En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Resumen

Aquí presentamos una novela Ca ²⁺ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca ²⁺ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.

Resumen

Funcional de imágenes in vivo se ha convertido en un enfoque poderoso para estudiar la función y la fisiología de las células y estructuras de interés del cerebro. Recientemente, un nuevo método de Ca ²⁺ -Imagenología usando el reportero bioluminiscente GFP-aequorina (GA) se ha desarrollado. Esta nueva técnica se basa en la fusión de los genes GFP y aequorina, produciendo una molécula capaz de unirse calcio y - con la adición de su cofactor coelenterazina - emisor de luz brillante que se puede controlar a través de un colector de fotones. Las líneas transgénicas que llevan el gen GFP-aequorina se han generado para ambos ratones y Drosophila. En Drosophila, el gen GFP-aequorina se ha colocado bajo el control del sistema de expresión binario GAL4 / UAS permite la expresión específica y de formación de imágenes dentro del cerebro. Este método ha sido posteriormente demostrado ser capaz de detectar tanto hacia el interior Ca ^{2 + -transitorios} y Ca ²⁺ -released de las tiendas interiores. Lo más importante es que permite una mayor duración en la grabación continua, de formación de imágenes a mayor profundidad dentro del cerebro, y la grabación en altas resoluciones temporales (hasta 8,3 mseg). Aquí presentamos el método básico para el uso de imágenes bioluminiscente para registrar y analizar Ca ²⁺ -Actividad dentro de los órganos de setas, una estructura central para el aprendizaje y la memoria en el cerebro de la mosca.

Introducción

El patrón y la función de la actividad dentro del cerebro y sus estructuras discretas fundamental han sido durante mucho tiempo un área de intenso estudio en el campo de la neurociencia. Tal vez algunos de los enfoques exitosos primeros utilizados para tratar este tema eran medición fisiológica directa del cambio en la actividad eléctrica - métodos embargo alternativos que permiten imágenes en vivo de los cambios en las concentraciones de tensión, de pH o calcio (como sustituto de la actividad) han traído capacidades adicionales a el estudio de la actividad neuronal ^1. Las técnicas de imagen tienen una amplia gama de ventajas tales como la reducción de la invasividad y la capacidad de monitorear la actividad dentro de las estructuras cerebrales enteros. Además, en animales con genética tratables como la mosca de la fruta Drosophila, el desarrollo de indicadores de calcio codificados genéticamente, como cameleon, GCaMPs y otros ¹ han permitido a los investigadores para supervisar las neuronas individuales, poblaciones neuronales y todo el cerebroestructuras. Mientras que los métodos más tradicionales fluorescentes Imagen de calcio utilizando GCaMPs (GFP fusionada a calmodulina) o FRET (PPC y YFP fusionado a calmodulina) han demostrado ser técnicas útiles que proporcionan una buena resolución espacial y temporal, el proceso subyacente de la excitación de luz genera algunas limitaciones en su experimental aplicaciones. Debido a la naturaleza de la excitación de luz, autofluorescencia, foto-blanqueo, y fototoxicidad se producen inevitablemente, que en consecuencia limita la profundidad de las estructuras que se pueden obtener imágenes, la duración de las grabaciones, así como la continuidad en tiempo real de grabación. En otras palabras, a menudo grabaciones deben realizarse intermitentemente para evitar estos efectos secundarios no deseados.

Debido a estos problemas, se han desarrollado métodos alternativos adicionales de imágenes de calcio. Uno de los métodos más prometedores es bioluminiscente de imágenes, que se basa en la luz producida a través de una reacción enzimática después de la unión de calcio. Bioluminescent de imagen no requiere de excitación de luz y por lo tanto no experimenta las mismas dificultades que imágenes de calcio convencional. El reportero Aequorina bioluminiscente - aislada de Aequorea victoria, el mismo medusas GFP a partir del cual también fue isolated- se une al calcio a través de sus tres estructuras de mano EF y sufre un cambio conformacional, que conduce a la oxidación de su cofactor coelenterazina y la liberación de la luz azul (λ = 469 nm) ^2,3. Aequorina tiene una afinidad muy baja para el calcio (K _{d =} 10 mM) que lo hace ideal para el seguimiento de los transitorios de calcio, ya que produce muy poco ruido de fondo y no interfiere con el sistema de tamponamiento de calcio intracelular ^4. Aunque ecuorina se ha utilizado anteriormente para controlar el proceso de inducción neural en el huevo Xenopus ⁵ la luz producida es demasiado tenue para usar para formación de imágenes en tiempo real de la actividad neuronal. En un esfuerzo por abordar este desafío, Philippe Br y# 251; dejar y sus colegas del Instituto Pasteur creó una construcción genética fusión GFP y aequorina genes, imitando el estado nativo dentro de la medusa ^4. Este producto gen de fusión se une al calcio nuevo a través de las tres estructuras de mano EF de aequorina, que sufre un cambio conformacional que conduce a la oxidación de la coelenterazina, que transfiere energía no radiativamente a la GFP. Esta transferencia de energía como resultado la liberación de la luz verde (λ = 509 nm) a partir de las buenas prácticas agrarias, en lugar de la luz azul de aequorina. La fusión de las buenas prácticas agrarias y aequorina también confiere una mayor estabilidad de la proteína ayuda a la proteína de fusión producen luz de 19 a 65 veces más brillante que aequorina solo ^4. Utilizando un enfoque bioluminiscente en el cerebro se expande la aplicación experimental actual de imágenes de calcio tanto en términos de la duración de la grabación continua y el número de estructuras dentro del cerebro que se puede grabar. En términos generales, en el contexto del trabajo anterior significa que tanto global y una mayorvariedad de "actividad" regionalizado del cerebro puede ser monitorizado (a través del proxy de los transitorios de calcio). Más importante actividad se puede controlar por más tiempo, en un tiempo real y de forma continua, lo que se presta fácilmente a la búsqueda de una comprensión más completa de la función basal en el cerebro.

En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado moscas transgénicas que expresan la GFP-aequorina bajo el control del sistema de expresión binario (GAL4 / UAS-GFP-aequorina) ^5,6. Hemos utilizado la bioluminiscencia-GFP aequorina para registrar la actividad producida por estímulos naturales tales como aroma ^7,8, así como los componentes celulares estudiadas modulan Ca ²⁺ -Actividad en los cuerpos de hongos siguientes estimulación del receptor de acetilcolina nicotínico mediante la aplicación directa ^9. Además, también hemos utilizado GFP-aequorina hacer frente a una serie de preguntas experimentales que no han podido ser tratados previamente, como a largo plazoimágenes de los transitorios de calcio espontáneas y visualización de las estructuras cerebrales profundas ^10. Más recientemente, se ha utilizado el sistema GAL4 / UAS para expresar el receptor de mamífero ATP P2X ₂ ¹¹ un canal de cationes, en las neuronas de proyección (PN) y se utiliza el sistema LexA expresar GFP-aequorina en los órganos de setas (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (cortesía de B. Pfeiffer, Janelia Granja, EE.UU.). Esto nos ha permitido activar el PN por aplicación de la ATP, que a su vez activa los órganos de setas (una diana aguas abajo de la PN), imitando las condiciones más naturales, como la respuesta a un estímulo olor. En general esta técnica que combina P2X ₂ y GFP-aequorina amplía las posibilidades de experimentación. En términos generales, ofrece la oportunidad de entender mejor los patrones de actividad en el cerebro, la iniciación de nuevos estudios sobre cómo los diferentes estímulos y las perturbaciones pueden alterar el patrón basal de actividad.

Protocolo

1. Preparación de las muestras

1. Preparación de soluciones y configurar
   1. Mantenga todas las líneas de Drosophila melanogaster a 24 ° C en medio de la comida estándar. Posterior y mantenerlos a baja densidad en el vial para generar tamaño estándar y el peso de las moscas.
      1. Añadir 10 hembras vírgenes con 10 hombres en un frasco, dejar que ellos se aparean y transferirlos cada 2 días a un vial fresco. Luego de 10 días más tarde, cuando las moscas empiezan a eclose, cosechar las moscas todos los días. Mantenga un registro preciso de la edad de las moscas y mantenerlos en buenas condiciones.
      2. En el día 3, separar los machos de las hembras y tener las hembras 20 moscas por vial. Registre las moscas a los 4 o 5 días de edad.
   2. Preparar la solución de Ringer con las siguientes concentraciones: NaCl 130 mM, 5 mM KCl, 2 mM de MgCl _2, CaCl ₂ mM, HEPES 5 mM, 36 mM de sacarosa y 2 y ajustar el pH de la solución a 7,3 con precisión. Preparar soluciones de perfusión de 25 μ; M nicotina y KCl 100 mM en solución de Ringer.
   3. Preparar 1000 punta de la pipeta l: el uso de una punta de forma de la hoja de afeitar para una inclinación (aproximadamente 35 ° de final de la punta) y eliminar el exceso de base más allá de 1 ½ centímetros de punta.
   4. Caja de almacenamiento (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) de la muestra Preparar durante la incubación. Coloque dos esponjas (12 cm x 8 cm x 3 cm) saturado con agua en la parte inferior [para evitar la desecación de la muestra] por debajo de un aparato de bastidor pequeño para colocar las muestras en como se haya completado su preparación.
   5. Preparar muestras moscas de modo que contengan al menos 1 copia de la UAS-GFP-aequorina y una copia de una línea Gal4 para dirigir la expresión de GFP-aequorina. Línea OK107 Gal4 (una expresión de la línea de conducción principalmente en los órganos de setas) se cruza con UAS-GFP-aequorina en esta preparación.
      NOTA: El interior de la caja debe ser resistente al agua y el exterior debe bloquear la luz del cuadro de entrar para evitar la degradación de coelenterazina durante la incubación.
2. Deberesparación de muestras
   1. Hielo anestesiar Drosophila transfiriéndolo a un vial de vidrio y mantener en hielo durante 2 min antes de ser trasladado al plato frío Petri para el posicionamiento de la punta de la pipeta. Preparar puntas de pipeta en papel de filtro ligeramente humedecido en 100 ml caja de Petri en el hielo bajo el microscopio de disección.
   2. Suavemente con unas pinzas lugar volar dentro de la punta de la pipeta.
   3. El uso de un cepillo de empuje suavemente y alinear mosca de tal manera que la cabeza está completamente más allá del borde de la punta y la región dorsal está parcialmente expuesta por la sección eliminado durante la conformación de la punta (Figura 2B).
   4. Combina un pequeño (aproximadamente 3-4 mu l) partes de los dos componentes del pegamento dental. Aplique el pegamento con cuidado alrededor de la parte delantera y trasera cabeza y el cuello hacia abajo y alrededor del borde punta de la pipeta - evitando la corona de la cabeza. Deje que el pegamento se seque durante 2 min.
   5. Punta Place pipeta con mosca pegada a través del agujero en la cámara de grabación (Figura 2D) y la generacióntly pulse para asegurar en su lugar.
   6. Combinar los dos componentes del pegamento de silicona (aproximadamente 3-4 l). Aplique el pegamento en la parte plana de la cámara a lo largo del borde donde la cámara y pipeta de punta se reúnen para evitar fugas de la solución de Ringer. Deje que el pegamento se seque durante 2 min.
3. Disección
   1. Colocar la cinta a través del canal de perfusión, el borde corto y que se extiende a la parte posterior de la cámara.
   2. Coloque la cámara con la mosca en bloque de la disección bajo su vez microscopio en la lámpara fluorescente. Pipetear 1 ml de solución de Ringer en la cámara.
   3. Utilice bisturí fino para quitar la cutícula. Hacer incisiones paralelas de la parte posterior de la cabeza a la región de la antena. A continuación, corte a lo largo del borde de los ojos luego hacer una incisión perpendicular por encima de la antena que conecta las incisiones anteriores. Haga una incisión paralela final a que en la parte posterior de la cabeza. Utilice las pinzas cortantes finos para quitar la cutícula (Figura 2C).
   4. Utilice unas pinzas finas afilados para agarrar suavemente unad despejar expuesta tejido respiratorio hasta el cerebro y [fluorescente] cuerpo de setas está claramente visualizados.
   5. El uso de fórceps ultra fuerte para captar atención y pellizcar tejido neuroepitelial que cubre el cerebro para permitir la penetración del coelenterazina.
      NOTA: Como alternativa papaína se puede utilizar para permeabilizar la neuroepithelia ^9.
   6. Usando una pipeta, lavar dos veces con solución de Ringer para eliminar los residuos de la disección y el lugar de la muestra en el cuadro oscuro.
   7. Pipetear 1 ml de solución de Ringer que contiene 5 mM bencil-coelenterazina en la cámara. Cierre la caja y permitir que la incubación con coelenterazina a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 hr.

2. Imaging

1. Preparar
   1. Comience sistema de grabación: encienda el microscopio, computadora, cámara y el sistema de drenaje y sala de establecer controles ambientales de 25 ° C.
   2. Abrir Medición y programa Automation Explorer en el equipo. Haga clic en “ Devices and Interfaces ", a continuación, haga doble clic en" NI Motion Dispositivos "y haga clic finalmente a la derecha en" PCI-7334 "y seleccione" inicializar dispositivo ".
   3. Abra Fotón Imager. Crear nueva carpeta y el nombre del primer archivo de grabación. Cámara debe llegar a -80 ° C antes de sistema funcionará.
   4. Establecer un sistema de perfusión - añadir KCl, la nicotina y la solución de Ringer a embalses y ajustar lo que las descargas cada solución en 2 ml / min. Lavar con solución de Ringer antes de comenzar el experimento.
2. Preparar la muestra
   1. Lugar de imágenes montaje plato bloque en el monte bajo microscopio con un aumento de 5X e insertar el tubo de perfusión en el canal a través de la punción.
   2. Establecer microscopio para el modo fluorescente continuación centro y traer órganos de setas (MB) en el foco. Ajuste a 20X y volver a central y el enfoque.
   3. Aparato de drenaje Posición sobre la piscina de drenaje, ajuste la altura de la derivación de drenaje para que la punta es sólo Above piscina, y ejecutar la solución de Ringer durante 30 segundos para asegurar un drenaje adecuado.
   4. Baje escudo para sellar el aparato de la luz. Utilizando el sistema automatizado de imágenes de fotones hacer ajustes precisos en el enfoque y tomar una imagen fluorescente de referencia de los MBs.
3. Grabación
   1. Ajuste la velocidad del fotón a la velocidad de grabación deseada (de 50 ms hasta 1 seg o más). Seleccione el modo de fotones y el obturador abierto. Genotipo Record, el sexo, la edad y el número de muestras en las entradas del registro. Ajuste cajas posición de retorno de la inversión más de cáliz y cuerpos celulares (CCB) y lóbulos mediales haciendo clic en las casillas de ROI y arrastrando mientras mantiene el control.
   2. Record línea de base durante aproximadamente 5 a 10 min (según se desee).
   3. Aplicar nicotina durante 1 min. Nota iniciar / detener en el registro. Lavar con solución de Ringer para 5 min.
   4. Espere 5 minutos para la recuperación y preparar KCl entrada de registro y el temporizador.
   5. Aplicar KCl durante 1 min. Nota iniciar / detener en el registro. Lavar con solución de Ringer durante 1 min.
   6. Cambiaral modo fluorescente, tomar imagen fluorescente final, y apague la solución de Ringer.
   7. Pulse el botón "Stop". Cuadro de diálogo le preguntará para apagar el sistema. Seleccione "No" para continuar la grabación.
   8. Escudo abierto, sistema de drenaje movimiento, el objetivo de la lente cambie a 5X, retire el tubo de perfusión. Retire la muestra / plato de grabación desde el escenario, limpiar la lente 20X enjuagando y limpiar la lente dos veces con agua.
   9. Pulse el botón de reproducción en blanco en la parte superior de la ventana del programa para iniciar la siguiente grabación.

3. Análisis y Creación de Video

1. Extrae los valores de fotones
   1. Abra el programa de análisis de fotones (por ejemplo, de Fotones Viewer) y abrir el archivo de hoja de cálculo primera muestra.
   2. Selecciona la pestaña de control de pantalla. Seleccione el ROI, haga clic en la región mientras mantiene el control. Ajustar el tamaño, la orientación y la forma de las regiones de interés para abarcar GFP CCB iluminada y lóbulos mediales.
   3. Añadir una adiciónAl retorno de la inversión haciendo clic en "Definir ROI" y haciendo clic y arrastrando en la pantalla para crear el nuevo ROI.
   4. Seleccione la pestaña "Película" para visualizar el video de fotones. Ajuste "width sec" y "pasos sec" si lo deseas. Reajuste la colocación ROI según sea necesario.
   5. Seleccionar capturas de pantalla representativas de la fluorescencia de GFP, la respuesta a la nicotina y la respuesta KCl. Imagen Goma imágenes de cosechas y en una presentación de diapositivas para su posterior análisis y comparación.
   6. Ajuste tanto el "ancho de seg" y "paso seg" a la velocidad de grabación en cuestión de segundos. Seleccione la longitud del análisis moviendo marcadores grises en el panel superior a la región de soporte antes de la iniciación de estímulo y justo después de finalizar la respuesta.
   7. Seleccione "Suspender vistas mientras se reproduce" prensa "<< REW" y pulse "PLAY>". Seleccione la pestaña "Cuenta Tabla de Tarifas" y ajustar las unidades como desee y colores de línea para que coincida con el color ROI.
   8. Cuando se termina el análisis, Pulse "Exportar Count Data Rate". Seleccione capturas de pantalla de combinado grabaciones CCB y la región del lóbulo medial de interés por parte de cada lado. Imagen Goma imágenes de cosechas y en una diapositiva con imágenes de respuesta. Esta diapositiva se utilizará más adelante en el análisis final.
2. Ejemplo Análisis: un método para el análisis de los datos extraídos de fotones detallados
   1. Abrir los archivos de hojas de cálculo en la carpeta "Cuenta Tarifa exportaciones".
   2. Vuelva a formatear las celdas de la primera columna etiquetada tiempo para mostrar la hora en horas y minutos.
   3. Hacer referencia a la diapositiva correspondiente para la muestra. Retire todos los valores excepto las columnas para el tiempo y los dos representante ROI.
   4. Determinar la nicotina estimulación hora de inicio - disponible en el archivo de entrada de registro en el principal carpeta- eliminar datos adicionales antes de comenzar o el valor más destacado.
   5. Encuentra más alto valor / pico para ambos CCB y el lóbulo medial y marca / culminante.
   6. Determinar inicio de respuesta y tiempo final para ambosCCB y el lóbulo medial mediante la creación de una estimación usando punto de tiempo de los correspondientes representan gráficamente la respuesta en la diapositiva y seleccione valor real por el cambio en los valores en la proximidad de estos puntos. Resalte la región entre estos puntos, tanto en el CCB y lóbulos mediales. También puede utilizar una macro ^9.
   7. Combinar todas las muestras de un grupo experimental en una nueva hoja de cálculo.
   8. Alinear en el pico mediante la determinación del valor de la fila es para cada valor de pico CCB. Restar los valores más bajos desde el valor más alto de fila para determinar el valor de fila aproximada en que los datos de la muestra deben ser vueltos a copiar a. Verifique que todos los valores de pico están alineados.
   9. Copie la hoja dos veces y eliminar cualquiera de las columnas del lóbulo medial o las columnas CCB creación de páginas de sólo el CCB o valores del lóbulo medial.
   10. Eliminar datos después de las todas las respuestas CCB han terminado. Crear cuatro filas etiquetadas Total de fotones, Longitud Respuesta (duración), pico de amplitud y latencia de respuesta. Copia y pega este nuevo por debajo de los originales.
   11. Utilice la función SUMA para determinar fotones totales durante la respuesta. Utilice la función CONTAR para determinar la longitud de la respuesta. Copia y vincular más alto celda de valor para determinar el valor pico de amplitud. Utilice la función COUNT - seleccionar desde el comienzo de la perfusión de la nicotina para el inicio de la respuesta - para determinar la respuesta de latencia.
   12. Los valores de copia mediante el uso de la función de enlace y se multiplican (todos excepto amplitud máxima) mediante el registro de la velocidad en cuestión de segundos.
   13. Gráficos de barras / caja se pueden crear para los parámetros calculados tales como Total de fotones, pico de amplitud y la duración de respuesta, si así se desea (ej .: la figura 5B, C, D).
   14. En la columna después de la respuesta de fotones de datos en bruto, la media de los puntos de datos en bruto para cada punto de tiempo utilizando la función de la media. Si seguimiento deseado con una columna de determinar el error estándar de la media (SEM), para cada uno de los valores promediados de fotones en un punto de tiempo.
   15. Utilice la columna media para construir un profil medio de respuestae [Gráfico] para el grupo de muestra CCB. Para ello seleccionar la columna que especifica el tiempo como los valores del eje x y la columna de los valores medios de fotones como el eje y, y finalmente seleccionar la herramienta de creación gráfica de dispersión.
   16. Repita este procedimiento de análisis con los datos de los lóbulos medial.
3. Creación de imágenes para el video
   1. Visor de fotones en Abrir.
   2. Seleccione la ficha de control de pantalla. Haga clic en el ROI mientras mantiene el control para seleccionar, eliminar y / o minimizarlo.
   3. Modificar "anchura sec" (tiempo de acumulación) como se desee para determinar el contenido de cada trama.
   4. Modificar "paso sec" para definir el solapamiento de cada trama.
   5. Seleccione "vistas a la exportación durante la reproducción" de prensa "<< REW" y luego "PLAY>". Las imágenes para el video se exportarán a la carpeta "vista exportaciones" como una serie de archivos .png.
4. Usando Virtual Dub para hacer video: un método para vídeo creación detallada
   1. Crear una nueva carpeta llamada "resultats" en la carpeta de vista exportaciones que contiene las imágenes.
   2. Traiga script (renommer.VBS) en la carpeta de imágenes.
   3. Doble click en renommer.VBS se ejecute.
   4. Imágenes automáticamente se cambia el nombre numéricamente y se copian en la carpeta "resultats".
   5. Abrir VirtualDub.exe.
   6. Seleccionar archivo de vídeo abierto - seleccionar primero la imagen (imágenes siguientes se cargarán automáticamente).
   7. Seleccionar vídeo - seleccionar la velocidad de fotogramas ajustar si lo deseas.
   8. Seleccionar vídeo - seleccionar compresión seleccionar Cinepak Codec por radio.
   9. En el archivo, seleccione Guardar como AVI el video se creará automáticamente.

Resultados

La fusión de la GFP a aequorina nos permite visualizar nuestra región de interés antes de la imagen bioluminiscente través de la excitación de GFP en el modo en el microscopio fluorescente (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Una de las formas más sencillas para estimular los órganos de setas es a través de la activación de los receptores nicotínicos de la acetilcolina ionotrópicos. Aunque la acetilcolina es el ligando endógeno de este receptor se ha encontrado que la nicotina produce r...

Discusión

El enfoque-GFP-aequorina bioluminiscente basado recientemente desarrollado que aquí se presenta permite la grabación funcional in vivo de Ca ²⁺ -Actividad en diferentes neuronas en, así como si se desea, en otro tipo de células, tales como células estrelladas del riñón como se informa en Cabrero et al. , 2013 ^5.

Modificaciones, solución de problemas, componentes adicionales y pasos críticos

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
CaCl2	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
KCl	prolabo	26 764.298	normapur
MgCl2	prolabo	25 108.295	normapur
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
dental glue	3M ESPE™	46954	Protemp IV
silicon glue	3M ESPE™	36958	Express 2 Regular Body Quick
tape	3M Scotch	122s	3M Scotch Magic Tape
pipette tips	Corning Incorporated	4868	100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)			hand made
incubation box			hand made
forceps (No. 5)	Fine Science Tools	11252-00	Micro-dissecting forceps
curved forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Micro-dissecting forceps
glue applicator			hand made
knife	Fine Science Tools	10316-14	5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (cooled to -80 °C)
Microscope	Nikon		Eclipse-E800
immersion objective lens	Nikon		20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III		leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box	Science Wares		Custom built by Science Wares
peristaltic pump	Gilson		Minipuls 2
tubing	Fisher Scientific	depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system	Warner	64-0135  (VC-66CS)	Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2	Martin et al., 2007, Ref. 1	N/A	No stocks {currently} publicly available
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP	B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.	(STOCK #1117340)	pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2	Lima and Misenboeck, Ref. 11	N/A	No stocks {currently} publicly available
OK107	Bloomington stock center	854	http://flystocks.bio.indiana.edu/