prepare 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N-morfolino) propanossulfónico): Dissolver 12,1 g de Tris em 800 ml de água destilada, ajustar o pH a 7,4 usando MOPS pó, adicionar água destilada até um total volume de 1 L e armazenar a 4 ^o C.
   2. Prepare a 0,1 M de EGTA (etileno glicol bis (éter 2-aminoetil) tetra-acético) / Tris: Dissolve-se 38,1 g de EGTA em 800 ml de água destilada, ajustar o pH para 7,4 utilizando Tris pó, adicionar água destilada até um volume total de 1 L e armazenar a 4 ^° C.
   3. Prepare 1 M de sacarose: Dissolver 34,23 g de sacarose em 100 ml de água destilada, fazer 20 ml alíquotas e armazenar a -20 ^o C.
   4. Preparar tampão _c IB: preparar 100 ml de tampão de IB _C por adição de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS e 1 ml de 0,1 M de EGTA / Tris a 20 ml; De 1 M de sacarose. Adiciona-se água destilada até um volume total de 100 ml. Ajustar o pH para 7,4.
2. Preparação de tampão de lise celular
   1. Preparar o tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM (etileno diamino tetra-acético), 1 mM de EGTA, 1% de Triton-X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β- glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio. Adicionar inibidores de proteinase 1 ug / mL de leupeptina e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) imediatamente antes da utilização.
3. Isolamento de mitocôndrias
   1. Colheita 3 x 10 ⁷ células com gelo frio 1x PBS (Tampão fosfato salino), pH 7,4 e centrifugação as células a 600 xg durante 10 minutos a 4 ^o C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão _c IB gelada.
   2. Homogeneizar as células usando um moedor de tecido de vidro / vidro por cerca de 10 min. Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min a 4 ^o C. Para mitocôndrias funcionais, usar acoplamento vidro / Teflon, pois é menos prejudicial para as mitocôndrias do que o triturador de tecidos de vidro / vidro.
   3. Recolhe-se o sobrenadante para tubos de 1,5 ml e centrifugar a 7000 xg durante 10 minutos a 4 ^o C. Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml e guardar a proteína citosol.
   4. Lava-se a pelete (mitocôndria) duas vezes com tampão de IB _c arrefecida em gelo de 200 mL e centrifugação a 7000 xg durante 10 minutos a 4 ^o C.
   5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de lise de células e usar imediatamente ou armazenar a -80 ^° C para uso futuro. Se forem necessários mitocôndrias funcionais, re-suspender o sedimento no tampão remanescente após o descarte do sobrenadante. Diluir a fracção mitocondrial ainda pode resultar na perda da função das mitocôndrias. Armazenar no gelo e utilize a preparação em 1-3 horas para obter melhores resultados.
   6. Sonicar a pelota foi ressuspensa por trinta rajadas 3-sec numabanho de gelo, centrifugar a 10000 xg durante 5 min, e guardar o sobrenadante como a fracção mitocondrial.

2. Co-imunocoramento Cdk1, CyclinB1 e COXIV, uma proteína mitocondrial Residente

1. Cresça 5 x 10 ⁴ células em lamelas em placas de 24 cavidades O / N ou até 70% de confluência. Aspirar o meio e lava-se as células duas vezes com 500 mL de gelo frio 1 x PBS, pH 7,4.
2. Fixar as células com 500 uL gelada 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 10 min. Aspirar a solução fixadora e lavam as células com 500 ul de 1 x PBS 3 vezes, 5 minutos cada, com agitação suave à temperatura ambiente.
3. Permeabilizar as células com 0,2% de Triton X-100 em 500 ul de PBS durante 5 min à TA. Aspirar a solução e lava-se as células 3 vezes, 5 minutos cada um com 500 ul de PBS. Adicionar a solução de bloqueio (500 ul, 1% de BSA (Albumina de Soro Bovino) em PBS contendo 1% de Tween 20) durante 30 min à TA.
4. Dilui-se os anticorpos primários 1: 250 (v: v) em 5001; L de solução bloqueadora e incubar as células com anticorpos primários desejados levantadas em espécies diferentes para evitar a sinalização transversal (CyclinB1 (rato) e COXIV (coelho) ou Cdk1 (rato) e COXIV (coelho) à temperatura ambiente durante 30 - 60 min ou O / N a 4 ^o C.
5. Lavam-se as lamelas com 500 ul de 1 x PBS 3 vezes, 5 min cada, e depois incubar com anticorpo secundário diluído 1: 1000 em 500 ul de solução à TA durante 1 h, seguida de lavagem com 500 ul de PBS 3 vezes, 5 min cada bloqueio.
6. Montar as lamelas com 20 l de solução de montagem anti-fade e selar as lâminas com unha polonês. Imagem os slides usando um microscópio de fluorescência imediatamente ou manter no escuro a 4 ^° C para 1 - 2 semanas.

3. Extracção de sódio Carbonato de mitocôndrias intactas

1. Crescer aproximadamente 20 x 10 ⁷ células, colheita, lavar uma vez com PBS e isolar mitocôndrias como descrito na seção 1. mitocondrial Divide isola em dois parTS antes da última centrifugação para sedimentar as mitocôndrias (antes do passo 1.3.4); salvo meio para ser utilizado como a mitocôndria total (passo 3.2), utilizar a outra metade para a extracção de carbonato de sódio (3,3-3,6 seguintes passos) para separar as proteínas ligadas membrana e solúveis.
2. Lisar as mitocôndrias total de aglomerados com 30 ul de tampão de lise celular e armazenar o lisado a -80 ^° C até serem usadas em imunotransferência.
3. Adicionar 250 uL de 0,1 M de Na ₂ CO ₃ (carbonato de sódio), pH 11,0, para a outra metade do sedimento mitocondrial e incubar em gelo durante 30 min.
4. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.5. Lyse o sedimento utilizando 30 ul de tampão de lise celular e sonicado como no passo 1.3.6. Armazenar a -80 ^° C até ser usado em immunoblotting.
5. Adicionar um volume igual de 20% de ácido tricloroacético acabado de fazer (TCA) para o sobrenadante, para precipitar as proteínas e manter em gelo durante 30 min.
6. CentrifUGE a 15000 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante, dissolve-se o sedimento em 80 ul de tampão de lise celular e armazenar a -80 ^° C até serem usadas em imunotransferência.

4. Separação de interior e exterior membranas das mitocôndrias (Isolamento de Mitoplasts)

1. Crescer aproximadamente 20 x 10 ⁷ células, colheita, lavar uma vez com PBS e isolar mitocôndrias tal como descrito na secção 1. Separam-se as fracções mitocondriais em 10 porções iguais antes da última centrifugação para sedimentar as mitocôndrias (antes do passo 1.3.4).
2. Dissolve-se cada pelete em 30 ul da concentração indicada de tampão de sacarose hipotónico (1 mM de EDTA, 10 mM de MOPS / KOH (hidróxido de potássio), pH 7,2; concentração de sacarose que varia 25-200 mM) com ou sem 50 ug / ml de tripsina ( ver Tabela 1) e incubar 30 minutos em gelo.
3. Adicionar 3 mL de PMSF 10 mM (para atingir uma concentração final de 1 mM de PMSF), para a tripsina contendo frascos T para pararele digestão com tripsina e incubar em gelo durante 10 min.
4. Centrifuga-se a 14000 xg, a 4 ^° C durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, lisar o granulado em 30 ul de tampão de lise celular, sonicado como no passo 1.3.6, e armazenar a -80 ^o C.

5. Construção de mitocôndrias-alvo GFP / CyclinB1 marcado-RFP / Cdk1 vetores e confirmação da sua localização mitocondrial

1. Clonar as mitocôndrias sequência de direccionamento (MTS; derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) entre os nucleótidos 76 - 161) na moldura para o terminal N de GFP ou RFP nos locais NheI e BamHI do pEGFP-N1 ou pERFP vectores -N1 utilizando técnicas convencionais de clonagem molecular.
2. Ao conceber iniciadores de PCR para os genes CyclinB1 e CDK1, adicionar locais BamHI de reconhecimento de enzimas de restrição (negrito) para a 5 'dos ​​iniciadores de PCR.
   Adiante Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Reverter Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   Adiante CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   Reverter CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
3. Amplificar os genes CDK1 e CyclinB1 utilizando estes iniciadores seguindo as técnicas convencionais. Digerir o produto de PCR com 1 ul de enzima de restrição BamHI a 37 ° C durante 2 h. Executar os produtos de digestão num gel de agarose 1%. Usando uma lâmina de barbear, cortar os fragmentos de ADN -sized correctas para fora e purifica-se o ADN a partir do gel utilizando um kit de extracção de gel.
4. Digerir 1 ug de MTS-pEGFP-N1 e plasmídeos MTS-pERFP-N1 com 1 ul de enzima BamHI a 37 ° C durante 2 h. Adicionar 1 ml de Calf-IntesTiNAl fosfatase alcalina (CIP) durante 30 min a 37 ° C. Executar os produtos de digestão num gel de agarose 1% e purifica-se os plasmídeos lineares de gel como no passo 5.3.
5. Defina-se uma reacção de ligação por adição de 1 ul de plasmídeo a partir do Passo 5.4 e 5 ul de Cdk1 ou CyclinB1 do Passo 5.3 a 3 ul de tampão ligase, 0,5 ul de ligase de T4, e 20,5 uL de _dH2O Incubar O / N a 4 ° C.
6. Transformar Escherichia coli DH5a competentes células com 10 uL da mistura de ligação de acordo com técnicas padrão e crescer as bactérias em 10 mg / ml de canamicina contendo agar LB placas de O / N a 37 ° C para se obter colónias.
7. Escolher uma colónia de O / N placas crescidos utilizando uma ponta de pipeta estéril, insira a ponta a 5 ml de canamicina-LB contendo tubo e incubar O / N. Isolar o plasmídeo utilizando kits miniprep de acordo com o protocolo do fabricante, e a sequência do plasmídeo usando técnicas padrão.
8. Transfectar exponencialmente crescente MCF1Células 0A (1,5 x 10 ⁴ células semeadas em placas de 96 poços) com MTS-Cdk1-RFP ou MTS-CyclinB1-GFP plasmídeos a partir do Passo 5.7, preparando uma razão de reagente de plasmídeo / transfecção de 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 ul) no sérica de 100 mL e meio sem antibiótico.
9. Incubar as células em plasmídeo mistura / reagente durante 48 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ com controlo de humidade (5% de _CO2, 95% de humidade relativa).
10. Preparar solução de reserva 1 mM de corantes fluorescentes vermelho e verde mitocondriais por dissolução de 50 g de pó em 100 ul de DMSO. Dilui-se a soluções de 1: 400 em PBS 1X para se obter 2,5 uM soluções de trabalho. As soluções de reserva pode ser armazenado a -20 ° C durante um ano.
11. Misturar 2 ul de 2,5 uM de corante vermelho com 98 ul de meio de cultura para preparar uma concentração final de 50 nM.
12. Substituir o meio de cultura de células de CyclinB1-GFP rolamento células MCF10A (gerados no passo 5.8) com corante vermelho contendo meio durante 2 min. Repita omesmo procedimento com corante verde para células MCF10A rolamento Cdk1-RFP.
13. Lave duas vezes com 100 mL 1 x PBS para se livrar da solução de coloração em excesso, adicione 100 mL 1x PBS à placa de 96 poços.
14. Visualizar a mitocôndria e CyclinB1-GFP (por excitação a 488 nm e emissão a 494-536 nm) e Cdk1-RFP (excitação por 560 nm e emissão a 565-620 nm) em placas de 96 poços sob o microscópio de fluorescência a 40x de ampliação.

6. Identificação de fosforiladas Proteínas diferencialmente através 2D-DIGE

1. Preparação de amostra
   1. Isolar mitocôndrias e lisar frações mitocondriais como no Passo 1.3. Adicionar um volume igual de 20% de TCA (ácido tricloroacético em água) a cada amostra e vortex durante 15 seg. Incubar as amostras em gelo durante 30 min como as proteínas precipitar para fora da solução.
   2. Centrifugar as amostras a 9300 xg, a 4 ° C durante 5 minutos, remover o sobrenadante e adicionar 60 ul de acetona fria (100%) seguido porcentrifugação a 9300 xg, a 4 ° C durante 5 min.
   3. Repetir o passo de lavagem com acetona (Passo 6.1.2) mais uma hora, remover o sobrenadante e suspender novamente as amostras em 50 uL de tampão de rotulagem DIGE (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
2. Prepare o corantes fluorescentes
   1. Preparar a solução de estoque: Dissolve-se corantes (5 nmol) em 5 mL de formamida de dimetilo fresco (DMF) a uma concentração final de 1 nmol / l. Guardar a solução estoque de corantes à temperatura de -20 ^° C até à sua utilização por alguns meses.
   2. Preparar solução de trabalho: Permitir corantes para definir à TA durante 5 min. Dilui-se 1 ul de corante com 4 mL de DMF a uma concentração final de 200 pmoles / ul. Manter em gelo durante o uso. Nota: A solução de trabalho pode ser mantida a -20 ^° C durante 3 semanas.
3. Proteínas de etiqueta
   1. Misturar 1 uL de solução de trabalho de corante por 12,5 mg de proteína. Intensificar conforme necessário. Para os padrões combinados, adicione 61; L de solução de trabalho Cy2 a 300 ug de proteína reunidas.
   2. Vortex durante 30 segundos e centrifugar a 4 ° C durante 30 segundos a 12.000 x g. Incubar em gelo no escuro durante 30 min. Pare a rotulagem através da adição de 1 ml de lisina 10 mM por 1 mL de solução de trabalho utilizados. Misturar bem e incubar em gelo no escuro durante 10 min.
   3. Piscina rotulados individualmente amostras e misturar-se com tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, azul de bromofenol). O volume total será de 125 ul.
   4. amostras vortex durante 30 seg e permitir que as amostras para definir a TA durante 30 min. Carga de 125 l de amostras sobre sete centímetros pH 4-9, focagem isoeléctrica (IEF) Tiras.
4. Electroforese primeira dimensão
   1. Coloque os titulares Strip (caixões) na placa de eletrodo, certificando-se os titulares de tiras são completamente limpos e secos. Pipetar 125 amostras ul em um caixão, espalhando uniformemente em todo o caixão.
   2. usando tweezers, pegar a tira IEF, retire cuidadosamente a tampa protectora de plástico e coloque-o (lado gel para baixo) no tampão caixão / reidratação. Evite bolhas de interceptação. Lentamente encher caixão (1 - 1,5 ml) com óleo mineral e colocar o caixão cobre sobre os caixões.
   3. Comece a focagem isoeléctrica seguindo o protocolo da Tabela 2:
      Nota: Uma vez que o prazo é completa, as tiras podem ser armazenadas em tubos de plástico a -80 ^° C ou diretamente mudou-se para o equilíbrio e a segunda dimensão.
5. Segunda dimensão - dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida de electroforese (SDS-PAGE)
   1. Equilíbrio
      1. Descongelar tampão de equilíbrio de SDS (8 ml por tira, 6 M de ureia, 30% glicerol, 2% SDS). Pesar ditiotreitol (DTT; 10 mg de DTT por 1 ml de tampão de equilíbrio SDS). Dissolve-se TDT em 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS.
      2. Pesar IAA (iodoacetamida, 25 mg de IAA por 1 ml de tampão de equilíbrio SDS).Dissolver IAA em 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS.
      3. Melt 1 ml de solução de agarose de vedação em um banho de água para uso posterior.
      4. Se as tiras foram congelados, permitir-lhes para descongelar completamente. Coloque tiras lado gel-se na bandeja de reswelling. Adicionar 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS com DTT a cada tira e incubar durante 15 min com agitação suave.
      5. Deitar fora todo o tampão de equilíbrio SDS com a TDT. Adicionar 4 ml de tampão de equilíbrio com IAA SDS a cada tira e incubar durante mais 15 min com agitação suave. Após o equilíbrio com o tampão de IAA, derrame do tampão de equilíbrio de SDS.
   2. SDS-PAGE
      1. Desembrulhar mini-géis, retire o pente e lavar o gel e os poços com DDH ₂ O. Remover a fita branca na parte inferior do gel antes de executar. Orientar a tira no gel corretamente, orientação gel é fundamental para o corte local.
      2. Coloque o plano gel no contador com a pequena placa de cima e de cima gel de frente experimenter. Colocar a tira sobre a placa de extremidade de altura com anódica (++ terminar com o código de barras) voltado para o lado esquerdo do gel. Usando uma régua, empurrar lentamente a tira para baixo na superfície gel. Evite bolhas de interceptação entre a tira eo gel. Suportar o gel em uma posição placa de vidro.
      3. Adicionar 1 ml de solução de agarose quente para selagem da abertura da cassete. Certifique-se de todas as bolhas de ar são pressionadas para fora usando uma régua plana. Montar o aparelho de funcionar e o gel a uma constante de 125 V durante 90 min.
      4. Quando o gel termina a execução, coloque o gel em um imager biomolecular com 2 ml DDH ₂ O e digitalizar o gel em modo de aquisição de fluorescência com 635 nm laser de excitação e 665 filtro de emissão nm.
   3. fosfoproteína coloração
      1. Corrigir o gel com 50% de metanol e 10% de mistura de ácido acético (10 ml) durante 30 min, duas vezes. Lava-se com 10 ml de água durante 10 minutos e três vezes com 10 ml de mancha fosfoproteína mancha por 60 - 90 min, seguido peladescoloração com 10 ml destain solução para 30 min três vezes.
      2. Lavar com 10 ml de água a 5 min duas vezes e imagem do gel com um scanner de gel de laser a 532 nm / 560 nm excitação / emissão.
   4. Proteína Digestão e Identificação
      1. Especial de consumo de todos os pontos de proteínas diferencialmente expressas a partir do gel em poços de microplacas utilizando um local-robot de recolha de acordo com as especificações do fabricante, e adicionar bicarbonato de amónio 100 mM (2 mL) durante 1 hora à TA a Destain os pedaços de gel. Desidratar com 2 ml de 100% de acetonitrilo lavar duas vezes e seco num concentrador de vácuo durante 30 min.
      2. Re-hidratar os pedaços de gel com 100 ul de 13 ng / mL de tripsina porcina modificado em bicarbonato de amónio 50 mM durante 16 horas a 37 ° C. Recolhe-se os sobrenadantes e extrai-se ainda mais as proteínas com 100 ul de ácido trifluoroacético a 5% em 50% de acetonitrilo durante 30 min.
      3. Concentra-se os péptidos para baixo para 5 ul por centrifugação de vácuo concentrador e analisar com Matrix Assisted Laser dessorção de ionização - Time of Flight - tandem análise de espectrometria de massa (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

7. In Vitro Ensaio de Quinase

1. Preparação de Substratos
   1. Sub-clone de complexo I (CI) subunidades (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, e NDUFA12), que são identificados como alvos diferencialmente fosforilados CDK1, em pGEX-5X-1 para gerar vector de glutationa-S-transferase (GST) tagged plasmídeos de expressão bacteriana ^11. Purifica-se subunidades CI Utilizando as colunas de afinidade de glutationa alta seguindo o protocolo abaixo.
      1. Cultura de GST-tagged subunidade CI contendo Escherichia coli estirpe BL-21 em caldo com 50 ug / ml de ampicilina num agitador a 37 ^° C de Luria-Bertani (LB) até uma densidade óptica (DO) de 0,6 foi atingido. Adicionar isopropil-BD-tio-galactopiranósido (IPTG) ao cultoure, a uma concentração final de 0,1 mM, e incubar durante mais 3 horas.
      2. Centrifuga-se a 600 xg durante 10 minutos para recolher as bactérias e re-suspensão em 5 ml de tampão 1 x PBS contendo 5 mM de DTT, 1 x cocktail inibidor de proteinase, e 0,1% de lisozima. Lisar as células por sonicação durante 5 s vinte rajadas, e remover os restos celulares por centrifugação a 600 xg durante 10 min.
      3. Recolhe-se o sobrenadante e incubar com 4B de glutationa-agarose em uma proporção em volume de 4: 1 (sobrenadante: grânulo) durante 1 h à TA.
      4. Elui-se as proteínas de fusão com GST a partir dos grânulos com 3 ml de tampão de glutationa de eluição (10 mM de glutationa reduzida em mM Tris-HCl, pH 8,0 a 50) e sujeitar as proteínas eluidas a diálise em tubo de membrana porosa molecular (cut-off de peso molecular 12 -14 quilodaltons) com EDTA 1 x PBS / 1 mM. Armazenar as proteínas purificadas a - 80 ^o C.
2. Cdk1 Kinase Assay
   1. Antes de iniciar o rabo quinaseay, definir blocos de aquecimento a 30 ° C e 100 ° C. Thaw CyclinB1 / complexo comercial enzima Cdk1 e substratos no gelo.
   2. Preparar a mistura de reacção em gelo. Desde ³² P ATP isótopo está envolvido, preparar todas as misturas de reacção em tubos de 1,5 ml da amostra com tampas de rosca contendo um anel O para evitar a disseminação da radioatividade.
      Cuidado: Siga as regras de protecção de material radioativo. Use um de 8 mm de espessura Plexiglas Blindagem e de trabalho, pelo menos, à distância de um braço. Limpe qualquer área contaminada com água.
   3. Preparar um tampão de reacção de 30 ul contendo 1 x tampão de Cdk1 (Tris-HCl 50, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM de ATP frio, 0,1 uCi ^{de 32} P ATP, 2 unidades de CyclinB1 / Cdk1 e 6 ug de proteína de substrato. Ajuste o volume para 30 mL com DDH ₂ O. Por reacção de controlo positiva, substituir o substrato com 0,01 mM histona H1, um CyclinB1 / substrato Cdk1 bem conhecido.
      1. Para contro negativoreacções l, (1) substituir o substrato, com apenas proteína GST e (2) substituir o substrato com 0,01 mM de Histona H1 + 0,5 fiM RO-3306, um inibidor selectivo Cdk1.
   4. Misturar bem com pipeta e centrifugar para levar o líquido para o fundo do tubo, minimizando o risco de contaminação. Incubar a 30 ° C durante 60 min.
   5. Adicionar 6 ul de tampão de amostra de SDS 5x para parar a reacção e desnaturar a 100 ^o C durante 10 min. Executar amostras em gel de SDS-PAGE a 10% a 160 V durante 2 horas, ou até a frente do corante atingiu a extremidade do gel. Transferir gel num papel de cromatografia e embrulhe com filme plástico.
      Atenção: Todos os líquidos em contacto com radioisótopos devem ser tratados como resíduos radioactivos e eliminados de um garrafão de 5 litros poli fornecida pelos serviços de saúde e de segurança ambiental conforme as diretrizes institucionais.
   6. Expor o gel a película de raios X durante 1 dia ou até uma semana à temperatura de -20 ^° C, dependendo da actividade específica do radioisótopo usadoe a enzima.

8. mutagénese dirigida para gerar Dominante Cdk1 Negativo (D146N)

1. primers projeto mutagênese; dois iniciadores, complementares uns aos outros, contendo o sítio mutante (L será substituído por um nucleótido de codificar para N em vez de D aminoácido) flanqueada por 20 bases de cada lado ^11.
2. Prepara-se uma 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) de uma mistura contendo 1x tampão de reacção, dNTP 2,5 mM, 10 uM de iniciadores (tanto para a frente e para trás), 40 ng do modelo, e ddH ₂ O. Adicionar 2,5 L de polimerase de ADN na reacção.
3. Executar o seguinte programa de PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 seg, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 ciclos (Nota: 68 ° C tempo de incubação é determinado pelo tamanho do DNA 1 min / kb é necessário para ADN ≤ 10 kB para o ADN maior, 2 min / kb, mais 10 segundos por ciclo..). Siga pela 68 ° C 7 min e mantenha a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
4. Adicionar2 ul da enzima de restrição Dpnl (10 U / ul) e 5,7 ul de tampão Dpnl, misturar bem com toque suave com o dedo e incubar a reacção a 37 ^° C durante 1 h.
5. Transferir 10 uL Dpnl-tratados produtos de PCR em 50 ul de células competentes DH5a para transformação. Incubar em gelo durante 30 min, seguido por 45 segundos de choque térmico a 42 ^° C e 5 min em gelo. Adicionar 500 mL de LB e agitar a 37 ^° C durante 1 hora antes do plaqueamento em placas de LB-agar. Incubar O / N a 37 ^o C.
6. Escolha uma colônia do O / N crescido placas de agar utilizando uma ponta de pipeta amarela estéril, gota a ponta para um tubo contendo 5 ml de LB, e crescer O / N em um C shaker 37 ^o. Isolar o plasmídeo utilizando um kit de miniprep e a sequência do plasmídeo para confirmar a mutação de acordo com o protocolo do fabricante.

9. Determinação da Fase do Ciclo Celular comprimentos com EdU Ensaio de Incorporação

1. Separação celular
   1. Transfect 2 x 10 ⁵ células com vectores indicados (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-RFP ou MTS-Cdk1-DN-RFP) numa placa de 6 poços utilizando 1: 2 (w: v , 2,5 g: 5 ul) proporção de DNA: Transfection Reagent mistura preparada em 2,5 ml sérica e antibiótico meios de cultura livre para 48 horas. células de ordenação ao vivo expressando estavelmente as proteínas CyclinB1-GFP marcado Cdk1 e marcou-RFP através de citometria de fluxo.
      1. Lavar as células com 1 x PBS, adicionar 100 uL de tripsina para o prato e incubar a 37 ^° C durante 5 min. Adicionar 2 ml de meio de cultura para recolher as células e passá-los através de um filtro de 70 | iM para gerar uma suspensão de célula única. Lava-se a suspensão de células individuais com 500 ul de 1% de soro fetal de vitela em PBS (FCS / PBS) antes de colocá-los no citómetro de fluxo.
      2. Configurar os parâmetros de classificação seguintes protocolos estabelecidos ¹⁸ gating para células duplamente positivas coradas com ambos GFP e RFP. Recolher as células ordenadas saindo do citômetro em um tubo contaimédio e cultura de células ning usar essas células para análise da progressão do ciclo celular com rotulagem EdU pulse-chase como no protocolo 9.2.
2. Medição da duração do ciclo celular utilizando o ensaio de citometria de fluxo EdU Etiquetagem
   1. Semear as células classificados em placas de 6 poços a uma densidade de 2,5 x 10 ⁵ células por poço e cultura O / N a 37 ^° C numa incubadora com CO _2. Adicionar EdU para o meio de cultura a uma concentração final de 25 uM. Incubar a 37 ^° C numa incubadora de CO ₂ durante 1 h.
   2. Lavar as células com 1% de BSA em 500 ul de PBS e recolhê-las em um tubo de 1,5 mL em intervalos de 2 horas para um total de 10 - 12 h.
   3. centrifugar células a 350 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante. Desalojar o sedimento através da adição de 100 ul de solução de fixação (fornecida pelo fabricante, com o kit de marcação de EdU) durante 15 min à temperatura ambiente e misture bem.
   4. Lavar as células com 1 ml de 1% de BSA em PBS três vezes. corrigir océlulas de novo com 0,5 ml de etanol a 70% O / N a 4 ^o C.
      Nota: fixação Etanol é fundamental para extinguir a fluorescência da GFP / RFP interna devido à expressão da proteína recombinante marcado.
   5. Centrifugar as células novamente em 350 xg durante 5 min e lava-se a pelete com 1 ml de 1% de BSA em PBS uma vez. Re-suspender as células em 1 ml de tampão de permeabilização (0,1% de Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml de RNase A em PBS) durante 20 min à TA.
   6. Lavar as células com 1 ml de 1% de BSA em PBS uma vez. Adicionar 0,5 ml de mistura de reacção em cada tubo e misturar bem. Incubar mistura reaccional à TA durante 30 min no escuro.
   7. Lava-se com 1 ml de BSA a 1% em PBS e uma vez com ADN mancha 50 ug / mL de iodeto de propídio (PI) em 1 ml de 1% de BSA em PBS.
   8. Analisar as células por citometria de fluxo a seguir a população EDU-positiva. gráfico de dispersão de pontos presente de células EDU-rotulados coradas para conteúdo de DNA (coloração PI, eixo X) e Edu (Alexa 647 de coloração, eixo Y).
      1. Use canal APC para Alexa647-EDU utilizando um filtro de passagem de banda 670/30 com todos os presentes luz inferior a 685 nm atingir esse filtro; e ficoeritrina (PE) para o canal de PI com um filtro passa-banda de 581/15 em frente do mesmo com toda a luz presente menos do que 600 nm atingir esse filtro.
      2. Insira as primeiras células do tubo contendo na citometria de fluxo e usar uma estratégia de gating padrão para aquisição: Lote FSC-Area X SSC-área para a morfologia seguido de PI (canal PE) X Alexa647-EDU (canal APC) para a coloração celular. Gravar dados para todos os tubos, um por um aquisição de 10.000 eventos por amostra.
      3. Determinar a distribuição de fases do ciclo celular das células e comprimentos de fase utilizando um software de análise de citometria de fluxo de dados de acordo com protocolos estabelecidos ^11,30.

Resultados

Localização sub-mitocondrial de CyclinB1 e Cdk1

extracção de carbonato de sódio é usado para determinar se uma proteína está localizada no interior da mitocôndria ou na superfície exterior, ou seja, da membrana externa. Uma vez que uma proteína é mostrada para localizar dentro da mitocôndria, nova determinação da localização sub-mitocondrial pode ser feita através de mitoplasting combinado co...

Discussão

Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem ^21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956