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Resumo

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Resumo

Conversão directa de fibroblastos cardíacos (CFS) em cardiomiócitos induzida (ICMS) tem um grande potencial para a medicina regenerativa, oferecendo estratégias alternativas para o tratamento de doenças cardíacas. Esta conversão foi conseguida através da expressão forçada de factores tais como definidos GATA4 (L), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradicionalmente, iCMS são gerados por um cocktail de vírus que expressam esses factores individuais. No entanto, a eficiência da reprogramação é relativamente baixa e a maior parte do in vitro, G, M, T transduzidas fibroblastos não se tornem totalmente reprogramado, o que torna difícil estudar os mecanismos de reprogramação. Recentemente, têm mostrado que a estequiometria de L, M, T, é crucial para a eficiente reprogramação MIC. Um estequiometria óptima de G, M, T com alto nível relativo de M e baixos níveis de G e T obtidos usando nosso vetor MGT policistrónico (doravante referida como MGT) aumentou significativamente a eficiência de reprogramação e melhoria da qualidade iCM in vitro. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para gerar ICMS com MGT construção de fibroblastos cardíacos. Isolamento de fibroblastos cardíacos, geração de vírus de reprogramação e avaliação do processo de reprogramação também estão incluídos para fornecer uma plataforma para a geração eficiente e reprodutível de ICMS.

Introdução

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.

Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31.

Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

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Protocolo

O protocolo descrito aqui utiliza camundongos recém-nascidos. Cuidados com os animais e as experiências sejam realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pela Divisão de Laboratório de Medicina Animal (DLAM) na Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill.

1. Preparação de amortecedores e Mídia

  1. Prepare de fibroblastos (FB) forma: Suplemento 500 ml de meio IMDM com 100 ml Soro Fetal Bovino (FBS) e 6 ml de penicilina / estreptomicina.
  2. Prepare médio iCM: Suplemento 400 ml meio DMEM com 100 ml de mídia M199 e 50 ml FBS.
  3. Prepare meio B27: Suplemento 490 ml de mídia RPMI1640 com 10 ml de meio B27.
  4. Prepare Plat-E meio de cultura: 500 mL de Suplemento meio DMEM com 50 ml de FBS, 5 ml penicilina / estreptomicina e 5 ml de aminoácidos não-essenciais.
  5. Prepare Plat-E meio de transfecção: Suplemento 500 ml meio DMEM com FBS a 50 ml e 5 ml de aminoácidos não-essenciais.
  6. Prepare revestidos com gelatina placa de 24 poços: Adicionar 0,5 ml de solução de gelatina a 0,1% para um poço de placa de 24 poços, incubar a 37 ° C durante pelo menos 10 min e aspirado imediatamente antes da utilização.
  7. Preparar tampão de marcação FACS: Suplemento 500 ml de DPBS com FBS a 10 ml e 2 ml de EDTA (0,5 M) até atingir uma concentração final de 2 mM. Filtrar através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
  8. Preparar tampão de triagem MACS: Suplemento 500 ml de DPBS com 2,5 g de BSA e 2 ml de EDTA (0,5 M) até atingir uma concentração final de 2 mM. Filtrar através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
  9. Preparar tampão HBS 2x para a transfecção: Suplemento 500 ml de tampão HEPES (50 mM) com NaCl 280 mM (8,1816 g), 10 mM de KCl (0,37275 g), 1,5 mM de Na 2 HPO 4 (0,10647 g), Glicose 12 mM (1,08096 g ). Adicionar cerca de 650 ul de NaOH 10 N para ajustar o pH a 7,05-7,12. Filtrar através de um filtro de 0,22? M de poro e armazenar a 4 ° C.
  10. Prepare 2,5 M CaCl 2 solução para a transfecção: Adicione 18,376 g CaCl 2 a 50 ml de ddH 2 O. Filtrar através de um filtro de 0,22? M de poro e armazenar a 4 ° C.
  11. Prepare TPI (imunocitoquímica) tampão de fixação: Adicionar 5 ml de paraformaldeído (PFA, 32%) a 35 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 4%.
  12. Preparar tampão de permeabilização ICC: Adicionar 0,1 mL de Triton a 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 0,1%.
  13. Preparar um tampão de bloqueio ICC: Adicionar 5 g de albumina de soro bovino (BSA) a 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 5%.
  14. Preparar tampão de coloração ICC: Adicionar 1 g de BSA para 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 1%.

2. Geração de Neonatais mouse fibroblastos cardíacos

  1. Gerar fibroblastos cardíacos de método de cultura de explante
    1. Limpe neonatal αMHC-GFP camundongo transgênico (P1 a P2) com etanol 75%. Cortar a cabeça com uma tesoura esterilizada. Em seguida, faça uma incisão horizontal debaixo de uma axila para o outro. Use um estérilfórceps sem corte e dobrados para dissecar o coração e colocá-lo em um poço da placa de 24 poços contendo tampão PBS gelado.
      1. Alternativamente, espremer o coração após a incisão horizontal.
    2. Verifique expressão da GFP no coração por microscópio de fluorescência. Uma vez que a expressão da GFP é accionado por αMHC promotor que é um promotor específico cardíaco, o coração de ratinho transgénico deve ser em verde 15, enquanto o coração é negativa fraca em qualquer fluorescência.
    3. Tome 3-4 GFP corações positivos em 60 mm centro bem prato de cultura e pique-os em pedaços pequenos menos de 1 mm 3 em tamanho por tesouras e pinças esterilizadas.
    4. Coloque 3-4 corações picada em uma placa de 10 cm com 2 ml de mídia FB. Deixe os tecidos se estabelecer durante 3 horas.
    5. Lentamente, adicionar 8 ml de mídia FB pré-aquecido para os pratos que contenham tecidos cardíacos. Não perturbe os tecidos por três dias.
    6. Substitua o material a cada três dias.
    7. No dia 7, ASPIRcomeu o meio de cultura e lavar as células com DPBS. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina a cada placa e digerir a 37 ° C durante 5 min.
    8. Adicionar 5 ml de mídia FB para saciar a tripsina. Suavemente separar as células com um raspador de células. Pipetar os meios de comunicação cima e para baixo para dissociar ainda mais mecanicamente o tecido.
    9. Recolher as células e filtrar através de filtros de 40 uM de células para evitar a contaminação de fragmentos de tecido do coração, e, em seguida, peletizar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min.
    10. Lave as células uma vez com MACS tampão e células estão prontas para a classificação.
  2. Gerar fibroblastos cardíacos de método de digestão enzimática
    1. Colheita GFP corações positivos como 2.1.1. Transferir todos os corações em uma placa de 10 cm com 10 ml DPBS geladas.
    2. Esprema ventrículos com uma pinça estéril para remover o sangue e lavar uma vez com DPBS geladas.
    3. Apare os corações para ser livre de outros tecidos e gordura.
    4. Corte cada coração em cerca de 4 peças que ainda são frouxamente ligados.
    5. Se menos de 20 corações, transferir os corações em um tubo de 15 ml com 8 ml quente 0,05% de tripsina-EDTA, e incuba-se a 37 ° C durante 15 min.
      1. Se houver 20-30 corações, transferir os corações em um tubo de 50 ml com 10 ml quente 0,05% de tripsina-EDTA, e incuba-se a 37 ° C durante 15 min.
    6. Descartar a tripsina e adicionam-se 5 ml (para menos de 20 corações) ou (10 ml) durante 20-30 corações quente colagenase tipo II (0,5 mg / ml) em HBSS.
    7. Vortex o tubo em vortex durante 1 min a um nível de velocidade de cerca de 4 a 6 (se o líquido não se levantar para a tampa, em seguida, a velocidade é fina).
    8. Incubar o tubo 37 ° C em banho de água durante 3-5 min.
    9. Vortex o tubo durante 1 min.
    10. Sedimento durante 1 min por gravidade até que os pedaços de tecido sossegar, recolher o líquido em um novo tubo contendo 5 ml de meio FB frio.
    11. Repita os passos 3-5 2.2.6-2.2.10 vezes.
    12. Combine todas as coleções, filtrando através de 40 um filtro de célulaspara fazer a suspensão de célula única.
    13. Centrifuga-se a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    14. Ressuspender as células em 10 ml de tampão MACS, e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    15. Opcional: Se há um grande número de células do sangue, Ressuspender as células com 1 ml de tampão de lise de RBC (150 mM de NH4Cl, 10 KHCO 3 mM, e EDTA 0,1 mM), manter em gelo durante 1 min, em seguida, dilui-se com 10 ml MACS tampão e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Lave mais uma vez com tampão de MACS.
  3. Isolamento de fibroblastos THY1.2 + por MACS (triagem magnética-activada de células)
    1. Determinar o número de células viáveis ​​através de coloração azul de tripano.
      1. Tome 10 células ul a partir de suspensão de células 10 ml na etapa 2.2.14. Misturá-lo com solução de azul de 10 mL de 0,4% tripano.
      2. Adicione a mistura para um hemocitômetro. Deixe-a repousar durante 3-5 minutos e depois examinar imediatamente sob um microscópio. As células mortas são manchadas em células azuis e viáveis ​​são imaculado.
      3. Conte todas as células viáveis ​​em quatro quadrados 1 milímetro de canto do hemocitômetro. Determinar o número de células viáveis: a contagem média por metro quadrado x 2 (factor de diluição) x 10 4 x 10 (volume total de suspensão de células).
    2. Por menos de 1 x 10 7 células, as células ressuspender com 10 ul microbeads THY1.2 em 90 ul refrigerados tampão MACS. Adicionar mais grânulos proporcionalmente se houver mais do que 1 x 10 7 células. Misturar bem e incubar num frigorífico (2-8 ° C) durante 30 min.
    3. Adicionar 10 ml de tampão e MACS amostras de rotação a 200 g durante 5 min; lavar uma vez com tampão de MACS 10 ml e centrifugar novamente.
    4. Levar o volume a 2 ml em tampão MACS.
    5. Configurar uma Separator MACS na capa. Inserir uma coluna LS para o separador. Aplicar 3 ml MACS tampão para a coluna para equilibrar isso.
    6. Passar a suspensão de células através da coluna LS equilibrada.
    7. Lavar 3 vezes com 2 ml de tampão de MACS cada vez.
    8. Tome a coluna LS fora tSeparador ele e elui-se 3 vezes com 2 ml de tampão MACS para um novo tubo de 50 ml.
    9. Gire a 200 xg durante 5 min.
    10. Ressuspender as células em 10 ml de mídia FB, contar as células e sementes em placas a densidade adequada. Para fibroblastos gerados a partir de método de cultura de explante, a densidade de sementeira de células poderia ser de cerca de 2-3 x 10 4 células / poço de placa de 24 poços. Para fibroblastos gerados a partir de método de digestão enzimática, a densidade de células poderá ser cerca de 4-5 x 10 4 células / poço de placa de 24 poços.

3. Geração de Retrovirus para iCM Reprogramação

Nota: Execute as seguintes etapas em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica em condições estéreis. O descarte adequado de células transfectadas, pontas para pipetas e tubos é recomendado para evitar o risco de riscos ambientais e de saúde.

  1. Manter células Plat-E em meio Plat-E suplementado com 1 ug / ml de puromicina e 10 ug / mL blasticidin a 37 ° C com 5% de CO 2.
  2. No dia 2, substituir o meio por Plat-E meio de cultura sem puromicina e blasticidina.
  3. No dia 0, dividir células Plat-E em placas de 10 cm no dia antes da transfecção, aproximadamente 4-5 x 10 6 culas por placa. As células devem ser ~ 80-90% confluentes no dia da transfecção.
  4. No dia 1, os meios para mudança de cultura meio de transfecção em células dentro de 1 h antes da transfecção. Procedimento de transfecção é o seguinte:
    1. A transfecção usando kits comerciais
      1. Misturar 20 ul de reagente de transfecção (por exemplo, de Lipofectamine) e 500 ul de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM). Adiciona-se 10 ug do plasmídeo retroviral para mais 500 ul de meio de soro reduzido. Incubar cada mistura à temperatura ambiente (TA) durante 5 min.
      2. Adiciona-se lentamente a mistura de plasmídeo a mistura de transfecção. Esta etapa pode demorar 15-30 segundos. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente (solução pode aspecto turvo).
      3. Adicionar gota mistura sábia para as células.
      4. Incubar durante a noite numa incubadora a 37 ° C.
    2. A transfecção com fosfato de cálcio.
      1. Misturar 40 ul de 2,5 M de CaCl2 e 440 uL ddH2O, em seguida, adiciona-se 20 ug do plasmídeo retroviral (ajustar a quantidade de ddH2O modo que o volume total seja de 500 uL).
      2. Adicionar 500 mL 2x HBS a um tubo de 15 ml.
      3. Vortex da HBS e, entretanto, adicione a mistura de cálcio-ADN para a HBS gota a gota. Esta etapa demora cerca de 30 segundos para cada amostra. Assim maximamente fazer 3-4 amostras simultaneamente.
      4. Incubar à temperatura ambiente durante 3 minutos de incubação por mais tempo leva a maior precipitado e menos células vai ocupar o precipitado.
      5. Adicione a mistura gota a gota às células e observar ao microscópio 20X. Precipitados finos (um monte de pequenos são bons, mas alguns grandes não são bons) deve ser visto.
      6. Incubar durante a noite a 37 ° C incubadora.
  5. No dia 2, mudar meios sobre as células, com 8 ml de meio de cultura previamente aquecido. Incubar durante 24 h.
  6. No dia 3 e no dia 4, recolher o sobrenadante da cultura a partir das placas, utilizando uma seringa descartável de 10 ml estéril, filtrando-a através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 um de tamanho de poro, e transferir para um tubo de 50 ml. Adicionar 2 ml de solução de precipitação de retrovírus para cada sobrenadante contendo vírus de 8 ml. Suavemente misturá-lo e incubar durante a noite a 4 ° C.
  7. No dia 5, a mistura viral girar a 1.500 x g a 4 ° C durante 30 min. As partículas virais devem aparecer no sedimento branco no fundo do tubo.
  8. Desprezar o sobrenadante. Girar solução residual por centrifugação a 1500 × g durante 5 min. Remover todos os vestígios de líquido por aspiração, tomando muito cuidado para não perturbar as partículas retrovirais precipitados em pelota.
  9. Ressuspender retrovirais peletes com tampão de DPBS 100 uL para cada 8 ml de sobrenadante viral. Alíquotao vírus em gelo. Utilizar imediatamente ou armazenar a -80 ° C.

4. A reprogramação de fibroblastos cardíacos

  1. Adicione 4 ml de solução polibrene 10 mg / ml para o meio iCM 10 ml, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. A concentração final de polibreno é de 4 ug / ml.
  2. Adicionar 500 ul de meios iCM contendo polibreno a cada poço da placa de 24 poços semeada com fibroblastos.
  3. Adicionar 10 ul a cada poço retrovírus contendo os 2-3 x 10 4 células de cultura de explante ou 4-5 x 10 células de 4 método de digestão enzimática. A quantidade de vírus deve ser aumentada proporcionalmente com o aumento do número de células em placas de cultura ou diferentes pratos. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 24-48 h, para permitir que a infecção virai. A linha do tempo para a reprogramação cardíaca é mostrado na Figura 1.
  4. Depois de transdução viral, substitua vírus contendo mídia com 500 mL de mídia regulares iCM.
  5. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Para a selecção positiva de células transduzidas virais, adicionar ICM meios suplementados com puromicina a 2 ug / ml para as células alvo. Mantê-lo por três dias. Depois disso, manter a puromicina na forma iCM na concentração de 1 ug / ml.
  6. Três dias após a infecção virai, tomar a placa para fora da incubadora e colocá-lo sob um microscópio de fluorescência invertido (20X) para observar a expressão da GFP.
    Nota: Dez dias após a infecção virai, as células podem ser colhidas para análise FACS e análise ICC para determinar a eficiência de reprogramação (no passo 5 e 6).
  7. Quatorze dias após a infecção viral, substituir a mídia iCM com a mídia B27. Mudança de mídia a cada três dias. Batimento espontâneo loci célula pode aparecer a partir de três células (método de digestão enzimática) ou quatro (células de cultura método explante) semanas após a transdução virai.

5. Immunocytochemical Análise de Eficiência Reprogramação

  1. Células de enxágüecom PBS gelado três vezes; remover o excesso de solução.
  2. Adicionar 0,5 ml de tampão de fixação ICC para cada poço de placas de 24 poços. Fixar as células à temperatura ambiente durante 15-20 min.
  3. Enxaguar as células três vezes com PBS.
  4. Adicionar 0,5 ml de tampão de permeabilização ICC para cada poço das placas de poços 24. Permeabilizar as células à TA durante 15 min.
  5. Enxaguar as células três vezes com PBS.
  6. Adicionar 0,5 ml de ICC tampão de bloqueio a cada poço da placa de 24 poços, incubar à TA durante 1 h.
  7. Anticorpos primários diluídos com tampão de coloração TPI. Adicionar 200 ul de soluções de anticorpo a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C. Os factores de diluição de anticorpo estão listados em materiais.
  8. No dia seguinte, lavar as células com PBS três vezes.
  9. Adicionar 200 ul de soluções de anticorpo secundário para as células e incuba-se durante 1 h à TA em escuro.
  10. Lavar as células com PBS três vezes.
  11. Adicionar 150 ul de solução contendo DAPI para cada cavidade de montagem. Permitir que a mancha núcleos durante 1 min. Entãocobrir cada poço com rodada tampa de vidro deslizante e pressione suavemente o deslizamento contra a superfície inferior com uma pinça para remover bolhas de ar.
  12. Aspirar o excesso de solução e as amostras estão prontas para imagiologia. As imagens representativas que mostram as células que expressam o marcador reprogramadas cardíaca e TnT αActinin em D14 são mostrados na Figura 2B.

6. FACS análise da eficiência Reprogramação

  1. Lave as células uma vez com DPBS. Adicionar 0,3 ml de tripsina (0,05%) a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 5 min.
  2. Bata suavemente na placa para facilitar o levantamento das células. Verifique o desprendimento de células ao microscópio. Adicionar 1 mL de tampão de FACS a cada poço quando a maioria das células são dissociadas. Pipeta-se para baixo e para dissociar mais mecanicamente as células.
  3. Transferir as células na placa de 24 poços para uma placa de 96 poços poço profundo poço a poço. Rotação a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para recolher as células.
  4. Lavar as células uma vez comTampão FACS.
  5. Adicionar soluções de fixação 100 / ul permeabilização para ressuspender as células durante 20 min a 4 ° C.
  6. Lave as células duas vezes com solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
  7. Prepare solução de anticorpo primário contra GFP e cTnT em tampão de lavagem 1x. Ressuspender cuidadosamente cada uma das amostras com uma solução de anticorpo de 50 ul e incubar a 4 ° C durante 30 min.
  8. Lave as células uma vez em solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
  9. Adicionar 50 ul de solução de anticorpo secundário contendo Alexa Fluor 488 conjugado de IgG de burro anti-coelho Alexa Fluor 647 e burro conjugado anti-IgG de ratinho a cada amostra. Incubar a 4 ° C durante 30 min no escuro.
  10. Lave as células uma vez em solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
  11. Ressuspender as células em tampão 400 ul de fixação (DPBS com 1% de PFA). Transferência de células para dentro do tubo FACS com tampa de filtro de células. As amostras estão prontos para a detecção de FACS. A análise FACS representante de reprogramação eficy usando pMxs-puromicina-construção MGT com ou sem puromicina selecção é mostrado na Figura 2A.

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Resultados

Os passos de reprogramação são resumidos por esquemática na Figura 1. Após a transdução MGT, a expressão da GFP em células reprogramação pode ser detectada tão cedo como o dia 3. A puromicina selecção de células transduzidas é iniciado a partir do dia 3 e é mantida durante as duas primeiras semanas, se pMX-puro constructo -MGT é usado. Por volta do dia 10 até ao dia 14, a expressão dos marcadores cardíacos como TnT e αActinin poderia ser detectado por ambos TPI

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Discussão

Para a geração iCM bem sucedido ao usar este protocolo, existem vários fatores importantes que têm um impacto sobre a eficiência global. Particularmente as condições de fibroblastos de partida e da qualidade de codificação retrovírus MGT pode afetar consideravelmente a eficiência de reprogramação.

É importante para gerar fibroblastos tão fresco e saudável possível. Para o método de cultura de explante, os fibroblastos podem ser usadas antes de sete dias depois de os explant...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 for both FACS and ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 for ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 for ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular stainingBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield solution with DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, high glucoseLife Technologies10-013
Penicillin-streptomycinCorning30-002
Non-essential amino acidsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albuminFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitation SolutionALSTEMVC-200
0.4% Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm Tissue culture dishes Thermo Scientific172958
60 mm center well culture dish  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Round glass cover slipElectron Microscopy Sciences72195-15

Referências

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