JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Resumen

La conversión directa de los fibroblastos cardíacos (CFS) en cardiomiocitos inducidos (ICMS) tiene un gran potencial para la medicina regenerativa al ofrecer estrategias alternativas para el tratamiento de enfermedades del corazón. Esta conversión se ha logrado mediante la expresión forzada de los factores definidos, tales como Gata4 (G), MEF2C (M) y Tbx5 (T). Tradicionalmente, los ICMs son generados por un cóctel de virus que expresan estos factores individuales. Sin embargo, la reprogramación de la eficiencia es relativamente baja y la mayor parte de la in vitro G, M, T-transduced fibroblastos no se vuelven totalmente reprogramados, lo que dificulta el estudio de los mecanismos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que la estequiometría de G, M, T es crucial para una eficiente reprogramación iCM. Una estequiometría óptima de G, M, T con un alto nivel relativo de M y bajos niveles de G y T obtenidos mediante el uso de nuestro vector policistrónico MGT (en lo sucesivo referido como MGT) aumentó significativamente la eficiencia de reprogramación y mejora de la calidad iCM in vitro. Aquí le ofrecemos una descripción detallada de la metodología utilizada para generar ICMS con constructo MGT de fibroblastos cardíacos. El aislamiento de los fibroblastos cardíacos, generación de virus para la reprogramación y la evaluación del proceso de reprogramación también se incluyen para proporcionar una plataforma para la generación eficiente y reproducible de ICMS.

Introducción

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.

Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31.

Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

El protocolo descrito aquí utiliza ratones recién nacidos. Cuidado de los animales y los experimentos se realizan de acuerdo con los lineamientos establecidos por la División de Laboratorio de Medicina Animal (DLAM) en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill.

1. Preparación de tampones y Medios de Comunicación

  1. Preparar fibroblastos (FB) medio: Suplemento de 500 ml de medio IMDM con 100 ml de suero fetal bovino (FBS) y 6 ml de penicilina / estreptomicina.
  2. Prepare medio iCM: Suplemento de 400 ml de medio DMEM con 100 ml de medio M199 y 50 ml de FBS.
  3. Preparar medio B27: Suplemento 490 ml RPMI 1640 los medios de comunicación con 10 ml B27 medios.
  4. Preparar medio de cultivo Plat-E: Suplemento 500 ml DMEM medios con 50 ml de FBS, 5 ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml aminoácidos no esenciales.
  5. Preparar medio de transfección Plat-E: Suplemento 500 ml de DMEM los medios de comunicación con 50 ml de FBS y 5 ml de aminoácidos no esenciales.
  6. Prepare gelatina revestido placa de 24 pocillos: Añadir solución de gelatina 0,5 ml 0,1% a un pocillo de placa de 24 pocillos, se incuba a 37 ° C durante al menos 10 minutos y aspirado de la derecha antes de su uso.
  7. Preparar tampón FACS etiquetado: Suplemento 500 ml de DPBS con 10 ml de FBS y 2 ml de EDTA (0,5 M) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Pasar a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
  8. Preparar tampón MACS de clasificación: Suplemento 500 ml de DPBS con 2,5 g de BSA y 2 ml de EDTA (0,5 M) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Pasar a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
  9. Preparar tampón HBS 2x para la transfección: Suplemento 500 ml de tampón HEPES (50 mM) con NaCl 280 mM (8,1816 g), mM KCl 10 (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM de glucosa (1,08096 g ). Añadir alrededor de 650 l 10 N NaOH para ajustar el pH a 7.5 a 7.12. Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras de poro y se almacena a 4 ° C.
  10. Preparar M CaCl solución 2,5 2 para la transfección: Agregar 18,376 g de CaCl 2 a 50 ml ddH2O Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras de poro y se almacena a 4 ° C.
  11. Preparar ICC (inmunocitoquímica) Tampón de fijación: Añadir 5 ml de paraformaldehído (PFA, 32%) a 35 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 4%.
  12. Preparar tampón de permeabilización ICC: Añadir 0,1 ml de Triton 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 0,1%.
  13. Preparar tampón de bloqueo ICC: Añadir 5 g de albúmina de suero bovino (BSA) a 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 5%.
  14. Preparar tampón de tinción ICC: Añadir 1 g de BSA a 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 1%.

2. Generación de neonatales mouse cardíacos fibroblastos

  1. Generar fibroblastos cardíacos de método de cultivo de explante
    1. Clean neonatal αMHC-GFP ratón transgénico (P1 a P2) con etanol 75%. Corta la cabeza con unas tijeras estériles. A continuación, hacer una incisión horizontal desde debajo de una axila a la otra. Use un estérilfórceps romos y se inclinó para diseccionar el corazón y la colocan en un pocillo de la placa de 24 pocillos que contiene tampón PBS helado.
      1. Alternativamente, exprimir el corazón después de la incisión horizontal.
    2. Compruebe la expresión de GFP en el corazón por el microscopio de fluorescencia. Dado que la expresión de GFP es impulsado por el promotor αMHC que es un promotor específico cardíaco, el corazón de ratón transgénico debe estar en verde 15, mientras que el corazón negativo es tenue en cualquiera de fluorescencia.
    3. Tome 3-4 GFP corazones positivos en un pozo central placa de cultivo de 60 mm y picar en trozos pequeños de menos de 1 mm 3 en el tamaño de tijeras y pinzas estériles.
    4. Coloca 3-4 corazones picados en una sola placa de 10 cm con 2 ml de medio de FB. Deje que los tejidos se establecen durante 3 horas.
    5. Agregue lentamente 8 ml precalentado medios FB a los platos que contienen los tejidos del corazón. No moleste a los tejidos durante tres días.
    6. Vuelva a colocar los medios de comunicación cada tres días.
    7. El día 7, aspircomió el medio de cultivo y lavar las células con DPBS. Añadir 3 ml 0,05% de tripsina a cada placa y digerir a 37 ° C durante 5 min.
    8. Añadir 5 ml de medio de FB para saciar la tripsina. Separar suavemente las células con un raspador de células. Pipetear los medios de comunicación de arriba a abajo para disociar más mecánicamente el tejido.
    9. Recoger las células y filtrar a través de 40 micras coladores celulares para evitar la contaminación de fragmentos de tejido del corazón, y luego sedimentar las células mediante centrifugación a 200 xg durante 5 min.
    10. Lavar las células una vez con tampón MACS y las células están listas para la clasificación.
  2. Generar fibroblastos cardíacos de método de digestión enzimática
    1. Cosecha GFP corazones positivos como 2.1.1. Transferir todos los corazones en un plato de 10 cm con 10 ml de DPBS enfriado con hielo.
    2. Apriete ventrículos con pinzas estériles para quitar la sangre y enjuagar una vez con DPBS enfriado con hielo.
    3. Recorte los corazones de estar libre de otros tejidos y grasa.
    4. Corte cada corazón en aproximadamente 4 piezas que todavía están conectados vagamente.
    5. Si menos de 20 corazones, transfiera los corazones en un tubo cónico de 15 ml con 8 ml cálida 0,05% de tripsina-EDTA, y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
      1. Si hay 20-30 corazones, transferir los corazones en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml cálida 0,05% de tripsina-EDTA, y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
    6. Deseche la tripsina y añadir 5 ml (por menos de 20 corazones) o 10 ml (para 20-30 corazones) cálida colagenasa tipo II (0,5 mg / ml) en HBSS.
    7. Vortex el tubo de vórtice durante 1 minuto a un nivel de velocidad alrededor de 4 a 6 (si el líquido no se levante a la tapa, entonces la velocidad está muy bien).
    8. Incubar el tubo en 37 ° C baño de agua durante 3-5 minutos.
    9. Vortex el tubo durante 1 min.
    10. Sedimentos durante 1 minuto por gravedad hasta que los trozos de tejido se calmen, recoger el líquido en un nuevo tubo que contiene 5 ml de medio FB frío.
    11. Repita los pasos 2.2.6-2.2.10 3-5 veces.
    12. Combinar todas las colecciones mediante la filtración a través de filtro de células de 40 micrashacer suspensión de células individuales.
    13. Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    14. Resuspender las células en 10 ml de tampón MACS, y centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    15. Opcional: Si hay una gran cantidad de células sanguíneas, Resuspender las células con 1 ml de RBC tampón de lisis (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y EDTA 0,1 mM), mantener en hielo durante 1 min, luego se diluye con 10 ml MACS tampón y se centrifuga a 200 xg durante 5 min. Lavar una vez más con tampón MACS.
  3. Aislamiento de Thy1.2 + fibroblastos por MACS (magnético clasificación de células activadas)
    1. Determinar el número de células viables mediante tinción con azul de tripano.
      1. Tomar 10 células mu l a partir de la suspensión de células de 10 ml en el paso 2.2.14. Mezclar con solución de azul de 10 l 0,4% de tripano.
      2. Añadir la mezcla a un hemocitómetro. Deje reposar durante 3-5 minutos y luego examinar de inmediato con un microscopio. Las células muertas se tiñen en las células azules y viables son sin mancha.
      3. contar todas las células viables en cuatro cuadrados de 1 mm de esquina del hemocitómetro. Determinar el número de células viables: el recuento medio por metro cuadrado x 2 (factor de dilución) x 10 4 x 10 (volumen total de la suspensión celular).
    2. Por menos de 1 x 10 7 células, las células volver a suspender las microesferas con 10 l Thy1.2 en 90 l enfriaron tampón MACS. Añadir más cuentas proporcionalmente si hay más de 1 x 10 7 células. Mezclar bien e incubar en nevera (2-8 ° C) durante 30 minutos.
    3. Añadir 10 ml de tampón MACS y muestras giran a 200 xg durante 5 min; lavar una vez con tampón MACS 10 ml y centrifugar de nuevo.
    4. Traiga volumen de 2 ml en tampón MACS.
    5. Establecer un separador de MACS en el capó. Inserte una columna LS al separador. Aplicar 3 ml MACS buffer para la columna que se equilibren.
    6. Pasar la suspensión celular a través de la columna LS equilibrada.
    7. Lavar 3 veces con 2 ml de tampón MACS cada vez.
    8. Tome la columna de la LS fuera tque Separador y eluir 3 veces con 2 ml MACS amortiguan en un nuevo tubo de 50 ml.
    9. Girar a 200 xg durante 5 min.
    10. Resuspender las células en 10 ml de medio FB, cuentan las células y se siembran en placas a una densidad adecuada. Para fibroblastos generados por el método de cultivo de explante, la densidad de células de siembra podría ser alrededor de 2.3 x 10 4 células / pocillo de placa de 24 pocillos. Para fibroblastos generados por método de digestión enzimática, la densidad de las células podría ser alrededor de 5.4 x 10 4 células / pocillo de placa de 24 pocillos.

3. Generación de retrovirus para iCM Reprogramación

Nota: Realice los siguientes pasos en un Gabinete de Seguridad Biológica BSL2 en condiciones estériles. Se recomienda la eliminación adecuada de las células transfectadas, puntas de pipeta y tubos para evitar el riesgo de los riesgos ambientales y de salud.

  1. Mantener células Plat-E en Plat-E medio suplementado con 1 mg / ml de puromicina y 10 mg / ml blasticidin a 37 ° C con 5% de CO 2.
  2. El día 2, sustituir el medio por el medio de cultivo Plat-E carente puromicina y blasticidina.
  3. En el día 0, dividir celdas Plat-E en placas de 10 cm el día antes de la transfección en aproximadamente 4-5 x 10 6 células por placa. Las células deben ser ~ 80-90% de confluencia en el día de la transfección.
  4. El día 1, los medios de comunicación el cambio de cultura a los medios de transfección de las células dentro de 1 hora antes de la transfección. Procedimiento de transfección es la siguiente:
    1. La transfección utilizando kits comerciales
      1. Mezclar 20 l de reactivo de transfección (Lipofectamine por ejemplo) y 500 l de suero reducido medios de comunicación (por ejemplo, Opti-MEM). Añadir 10 g del plásmido retroviral a otros 500 l reducidos medio de suero. Incubar cada mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
      2. Poco a poco agregue la mezcla de plásmido a la mezcla de transfección. Este paso puede tardar 15-30 seg. Incubar la mezcla durante 20 min a RT (solución puede aparecer turbia).
      3. Añadir gota sabia mezcla de las células.
      4. Incubar toda la noche en una incubadora a 37 °.
    2. La transfección utilizando fosfato de calcio.
      1. Mezclar 40 l 2,5 M CaCl2 y 440 l ddH2O, a continuación, añadir 20 g de plásmido retroviral (ajustar la cantidad de ddH2O de manera que el volumen total es de 500 l).
      2. Añadir 500 l 2x HBS a un tubo cónico de 15 ml.
      3. Vortex la HBS y añada su parte la mezcla de ADN de calcio a la HBS gota a gota. Este paso lleva alrededor de 30 segundos para cada muestra. Así máximamente hacer 3-4 muestras simultáneamente.
      4. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min de incubación durante más tiempo lleva al precipitado más grande y menos células asumirá el precipitado.
      5. Añadir la mezcla gota a gota a las células y observar bajo el microscopio 20X. Precipitados finos (un montón de pequeñas son buenas pero algunas grandes no son buenos) deben ser vistos.
      6. Incubar durante la noche a 37 ° C incubadora.
  5. El día 2, cambiar el medio sobre las células con 8 ml precalentada medios de cultivo. Incubar durante 24 horas.
  6. El día 3 y el día 4, recoger el sobrenadante del cultivo de las placas mediante el uso de una jeringa desechable de 10 ml estéril, filtrándola a través de un filtro de acetato de celulosa de tamaño de poro 0,45 micras, y transferir a un tubo de 50 ml. Añadir 2 ml de solución de precipitación retrovirus a cada sobrenadante que contiene virus-8 ml. Suavemente mezclar e incubar durante la noche a 4 ° C.
  7. El día 5, girar la mezcla viral a 1500 × g a 4 ° C durante 30 min. Las partículas virales deben aparecer en pellet blanco en la parte inferior del tubo.
  8. Eliminar el sobrenadante. Centrifugar la solución residual por centrifugación a 1500 xg durante 5 min. Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo mucho cuidado de no molestar a las partículas retrovirales precipitados en tabletas.
  9. Resuspender gránulos retrovirales con tampón DPBS 100 l por cada 8 ml de sobrenadante viral. Alícuotael virus en hielo. Utilice inmediatamente o almacenar a -80 ° C.

4. La reprogramación de fibroblastos cardíacos

  1. Añadir 4 l de solución de polibreno 10 mg / ml en el medio de iCM 10 ml, y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. La concentración final de polibreno es 4 mg / ml.
  2. Añadir 500 l medios iCM que contiene polibreno a cada pocillo de placa de 24 pocillos sembrada con fibroblastos.
  3. Añadir 10 l retrovirus a cada pocillo que contienen ya sea 2-3 x 10 4 células de cultivo de explantes o 4-5 x 10 4 células de método de digestión enzimática. La cantidad de virus se debe aumentar proporcionalmente con el aumento de número de células en diferentes placas o placas de cultivo. Poner la placa en una incubadora a 37ºC durante 24 a 48 horas para permitir que la infección viral. La línea de tiempo para la reprogramación cardiaca se muestra en la Figura 1.
  4. Después de la transducción viral, reemplace virus medios que contienen con 500 l de medios regulares iCM.
  5. Cambie los medios de comunicación cada 2-3 días. Para la selección positiva de células transducidas virales, añadir medios ICM suplementados con puromicina a 2 mg / ml a las células diana. Manténgalo durante tres días. Después de eso, mantener la puromicina en el medio iCM a la concentración de 1 mg / ml.
  6. Tres días después de la infección viral, tomar la placa hacia fuera de la incubadora y colocarlo bajo un microscopio de fluorescencia invertida (20X) para observar la expresión de GFP.
    Nota: Diez días después de la infección viral, las células pueden ser cosechadas para el análisis FACS y análisis de la CPI para determinar la eficiencia de reprogramación (en el paso 5 y 6).
  7. Catorce días después de la infección viral, reemplace medios iCM con medios B27. Cambie los medios de comunicación cada tres días. Espontánea loci celular latido puede aparecer a partir de tres (células de método de digestión enzimática) o cuatro (células de método de cultivo de explante) semanas después de la transducción viral.

5. Inmunocitoquímico Análisis de Eficiencia Reprogramación

  1. Enjuague las célulascon el hielo frío PBS tres veces; eliminar el exceso de solución.
  2. Añadir tampón de fijación 0,5 ml de la CPI a cada pocillo de placas de 24 pocillos. Fijar las células a temperatura ambiente durante 15-20 min.
  3. Enjuagar las células con PBS tres veces.
  4. Añadir 0,5 ml de tampón de permeabilización ICC a cada pocillo de las placas de 24 pocillos. Permeabilizar las células a temperatura ambiente durante 15 min.
  5. Enjuagar las células con PBS tres veces.
  6. Añadir 0,5 ml de la CPI tampón de bloqueo a cada pocillo de placa de 24 pocillos, se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
  7. Anticuerpos primarios diluidos con tampón de tinción ICC. Añadir 200 l soluciones de anticuerpo a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 ° C. Los factores de dilución de anticuerpo se enumeran en Materiales.
  8. En el día siguiente, lavar las células con PBS tres veces.
  9. Añadir 200 soluciones de anticuerpos secundarios mu l a las células y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad.
  10. Lavar las células con PBS tres veces.
  11. Añadir 150 l solución que contiene DAPI a cada pocillo de montaje. Permitir a manchar núcleos durante 1 min. entoncescubrir cada pocillo con hoja de la cubierta de cristal redondo y presione suavemente el deslizamiento contra la superficie inferior con unas pinzas para quitar las burbujas de aire.
  12. Aspirar el exceso de solución y las muestras están listas para la imagen. Las imágenes representativas que muestran las células reprogramadas que expresan marcadores cardíacos cTnT y αActinin en d14 se muestran en la Figura 2B.

6. FACS análisis de la eficiencia de reprogramación

  1. Lave las células una vez con DPBS. Añadir 0,3 ml de tripsina (0,05%) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
  2. Golpee suavemente la placa para facilitar el levantamiento de las células. Compruebe el desprendimiento de células bajo el microscopio. Añadir 1 ml de tampón FACS a cada pocillo cuando se disocian mayoría de las células. Pipetear hacia arriba y abajo para disociar más mecánicamente las células.
  3. Transferir las células de la placa de 24 pocillos de una placa de 96 pozos profundos bien a bien. Centrifugado a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para recoger las células.
  4. Lavar las células una vez conTampón FACS.
  5. Añadir 100 soluciones de fijación / permeabilización mu l para resuspender las células durante 20 min a 4 ° C.
  6. Lavar las células dos veces con solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante.
  7. Prepare la solución de anticuerpo primario contra la GFP y cTnT en tampón de lavado 1x. Resuspender a fondo cada muestra con una solución de anticuerpo 50 l y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
  8. Lave las células una vez en solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante.
  9. Añadir 50 solución de anticuerpo secundario que contiene l Alexa Fluor 488 burro conjugado IgG anti-conejo y Alexa Fluor 647 burro conjugado anti-IgG de ratón a cada muestra. Se incuba a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
  10. Lave las células una vez en solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante.
  11. Resuspender las células en 400 l de tampón de fijación (DPBS con 1% PFA). La transferencia de células en el tubo de FACS con el casquillo de filtro de células. Las muestras están listas para la detección FACS. El análisis FACS representante de una eficiencia de reprogramacióny usando pMxs-puromicina-MGT construir con o sin selección puromicina se muestra en la Figura 2A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Los pasos de reprogramación se resumen por esquema de la Figura 1. Después de la transducción de MGT, la expresión de GFP en la reprogramación de células podrían ser detectados tan pronto como día 3. puromicina selección de células transducidas comienza a partir de 3 días y se mantiene durante las dos primeras semanas si PMX-puro se utiliza constructo -MGT. Por día 10 a día 14, la expresión de los marcadores cardíacos como cTnT y αActinin podría ser detectada tanto por ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Para exitosa generación iCM al utilizar este protocolo, hay varios factores importantes que tienen un impacto en la eficiencia global. Particularmente las condiciones de fibroblastos de partida y la calidad de codificación retrovirus MGT pueden afectar en gran medida la eficiencia de la reprogramación.

Es importante generar fibroblastos tan fresco y saludable posible. Para el método de cultivo de explantes, los fibroblastos se pueden utilizar antes de siete días después de los explante...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 for both FACS and ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 for ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 for ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular stainingBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield solution with DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, high glucoseLife Technologies10-013
Penicillin-streptomycinCorning30-002
Non-essential amino acidsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albuminFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitation SolutionALSTEMVC-200
0.4% Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm Tissue culture dishes Thermo Scientific172958
60 mm center well culture dish  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Round glass cover slipElectron Microscopy Sciences72195-15

Referencias

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Biolog a del DesarrolloN mero 105de fibroblastos card acosreprogramaci n directaiCMcardiomiocitosMEF2CGata4Tbx5MGT constructo policistr nica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados