JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Abstract

המרה ישירה של fibroblasts לב (CFS) לשריר לב מושרה (iCMS) מחזיקה פוטנציאל גדול לרפואת רגנרטיבית ידי מתן אסטרטגיות חלופיות לטיפול במחל לב. המרה זו הושגה על ידי ביטוי בכפייה של גורמים מוגדרים כגון Gata4 (G), Mef2c (M) וTbx5 (T). באופן מסורתי, iCMS מופקים על ידי קוקטייל של וירוסים להביע גורמים בודדים אלה. עם זאת, תכנות מחדש יעילות נמוכה יחסית ורוב במבחנה G, M, T-transduced fibroblasts לא הפך לתכנות מחדש באופן מלא, ולכן קשה ללמוד את מנגנוני תכנות מחדש. לאחרונה הראו כי ההרכב של G, M, T הוא חיוני לתכנות מחדש ICM יעיל. Stoichiometry אופטימלי של G, M, T עם רמה גבוהה היחסית של M והרמות נמוכות של G ו- T המושגת באמצעות וקטורנו polycistronic MGT (להלן כMGT) יעילות תכנות מחדש גדלה באופן משמעותי ואיכות ICM השתפרה במבחנה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת לייצור iCMS עם מבנה MGT מfibroblasts לב. בידוד של fibroblasts לב, דור של וירוס לתכנות מחדש והערכה של תהליך תכנות מחדש כלולים גם לתת במה לדור יעיל ושחזור של ICMS.

Introduction

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.

Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31.

Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בעכברים בילוד. טיפול בבעלי חיים וניסויים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי בעלי החיים רפואת החטיבה של המעבדה (DLAM) באוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל.

1. הכנת חוצצים ומדיה

  1. הכן פיברובלסטים בינוניים (FB): תוספת 500 מיליליטר תקשורת IMDM עם 100 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) ו -6 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין.
  2. הכן בינוני ICM: תוספת 400 מיליליטר DMEM תקשורת עם 100 מיליליטר תקשורת M199 ו- 50 מיליליטר FBS.
  3. הכן בינוני B27: 490 מיליליטר מוסף RPMI1640 תקשורת עם תקשורת B27 10 מיליליטר.
  4. להכין מדיום תרבות פלאט-E: תוספת 500 מיליליטר DMEM תקשורת עם FBS 50 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין ו -5 מיליליטר חומצות אמינו לא חיוניות.
  5. הכן בינוני transfection פלאט-E: תוספת 500 מיליליטר DMEM תקשורת עם FBS 50 מיליליטר ו 5 מיליליטר חומצות אמינו לא חיוניות.
  6. Prepare מצופה ג'לטין 24 צלחת גם: הוסף 0.5 מיליליטר 0.1% פתרון ג'לטין ולשל 24 צלחת גם, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 10 דקות ולשאוב ממש לפני השימוש.
  7. הכן חיץ תיוג FACS: תוספת 500 מיליליטר DPBS עם 10 מיליליטר FBS ו -2 מיליליטר EDTA (0.5 מ ') כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מ"מ. עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. הכן MACS מיון חיץ: תוספת 500 DPBS מיליליטר עם 2.5 BSA ז ו -2 מיליליטר EDTA (0.5 מ ') כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מ"מ. עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. הכן חיץ HBS 2x לtransfection: להשלים 500 מיליליטר חיץ HEPES (50 מ"מ) עם 280 מ"מ NaCl (8.1816 גר '), 10 מ"מ KCl (.37275 ז), 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4 (ז .10647), 12 מ"מ גלוקוז (1.08096 גרם ). להוסיף כ -650 μl 10 N NaOH להתאים pH ל7.05-7.12. סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הכן 2.5 פתרון M CaCl 2 לtransfection: הוסף 18.376 גרם CaDDH 2 50 מיליליטר Cl 2 O. סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. הכן ICC חיץ (immunocytochemistry) קיבעון: הוסף 5 מיליליטר paraformaldehyde (PFA, 32%) ל -35 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 4%.
  12. הכן חיץ permeabilization ICC: הוסף 0.1 מיליליטר טריטון 100 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 0.1%.
  13. הכן חיץ חסימת ICC: הוסף 5 אלבומין בסרום שור ז (BSA) 100 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 5%.
  14. הכן חיץ מכתים ICC: הוסף BSA 1 גרם ל -100 מיליליטר DPBS להגיע לריכוז סופי של 1%.

2. דור של ילודים פיברובלסטים לב עכבר

  1. צור fibroblasts לב משיטת תרבות explant
    1. עכבר נקי בילוד αMHC-GFP מהונדס (P1 לP2) עם 75% אתנול. חותך את הראש עם מספריים סטרילי. אז לעשות חתך אופקי מתחת לבית השחי אחת לשנייה. השתמש סטרילימלקחיים בוטים וכפופים ללנתח את הלב ולמקם אותו ובאחד של צלחת 24 היטב המכילה מאגר PBS קר כקרח.
      1. לחלופין, לסחוט את הלב לאחר החתך האופקי.
    2. בדוק ביטוי של GFP בלב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מאז הביטוי של GFP הוא מונע על ידי אמרגן αMHC שהוא אמרגן ספציפי לב, הלב מעכבר מהונדס צריך להיות ב -15 ירוקים, בעוד הלב השלילי הוא עמום בכל הקרינה.
    3. קח 3-4 לב חיובי GFP לתוך צלחת תרבות גם מרכז 60 מ"מ ובררת אותם לחתיכות קטנות של פחות מ 1 מ"מ 3 בגודל על ידי מספריים ומלקחיים סטריליות.
    4. מניחים 3-4 לבבות טחונים לתוך צלחת 10 סנטימטר אחד עם 2 מיליליטר תקשורת FB. בואו הרקמות להתיישב למשך 3 שעות.
    5. לאט לאט להוסיף 8 מיליליטר תקשורת FB מחומם מראש למאכלים המכילים רקמות לב. נא לא להפריע הרקמות במשך שלושה ימים.
    6. החלף את התקשורת בכל שלושה ימים.
    7. ביום 7, aspirאכלתי מדיום התרבות ולשטוף תאים עם DPBS. להוסיף 3 מיליליטר טריפסין 0.05% לכל צלחת ולעכל על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    8. הוסף 5 מיליליטר תקשורת FB כדי להרוות את טריפסין. בעדינות לנתק את התאים עם מגרד תא. פיפטה התקשורת מעלה ומטה כדי נוסף מכאני לנתק את הרקמה.
    9. איסוף תאים ולסנן דרך 40 מיקרומטר מסננות תא, כדי למנוע זיהום של שברי רקמת לב, ולאחר מכן גלולה תאים על ידי ספינינג ב XG 200 במשך 5 דקות.
    10. לשטוף את תאי פעם אחת עם MACS חיץ ותאים מוכנים למיון.
  2. צור fibroblasts לב משיטת עיכול אנזים
    1. הקציר GFP לב חיובי כ2.1.1. העבר את כל הלבבות לתוך צלחת 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר DPBS קר כקרח.
    2. לסחוט חדרי הלב עם מלקחיים סטרילית כדי להסיר דם ולשטוף פעם אחת עם DPBS קר כקרח.
    3. חתוך את הלבבות להיות חופשי של רקמות ושומן אחרים.
    4. חותך כל לב לבערך 4 חתיכות שעדיין מחוברות באופן רופף.
    5. אם פחות מ 20 לבבות, להעביר את לבם לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 8 מיליליטר 0.05% טריפסין-EDTA החם, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      1. אם יש 20-30 לבבות, להעביר את לבם לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של 0.05% טריפסין- EDTA חם, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    6. מחק את טריפסין ולהוסיף 5 מיליליטר (פחות מ 20 לבבות) collagenase מהסוג II החם או 10 מיליליטר (20-30 לבבות) (0.5 מ"ג / מיליליטר) בHBSS.
    7. מערבולת הצינור על vortexer דקות 1 ברמת מהירות סביב 4 עד 6 (אם הנוזל לא קם למכסה, אז המהירות היא בסדר).
    8. דגירה הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
    9. מערבולת הצינור 1 דקות.
    10. משקעי דקות 1 על ידי כוח הכבידה עד פיסות הרקמה להתיישב, לאסוף את הנוזל לתוך צינור חדש המכיל 5 מיליליטר בינוני FB הקר.
    11. חזור על שלבים 2.2.6-2.2.10 3-5 פעמים.
    12. מערבבים את כל האוספים ידי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטרכדי להפוך את ההשעיה תא בודדת.
    13. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    14. תאי Resuspend במאגר MACS 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    15. אופציונאלי: אם יש הרבה של תאי דם, תאים גלולים עם 1 מיליליטר חיץ RBC תמוגה (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, ו -0.1 מ"מ EDTA), לשמור על קרח 1 דקות, ואז לדלל עם 10 מיליליטר MACS חיץ צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. לשטוף עוד פעם אחת עם חיץ MACS.
  3. בידוד של Thy1.2 + fibroblasts ידי MACS (מיון תא מופעל מגנטי)
    1. לקבוע מספר תאי קיימא באמצעות הכתמת trypan הכחולה.
      1. קח 10 תאי μl מ- ההשעיה תא 10 מיליליטר בשלב 2.2.14. לערבב אותו עם פתרון trypan כחול 10 μl 0.4%.
      2. מוסיף את התערובת לhemocytometer. לאפשר לו לעמוד במשך 3-5 דקות ולאחר מכן לבדוק מייד תחת מיקרוסקופ. התאים המתים מוכתמים בתאים כחולים ובת-קיימא הם בלא כתם.
      3. לספור את כל תאי קיימא בארבעה ריבועי פינת 1 מ"מ של hemocytometer. לקבוע את המספר הסלולרי קיימא: הספירה לכל מ"ר x 2 (גורם לדילול) הממוצעת x 10 x 10 4 (נפח כולל של השעיה תא).
    2. עבור פחות מ 1 x 10 7 תאים, תאים גלולים עם microbeads Thy1.2 10 μl 90 μl מקורר חיץ MACS. הוסף עוד חרוזים יחסי אם יש יותר מ 1 x 10 7 תאים. מערבבים היטב דגירה במקרר (2-8 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
    3. הוסף 10 מיליליטר MACS חיץ ודגימות ספין ב XG 200 במשך 5 דקות; לשטוף פעם עם חיץ MACS 10 מיליליטר ו צנטריפוגות שוב.
    4. תביא נפח 2 מיליליטר במאגר MACS.
    5. הגדרה מפריד MACS במכסת מנוע. הכנס טור LS למפריד. החל 3 מיליליטר MACS חיץ לעמודה לאזן אותו.
    6. להעביר את ההשעיה התא דרך עמודת LS equilibrated.
    7. לשטוף 3 פעמים עם MACS 2 מיליליטר חיץ בכל פעם.
    8. קח את טור LS את tהוא מפריד וelute 3 פעמים עם 2 מיליליטר MACS חיץ לתוך צינור 50 מיליליטר חדש.
    9. ספין ב XG 200 במשך 5 דקות.
    10. תאים גלולים בתקשורת FB 10 מיליליטר, לספור את תאי זרע ולתוך צלחות בצפיפות נכונה. לפיברובלסטים שנוצרו משיטת תרבות explant, צפיפות תאי זריעה יכולה להיות סביב 2-3 x 10 4 תאים / טוב של 24 צלחת גם. לפיברובלסטים שנוצרו משיטת עיכול אנזים, צפיפות התאים יכולות להיות סביב 4-5 x 10 4 תאים / טוב של 24 צלחת גם.

3. דור של רטרו וירוס לתכנות מחדש ICM

הערה: בצע את השלבים הבאים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט בתנאים סטריליים. הסילוק נאות של תאי transfected, טיפים פיפטה וצינורות מומלץ להימנע מסיכון של מפגעים סביבתיים ובריאותיים.

  1. שמור על תאי פלאט-E בתקשורת פלאט-E בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin ו -10 מיקרוגרם b / מיליליטרlasticidin על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  2. ביום 2, להחליף את המדיום על ידי מדיום תרבות פלאט-E חסרת puromycin וblasticidin.
  3. ביום 0, לפצל תאי פלאט-E ל -10 מנות סנטימטר היום לפני transfection בכ 4-5 x 10 6 תאים לכל צלחת. תאים צריכים להיות ~ ומחוברות 80-90% ביום transfection.
  4. ביום 1, תקשורת שינוי התרבות לתקשורת transfection על תאים בתוך שעה 1 לפני transfection. הליך transfection הוא כדלקמן:
    1. Transfection באמצעות ערכות מסחריות
      1. מערבבים 20 מגיב μl transfection (למשל Lipofectamine) ו -500 μl תקשורת סרום המופחת (למשל, Opti-ממ). הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד retroviral 500 μl אחר מופחת תקשורת בסרום. דגירה כל תערובת בטמפרטורת חדר (RT) במשך 5 דקות.
      2. לאט לאט מוסיף את תערובת פלסמיד לתערובת transfection. שלב זה עשוי להימשך 15-30 שניות. דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT (פתרון עשוי להופיע מעונן).
      3. הוסף טיפת תערובת חכמה לתאים.
      4. דגירה הלילה בחממה 37 ° C.
    2. Transfection באמצעות סידן זרח.
      1. מערבבים 40 μl 2.5 M CaCl 2 וμL 440 DDH 2 O, ולאחר מכן להוסיף 20 מיקרוגרם של פלסמיד retroviral (להתאים את כמות DDH 2 O, כך שנפח כולל הוא 500 μl).
      2. הוסף 500 μl 2x HBS לצינור חרוטי 15 מיליליטר.
      3. מערבולת HBS ובינתיים להוסיף את תערובת סידן-דנ"א לHBS טיפה חכמה. צעד זה לוקח בערך 30 שניות לכל דגימה. אז מקסימאלי לעשות 3-4 דגימות בו זמנית.
      4. לדגור על RT לדגירת 3 דקות לזמן ארוך יותר מוביל למשקע ופחות תאים גדולים יותר ייקח את המשקע.
      5. מוסיף את תערובת טיפה חכמה לתאים ולהתבונן תחת מיקרוסקופ 20X. משקעים פיין (הרבה קטן הם טובים, אבל כמה גדול שבם הם לא טובים) יש לראות.
      6. דגירה הלילה בשעת 37 ° C חממה.
  5. ביום 2, לשנות תקשורת בתאים עם 8 מיליליטר prewarmed תקשורת והתרבות. דגירה של 24 שעות.
  6. ביום 3 ויום 4, לאסוף supernatant התרבות מהמנות באמצעות מזרק חד פעמי של 10 מיליליטר סטרילי, סינונו דרך מסנן אצטט תאית גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית, והעברה לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 2 מיליליטר של תמיסת הממטרים רטרו-וירוס לכל supernatant המכיל וירוס 8 מיליליטר. לערבב בעדינותו ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  7. ביום 5, לסובב את התערובת הנגיפית ב 1500 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. החלקיקים הנגיפיים אמורים להופיע בגלולה לבנה בחלק התחתון של הצינור.
  8. בטל supernatant. ספין למטה פתרון שיורית על ידי צנטריפוגה ב 1500 × גרם במשך 5 דקות. הסר את כל העקבות של נוזל על ידי שאיפה, נזהר מאוד שלא להפריע את חלקיקי retroviral זירז בגלולה.
  9. Resuspend כדורי retroviral עם חיץ DPBS 100 μl לכל 8 מיליליטר supernatant ויראלי. Aliquotהווירוס על קרח. להשתמש מייד או לאחסן ב -80 ° C.

4. תכנות מחדש של Fibroblasts הלב

  1. הוסף 4 μl של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון polybrene לתוך מדיום ICM 10 מיליליטר, ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. הריכוז הסופי של polybrene הוא 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
  2. להוסיף polybrene המכיל 500 תקשורת ICM μl היטב בכל 24 צלחת גם נזרע עם fibroblasts.
  3. להוסיף רטרו-וירוס 10 μl לכל אחד 2-3 x 10 4 תאים המכילים גם מתרבות explant או 4-5 x 10 4 תאים משיטת עיכול אנזים. כמות הנגיף צריכה להיות מוגברת באופן יחסי עם מספר תאים גדל בתרבות צלחות שונות או מנות. שים את הצלחת בחממה 37 ° C 24-48 שעות כדי לאפשר לזיהום הנגיפי. קו הזמן לתכנות מחדש של הלב מוצג באיור 1.
  4. לאחר התמרה ויראלית, להחליף מדיה המכילה וירוס עם 500 תקשורת ICM μl רגילה.
  5. לשנות תקשורת כל 2-3 ימים. לבחירה חיובית של תאי transduced נגיפיים, להוסיף מדיה ICM בתוספת puromycin ב2 מיקרוגרם / מיליליטר למקד תאים. שמור את זה במשך שלושה ימים. אחרי זה, לשמור על puromycin במדיום ICM בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטר.
  6. שלושה ימים לאחר זיהום ויראלי, לקחת את הצלחת החוצה מהחממה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (20X) להתבונן ביטוי של GFP.
    הערה: עשרה ימים לאחר זיהום ויראלי, תאים יכולים להיות שנקטפו לניתוח FACS וניתוח ICC כדי לקבוע את יעילות תכנות מחדש (בשלב 5 ו -6).
  7. ארבע עשרה ימים לאחר זיהום ויראלי, להחליף תקשורת ICM עם תקשורת B27. שינוי תקשורת בכל שלושה ימים. לוקוסי תא מכות ספונטניים עשויים להופיע משלושה (תאים משיטת עיכול אנזים) או ארבעה (תאים משיטת תרבות explant) שבועות לאחר התמרה ויראלית.

5. ניתוח Immunocytochemical של יעילות תכנות מחדש

  1. תאי שטיפהעם קרח קר PBS שלוש פעמים; להסיר פתרון עודף.
  2. הוסף חוצץ קיבעון 0.5 מיליליטר ICC היטב בכל 24 צלחות גם. תקן את התאים ב RT במשך 15-20 דקות.
  3. יש לשטוף את תאים עם PBS פעמים שלוש.
  4. הוסף חוצץ permeabilization 0.5 מיליליטר ICC היטב בכל 24 הצלחות גם. Permeabilize התאים ב RT במשך 15 דקות.
  5. יש לשטוף את תאים עם PBS פעמים שלוש.
  6. הוסף 0.5 מיליליטר ICC חסימת חיץ היטב בכל צלחת גם 24, לדגור על RT עבור שעה 1.
  7. נוגדנים עיקריים בדילול מלא עם חיץ מכתים ICC. הוסף 200 μl פתרונות נוגדן לכל היטב דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. גורמי דילול הנוגדן מופיעים בחומרים.
  8. ביום שלמחרת, לשטוף תאים עם PBS פעמים שלוש.
  9. הוסף 200 פתרונות נוגדנים משני μl לתאי דגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך.
  10. לשטוף את התאים עם PBS לשלוש פעמים.
  11. להוסיף 150 μl הרכבה תמיסה המכילה DAPI היטב כל אחד. לאפשר להכתים גרעיני 1 דקות. אזלכסות היטב עם כל להחליק את מכסה זכוכית עגולה ולחץ בעדינות להחליק על המשטח התחתון עם מלקחיים כדי להסיר בועות אוויר.
  12. לשאוב את הפתרון העודף והדגימות מוכנות להדמיה. תמונות הנציג מראים את התאים לתכנות מחדש המבטאים סמן לב cTnT וαActinin בD14 מוצגות באיור 2.

6. ניתוח FACS של יעילות תכנות מחדש

  1. ביסודיות לשטוף תאים פעם אחת עם DPBS. להוסיף 0.3 מיליליטר טריפסין (0.05%) לכל היטב דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. לטפוח בעדינות את הצלחת כדי להקל על הרמת התאים. בדוק את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ היטב כל אחד, כאשר רוב התאים הם ניתקו. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק נוסף מכאני את התאים.
  3. העבר את התאים בצלחת גם 24 לצלחת גם כן עמוקה 96 גם לטוב. ספין ב XG 200 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את התאים.
  4. לשטוף את תאי פעם אחת עםחיץ FACS.
  5. הוספת 100 פתרונות הקיבעון / permeabilization μl לresuspend תאים במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. שטוף תאי פעמיים עם פתרון לשטוף 1x, גלולה, ולהסיר supernatant.
  7. הכן פתרון נוגדן ראשוני נגד GFP וcTnT בחיץ לשטוף 1x. ביסודיות resuspend כל מדגם עם פתרון נוגדן 50 μl ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  8. לשטוף את תאי פעם אחת בפתרון לשטוף 1x, גלולה, ולהסיר supernatant.
  9. הוסף 50 פתרון נוגדנים משני μl מכיל IgG אלקסה פלואוריד 488 חמור מצומדות נגד הארנב ואלקסה פלואוריד 647 חמור מצומדות אנטי עכבר IgG לכל דגימה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
  10. לשטוף את תאי פעם אחת בפתרון לשטוף 1x, גלולה, ולהסיר supernatant.
  11. תאים גלולים ב400 חיץ קיבעון μl (DPBS עם 1% PFA). תא העברה לצינור FACS עם כובע מסננת תא. דגימות מוכנות לגילוי FACS. ניתוח FACS נציג efficienc תכנות מחדשy באמצעות pMxs-puromycin-MGT לבנות עם או בלי בחירת puromycin מוצג באיור 2 א.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

צעדי תכנות מחדש מסוכמים על ידי סכמטי באיור 1. לאחר התמרה MGT, הביטוי של GFP בתכנות מחדש של תאים ניתן היה לזהות כבר ביום 3. בחירת puromycin של תאי transduced מתחילה מיום 3 ונשמרה בשבועות הראשונים אם PMX-פור משמש מבנה -MGT. ביום 10 ליום 14, ביטוי של סמנים לבביים כמו cTnT וαActinin יכול להי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

עבור דור ICM מוצלח בעת שימוש בפרוטוקול זה, יש כמה גורמים חשובים שיש להם השפעה על היעילות הכוללת. במיוחד בתנאים של fibroblasts מתחיל והאיכות של MGT קידוד רטרו-וירוס יכולים להשפיע על יעילות תכנות מחדש באופן משמעותי.

חשוב ליצור fibroblasts רענן וב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 for both FACS and ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 for ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 for ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular stainingBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield solution with DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, high glucoseLife Technologies10-013
Penicillin-streptomycinCorning30-002
Non-essential amino acidsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albuminFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitation SolutionALSTEMVC-200
0.4% Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm Tissue culture dishes Thermo Scientific172958
60 mm center well culture dish  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Round glass cover slipElectron Microscopy Sciences72195-15

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105ICMMef2cpolycistronic MGT Gata4Tbx5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved