JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Аннотация

Прямое преобразование сердечных фибробластов (CFS) в индуцированных кардиомиоцитов (холодильников) имеет большой потенциал для регенеративной медицины, предлагая альтернативные стратегии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Это преобразование было достигнуто за счет принудительной экспрессии определенных факторов, таких как Gata4 (G), MEF2C (М) и Tbx5 (T). Традиционно, холодильников генерируются коктейль вирусов, выражающих эти индивидуальные факторы. Тем не менее, эффективность перепрограммирования является относительно низким, и большинство из в пробирке G, M, T-трансдуцированных фибробластов не станет полностью перепрограммировать, что затрудняет изучение механизмов перепрограммирования. Недавно мы показали, что стехиометрия G, M, T имеет решающее значение для эффективного ICM перепрограммирования. Оптимальный стехиометрии G, M, T с относительной высокой M и низким уровнем G и T, достигнутых с помощью нашего полицистронных MGT вектор (далее именуемое MGT) значительно повышенную эффективность перепрограммирования и улучшение качества ICM в пробирке, Здесь мы предлагаем подробное описание методологии, используемой для создания холодильников с MGT конструкции из сердечных фибробластов. Выделение сердечных фибробластов, поколения вируса для перепрограммирования и оценки процесса перепрограммирования также включены, чтобы обеспечить платформу для эффективного и воспроизводимого поколения холодильников.

Введение

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.

Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31.

Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протокол изложил здесь использует новорожденных мышей. Уход за животными и эксперименты выполняются в соответствии с руководящими принципами, установленными Отделом лабораторных животных медицины (DLAM) в Университете Северной Каролины, Чапел-Хилл.

1. Подготовка буферов и СМИ

  1. Подготовьте фибробластов (FB) среды: Дополнение 500 мл IMDM среду 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 6 мл пенициллина / стрептомицина.
  2. Подготовка ICM среда: Дополнение 400 мл DMEM СМИ со 100 мл М199 СМИ и 50 мл FBS.
  3. Подготовка B27 среду: Дополнение 490 мл RPMI1640 медиа с 10 мл B27 СМИ.
  4. Подготовьте Plat-E культуральную среду: Дополнение 500 мл DMEM среды с 50 мл FBS, 5 мл пенициллина / стрептомицина и 5 мл Номера незаменимых аминокислот.
  5. Подготовка Плат-E трансфекции среду: Дополнение 500 мл DMEM СМИ с 50 мл FBS и 5 мл Номера для незаменимых аминокислот.
  6. Прepare покрытые желатином 24-луночный планшет: Добавить 0,5 мл 0,1% раствора желатина в скважине 24-луночного планшета, инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере 10 мин и аспирации непосредственно перед использованием.
  7. Подготовка FACS буфера маркировки: Дополнение 500 мл DPBS 10 мл FBS и 2 мл ЭДТА (0,5 М) до конечной концентрации 2 мМ. Пройти через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С.
  8. Подготовка MACS буфера сортировки: Дополнение 500 мл DPBS с 2,5 г BSA и 2 мл ЭДТА (0,5 М), чтобы достичь конечной концентрации 2 мМ. Пройти через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С.
  9. Подготовьте 2x буфера HBS для трансфекции: дополнить 500 мл HEPES буфера (50 мм) с 280 мм NaCl (8,1816 г), 10 мМ KCl (0,37275 г), 1,5 мМ Na 2 HPO 4 (0,10647 г), 12 мМ глюкозы (1.08096 г ). Добавить около 650 мкл 10 N NaOH, чтобы довести рН до 7,05-7,12. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
  10. Подготовьте 2,5 М CaCl 2 решение для трансфекции: Добавить 18.376 г CaCl 2 до 50 мл DDH 2 O. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
  11. Подготовка ICC (Иммуноцитохимическая) фиксации буфер: Добавить 5 мл параформальдегида (PFA, 32%) в 35 мл DPBS до конечной концентрации 4%.
  12. Подготовка ICC проницаемости буфер: Добавить 0,1 мл Тритона до 100 мл DPBS до конечной концентрации 0,1%.
  13. Подготовка блокирующего буфера ICC: Добавить 5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 100 мл DPBS до конечной концентрации 5%.
  14. Подготовка ICC окрашивающего буфера: Добавить 1 г БСА на 100 мл DPBS до конечной концентрации 1%.

2. Генерация неонатальных мышей сердечных фибробластов

  1. Создание сердечные фибробласты из метода эксплантов культуры
    1. Чистый новорожденных αMHC-GFP трансгенной мыши (P1 до P2) 75% -ным этанолом. Отрежьте голову стерильными ножницами. Затем сделать горизонтальную разрез из-под одной подмышки до другой. Используйте стерильныйтупые и изогнутые щипцы рассекать из сердца и поместить его в одну лунку 24-луночного планшета, содержащего ледяной PBS буфера.
      1. Кроме того, выжать сердце после горизонтальной разреза.
    2. Проверьте GFP выражение в сердце флуоресцентным микроскопом. Так как выражение GFP управляется αMHC промотора, который является сердечная промотор, сердце из трансгенной мыши должны быть в зеленой 15, в то время как отрицательное сердце тусклый в любом флуоресценции.
    3. Принимают 3-4 GFP позитивные сердца в 60 мм центр культуральной чашки а фарш их на мелкие кусочки менее 1 мм 3 в размерах стерильными ножницами и щипцами.
    4. Поместите 3-4 фарш сердца в одно блюдо 10 см с 2 мл FB СМИ. Пусть ткани осесть в течение 3 часов.
    5. Медленно добавить 8 мл подогретого FB СМИ к блюдам, содержащих сердечные ткани. Не беспокоить тканей в течение трех дней.
    6. Замените носитель каждые три дня.
    7. На 7 день, Aspirели культуральной среды и промыть клетки с DPBS. Добавить 3 мл 0,05% трипсина в каждую чашку и переварить при 37 ° С в течение 5 мин.
    8. Добавьте 5 мл FB СМИ, чтобы утолить трипсина. Осторожно открепления клеток с клеточным скребком. Внесите СМИ вверх и вниз для дальнейшего механически отделить ткани.
    9. Сбор клеток и фильтруют через 40 мкм ячейки сита, чтобы избежать загрязнения фрагментов тканей сердца, а затем осадить клетки центрифугированием при 200 мкг в течение 5 мин.
    10. Вымойте клетки один раз MACS-буфера и клетки готовы для сортировки.
  2. Создание сердечные фибробласты из ферментов методом пищеварения
    1. Урожай GFP положительные сердца как 2.1.1. Перенесите все сердца в 10 см блюдо с 10 мл ледяной DPBS.
    2. Сожмите желудочки с стерильным пинцетом, чтобы удалить кровь и промыть один раз ледяной DPBS.
    3. Обрезать сердца, чтобы быть свободным от других тканей и жира.
    4. Разрежьте каждый сердце в примерно 4 частей, которые по-прежнему слабо связанных.
    5. Если менее 20 сердца, сердца передачи в 15 мл коническую пробирку 8 мл теплой 0,05% трипсина-ЭДТА, и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
      1. Если есть 20-30 сердца, сердца передачи в 50 мл коническую пробирку с 10 мл теплого 0,05% трипсина-ЭДТА, и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
    6. Откажитесь от трипсина и добавить 5 мл (менее 20 сердец) или 10 мл (для 20-30 сердца) теплой тип II коллагеназы (0,5 мг / мл) в HBSS.
    7. Вихревые трубки на вихревом смесителе в течение 1 мин при уровне скорости около 4 до 6 (если жидкость не вставать с крышкой, то скорость в порядке).
    8. Выдержите трубки в 37 ° С на водяной бане в течение 3-5 мин.
    9. Vortex трубку в течение 1 мин.
    10. Осадок в течение 1 мин под действием силы тяжести до тех пор, пока кусочки ткани осесть, сбора жидкости в новую пробирку, содержащую 5 мл холодной FB среды.
    11. Повторите шаги 3-5 2.2.6-2.2.10 раз.
    12. Смешайте все коллекции с помощью фильтрации через фильтр 40 мкм клетокчтобы суспензии отдельных клеток.
    13. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    14. Ресуспендируют клеток в 10 мл буфера MACS и центрифуге при 200g в течение 5 мин при 4 ° С.
    15. Необязательно: Если существует много клеток крови, ресуспендирования клеток с 1 мл РБК буфера для лизиса (150 мм NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3 и 0,1 мМ ЭДТА), держать на льду в течение 1 мин, затем разбавляют 10 мл MACS буфер и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин. Вымойте еще раз с MACS буфера.
  3. Выделение Thy1.2 + фибробластов по MACS (магнитно-активированных клеток сортировка)
    1. Определить количество жизнеспособных клеток через окрашивания трипановым синим.
      1. Возьмите 10 мкл клеток из суспензии на 10 мл клеточной этапе 2.2.14. Смешайте его с 10 мкл 0,4% трипанового синий раствор.
      2. Добавить смесь к гемоцитометра. Позвольте ему стоять в течение 3-5 мин, а затем изучить непосредственно под микроскопом. Мертвые клетки окрашиваются в синий и жизнеспособных клеток неокрашенных.
        3. Count все жизнеспособные клетки в четырех угловых 1 мм квадратов гемоцитометре. Определить жизнеспособного количества клеток: среднее количество за квадратный х 2 (фактор разведения) х 10 х 10 4 (общий объем клеточной суспензии).
    2. Для менее чем 1 х 10 7 клеток, ресуспендирования клеток с 10 мкл Thy1.2 микросфер в 90 мкл охлажденной MACS буфера. Добавить еще бусы пропорционально, если есть более чем 1 х 10 7 клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в холодильнике (2-8 ° С) в течение 30 мин.
    3. Добавить 10 мл MACS-буфера и образцы вращаются на 200 мкг в течение 5 мин; Промывают один раз 10 мл буфера MACS и центрифуги снова.
    4. Принесите объем до 2 мл в MACS буфера.
    5. Настройка МАКС Сепаратор в капот. Вставка столбца LS в сепаратор. Применение 3 мл буфера для MACS колонке, чтобы уравновесить его.
    6. Pass клеточной суспензии через уравновешенную колонку LS.
    7. Промыть 3 раза с 2 мл MACS буфера каждый раз.
    8. Возьмите колонку LS выкл тон сепаратор и элюируют 3 раза с 2 мл MACS буфера в новую пробирку на 50 мл.
    9. Спин при 200g в течение 5 мин.
    10. Ресуспендируют клеток в 10 мл FB СМИ, подсчет клеток и семян в планшеты надлежащего плотности. Для фибробластов, полученных от метода эксплантов культуры, посев плотность клеток может быть около 2-3 х 10 4 клеток / лунку 24 луночного планшета. Для фибробластов, полученных от фермента методом пищеварения, плотность клеток может быть около 4-5 х 10 4 клеток / лунку 24 луночного планшета.

3. Генерация ретровируса для ICM перепрограммирования

Примечание: Выполните следующие шаги в BSL2 биологическом Кабинета безопасности в стерильных условиях. Надлежащая утилизация трансфицированных клеток, наконечники пипеток и труб рекомендуется, чтобы избежать риска опасностей окружающей среды и здоровья.

  1. Поддержание Plat-E клеток в Plat-E, дополненной 1 мкг / мл пуромицин и 10 мкг / мл бlasticidin при 37 ° С с 5% СО 2.
  2. На 2-й день, замените носитель по Plat-E культуральной среде не хватает пуромицин и бластицидин.
  3. В день 0, разделить Plat-E клеток в 10 см чашки за день до трансфекции приблизительно 4-5 × 10 6 клеток на чашку. Клетки должны быть ~ 80-90% сплошности в день трансфекции.
  4. В день 1, изменение питательных сред для трансфекции клеток на средах в течение 1 часа до трансфекции. Процедура трансфекции выглядит следующим образом:
    1. Трансфекция с использованием коммерческих наборов
      1. Смешайте 20 мкл реагента для трансфекции (например, LipofectAMINE) и 500 мкл сыворотки снижается СМИ (например, Opti-MEM),. Добавить 10 мкг плазмиды ретровирусов еще 500 мкл сыворотки сниженным СМИ. Инкубируют каждый смеси при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
      2. Медленно добавить смесь плазмиды трансфекции смеси. Этот шаг может занять 15-30 сек. Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре (раствор может появиться облачно).
      3. Добавить смесь по каплям к клеткам.
      4. Инкубируют в течение ночи в 37 ° С инкубатор.
    2. Трансфекция с использованием фосфата кальция.
      1. Смешайте 40 мкл 2,5 М CaCl 2 и 440 мкл DDH 2 O, а затем добавить 20 мкг плазмиды ретровирусной (регулировать количество DDH 2 O, так что общий объем составл ет 500 мкл).
      2. Добавить 500 мкл 2x HBS в 15 мл коническую трубку.
      3. Vortex ОБД и тем добавить смесь кальция-ДНК в HBS по каплям. Этот шаг занимает около 30 сек для каждого образца. Так максимально сделать 3-4 образцов одновременно.
      4. Выдержите при комнатной температуре в течение 3 мин инкубации в течение больше времени приводит к большей осадка и менее клеток займет осадка.
      5. Добавить смесь по каплям к клеткам и наблюдать под микроскопом 20Х. Изобразительное осадки (много маленьких хороши, но несколько больших не хорошо) должно быть видно.
      6. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С инкубатор.
  5. На 2-й день, изменить СМИ на клетки с 8 мл предварительно нагретой культура СМИ. Инкубируют в течение 24 часов.
  6. На 3-й день и 4-й день, собирают супернатант культуры из блюд с помощью 10 мл стерильного одноразового шприца, фильтрация его через 0,45 мкм размер пор фильтра из ацетата целлюлозы, и передачи в 50 мл пробирку. Добавить 2 мл раствора ретровируса осадков каждому 8 мл вируссодержащей супернатанта. Аккуратно перемешать и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
  7. На 5 день вращаться вирусную смесь при 1500 х г при 4 ° С в течение 30 мин. Вирусные частицы должны появляться в белом осадке на дне пробирки.
  8. Удалите супернатант. Спин вниз остаточный раствора центрифугированием при 1500 х г в течение 5 мин. Удалить все следы жидкости стремлением, принимая большую заботу, чтобы не нарушить осажденных частиц в ретровирусных таблетки.
  9. Ресуспендируют гранул ретровирусных с 100 мкл буфера для DPBS каждые 8 ​​мл вирусной супернатант. Алиготевирус на льду. Использование сразу или хранить при -80 ° С.

4. Перепрограммирование фибробластов сердечных

  1. Добавьте 4 мкл 10 мг / мл раствора Полибрен в 10 мл среды ICM, и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Конечная концентрация полибрена это 4 мкг / мл.
  2. Добавить 500 мкл среды, содержащей ICM полибрена в каждую лунку 24-луночного планшета затравку фибробластов.
  3. Добавить 10 мкл ретровируса в каждую лунку содержащих либо 2-3 х 10 4 клеток эксплантата культуры или 4-5 х 10 4 клеток методом ферментативного расщепления. Количество вируса должна быть пропорционально увеличена с увеличением количества клеток в различных культуральных планшетах или кухни. Поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 24-48 часов, чтобы позволить вирусную инфекцию. Время линия для сердечной перепрограммирования показано на рисунке 1.
  4. После вирусной трансдукции, заменить вирусов, содержащий носитель с 500 мкл регулярной ICM СМИ.
  5. Изменить СМИ каждые 2-3 дней. Для позитивной селекции вирусных трансдуцированных клеток, добавить ICM среде с пуромицин по 2 мкг / мл к клеткам-мишеням. Держите его в течение трех дней. После этого сохранить пуромицин в среде ICM при концентрации 1 мкг / мл.
  6. Через три дня после вирусной инфекции, принимать пластины из инкубатора и помещают его под инвертированным флуоресцентным микроскопом (20х), чтобы наблюдать выражение GFP.
    Примечание: Через десять дней после вирусной инфекции, клетки могут быть собраны для анализа FACS анализа и ICC для определения эффективности перепрограммирования (на этапе 5, и 6).
  7. Четырнадцать дней после вирусной инфекции, заменить ICM СМИ с B27 СМИ. Изменить СМИ каждые три дня. Спонтанное локусы избиение клеток может появиться из трех (клеток фермента методом пищеварения) или четырех (клеток методом культивирования эксплантов) недель после вирусной трансдукции.

5. Анализ Иммуноцитохимическая перепрограммирования эффективности

  1. Промойте клеткильдом PBS холодной три раза; удаления избытка раствора.
  2. Добавить 0,5 мл ICC фиксации буфера в каждую лунку 24-луночных планшетах. Зафиксировать клетки при комнатной температуре в течение 15-20 мин.
  3. Промыть клетки с PBS три раза.
  4. Добавить 0,5 мл ICC проницаемости буфер в каждую лунку в планшетах 24 также. Клетки проницаемыми при комнатной температуре в течение 15 мин.
  5. Промыть клетки с PBS три раза.
  6. Добавить 0,5 мл ICC блокирующего буфера в каждую лунку 24-луночного планшета, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
  7. Разводненная первичные антитела с окрашиванием МТП буфера. Добавить 200 мкл антител решения в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 4 ° C. Факторы разбавления антитела перечислены в материалов.
  8. На следующий день, мыть клетки с PBS три раза.
  9. Добавить 200 мкл вторичного антитела решения к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в темный.
  10. Промыть клеток PBS три раза.
  11. Добавить 150 мкл раствора, содержащего монтажные DAPI в каждую лунку. Разрешить для окрашивания ядер в течение 1 мин. затемпокрыть каждую лунку с круглым покровным стеклом и слегка нажмите на скольжение по отношению к нижней поверхности пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  12. Аспирируйте избытка раствора и образцы готовы для работы с изображениями. Представительные изображения, показывающие перепрограммировать клетки, которые экспрессируют маркер сердечной cTnT и αActinin на d14, показаны на рис 2B.

6. Анализ FACS перепрограммирования эффективности

  1. Тщательно промыть клетки один раз DPBS. Добавить 0,3 мл трипсина (0,05%) в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
  2. Аккуратно постучите по планшету для облегчения подъема клеток. Проверить открепления клеток под микроскопом. Добавить 1 мл FACS буфера в каждую лунку, когда большинство клеток диссоциируют. Пипетка вверх и вниз для дальнейшего механического диссоциации клеток.
  3. Передача клеток в 24-луночный планшет в 96-луночные планшеты глубокой скважины скважины к скважине. Спин при 200g в течение 5 минут при 4 ° С для сбора клеток.
  4. Вымойте клетки один раз сFACS-буфера.
  5. Добавить 100 мкл решения фиксации / проницаемости для ресуспендирования клеток в течение 20 мин при 4 ° С.
  6. Вымойте клеток дважды 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
  7. Подготовка первичной решение антител против GFP и cTnT в 1x промывочного буфера. Тщательно ресуспендирования каждый образец с раствором 50 мкл антител и инкубируют при 4 ° С в течение 30 мин.
  8. Вымойте клеток один раз в 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
  9. Добавить 50 мкл раствора, содержащего вторичное антитело Alexa Fluor 488 конъюгированный осла против кролика IgG и Alexa Fluor 647 конъюгированный осла против мыши IgG к каждому образцу. Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
  10. Вымойте клеток один раз в 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
  11. Ресуспендируют клеток в 400 мкл буфера фиксации (DPBS с 1% PFA). Перевести ячейку в FACS трубы с сотового фильтра крышкой. Образцы готовы для обнаружения FACS. Представитель FACS анализ перепрограммирования efficiencу с помощью pMxs-пуромицину МГТ построить с или без отбора пуромицином показано на рисунке 2А.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Шаги перепрограммирования обобщаются схеме на фиг.1. После MGT трансдукции, GFP выражение в перепрограммировании клеток может быть обнаружен уже в день 3. Пуромицин выбор трансдуцированных клеток начинается с 3-й день и сохраняется в течение первых двух недель, если PMX-Puro -MGT исполь...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Для успешного поколения ICM при использовании этого протокола, есть несколько важных факторов, которые оказывают влияние на общую эффективность. В частности, условия, начиная фибробластов и качество кодирования ретровирус MGT может значительно повлиять на эффективность перепрограммир?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 for both FACS and ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 for ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 for ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular stainingBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield solution with DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, high glucoseLife Technologies10-013
Penicillin-streptomycinCorning30-002
Non-essential amino acidsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albuminFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitation SolutionALSTEMVC-200
0.4% Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm Tissue culture dishes Thermo Scientific172958
60 mm center well culture dish  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Round glass cover slipElectron Microscopy Sciences72195-15

Ссылки

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

105ICMMEF2CGATA4Tbx5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены