In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Resumo

Aqui nós apresentamos um romance Ca ²⁺ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca ²⁺ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

Resumo

Funcional em imagiologia in vivo tornou-se uma abordagem poderosa para o estudo da fisiologia e função de células e estruturas de interesse cerebrais. Recentemente, um novo método de Ca ²⁺ -Imaging utilizando o repórter GFP-aequorina bioluminescente (GA) foi desenvolvido. Esta nova técnica baseia-se na fusão dos genes GFP e aequorina, produzindo uma molécula capaz de ligação de cálcio e - com a adição de celenterazina seu cofactor - emissor de luz brilhante que pode ser monitorizado através de um colector de fotões. As linhas transgénicas que transportam o gene de GFP-aequorina foram gerados para ambos os ratos e de Drosophila. Em Drosophila, o gene GFP-aequorina foi colocado sob o controlo do sistema de expressão binário de GAL4 / UAS permite a expressão específica e de imagem no interior do cérebro. Este método tem sido mostrado subsequentemente que ser capaz de detectar tanto para dentro ^de Ca2 + e Ca ²⁺ -transients -released interiores de lojas. Mais importante que permite uma maior duração em gravação contínua, imagens em maiores profundidades no interior do cérebro, e gravar em altas resoluções temporais (até 8,3 ms). Aqui nós apresentamos o método básico para usar a imagem de bioluminescência para registrar e analisar Ca ²⁺ -Atividade dentro dos corpos de cogumelo, uma estrutura central para o aprendizado e memória no cérebro da mosca.

Introdução

A padronização e função de atividade dentro do cérebro e suas estruturas discretas fundamentais são há muito tempo uma área de intenso estudo no campo da neurociência. Talvez algumas das primeiras abordagens de sucesso utilizadas para resolver este problema foram mensuração fisiológica direta da mudança na atividade elétrica - métodos no entanto alternativas que permitem imagens ao vivo de alterações nas concentrações de tensão, de pH ou de cálcio (como proxy para a atividade) trouxe recursos adicionais para o estudo da actividade neuronal ^1. Técnicas de imagem transportar uma grande variedade de vantagens, tais como a redução da capacidade de invasão e a capacidade de monitorar a atividade dentro de estruturas inteiras do cérebro. Além disso, em animais com genética tratáveis, incluindo a mosca da fruta Drosophila, desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados, como cameleon, GCaMPs e outros ¹ permitiram que os pesquisadores para monitorar neurônios individuais, populações neuronais e do cérebro inteiroestruturas. Enquanto métodos de imagem de cálcio fluorescentes tradicionais mais usando GCaMPs (GFP fundido a calmodulina) ou FRET (PCP e YFP fundido a calmodulina) provaram ser técnicas úteis que fornecem boa resolução espacial e temporal, o processo subjacente de excitação luz gera algumas limitações em seu experimental aplicações. Devido à natureza da luz de excitação, a autofluorescência, foto-branqueamento, e fototoxicidade é inevitavelmente produzido, o que, por conseguinte, limita a profundidade das estruturas que podem ser visualizados, a duração de gravação assim como a continuidade de gravação em tempo real. Em outras palavras, as gravações deve frequentemente ser executada de forma intermitente a fim de evitar estes efeitos secundários indesejáveis.

Devido a estes desafios, foram desenvolvidos métodos alternativos adicionais de imagiologia de cálcio. Um dos métodos mais promissores é imagiologia bioluminescente, que depende da luz produzida por meio de uma reacção enzimática após ligação ao cálcio. Bioluminescent de imagem não requer luz de excitação e, consequentemente, não experimenta as mesmas dificuldades que imaging cálcio convencional. O repórter bioluminescente Aequorina - isolado de Aequorea victoria, o mesmo Jellyfish a partir do qual GFP também foi isolated- liga de cálcio através dos seus três estruturas mão EF e sofre uma mudança conformacional, levando a oxidação do seu coelenterazina cofator ea liberação de luz azul (λ = 469 nm) ^{de 2,3.} A Aequorina tem uma afinidade muito baixa para o cálcio (K _d = 10 uM) que o torna ideal para monitorizar transientes de cálcio porque produz muito pouco barulho de fundo e não interfere com o sistema de tamponamento de cálcio intracelular ^4. Embora aequorina tenha sido previamente utilizado para monitorizar o processo de indução neural no ovo de Xenopus ⁵ a luz produzida é muito fraca a ser usado para imagiologia de actividade neuronal em tempo real. Em um esforço para enfrentar este desafio, Philippe Br &# 251; deixe e seus colegas do Instituto Pasteur criou uma construção genética de fusão GFP e a aequorina genes, imitando o estado nativo dentro da água-viva ^4. Este produto génico de fusão se liga a cálcio de novo através das três estruturas de mão EF de aequorina, que sofre uma alteração conformacional que conduz à oxidação da coelenterazina, o que transfere energia não radiativamente para o GFP. Esta transferência de energia resulta na liberação de luz verde (λ = 509 nm) da GFP, em vez de luz azul do aequorin. A fusão de GFP e aequorin também confere maior estabilidade da proteína ajudando a proteína de fusão produzir luz de 19 a 65 vezes mais brilhante do que a aequorina sozinha ^4. Usando uma abordagem bioluminescente dentro do cérebro expande a aplicação experimental corrente de imagiologia de cálcio, tanto em termos de duração de gravação contínua e o número de estruturas dentro do cérebro que pode ser gravada. Em termos gerais no contexto do trabalho anterior, isso significa que ambos global e uma maiorvariedade de "actividade" regionalizada do cérebro pode ser monitorizada (por meio do proxy de transientes de cálcio). Mais importante actividade pode ser monitorizada por mais tempo, em tempo real e uma base contínua, que se presta facilmente à busca de uma compreensão completa da função basal no cérebro.

Nos últimos anos, o nosso laboratório e outros desenvolveram moscas transgénicas que expressam a GFP-aequorina sob o controlo do sistema de expressão binário (GAL4 / UAS-GFP-aequorina) ^5,6. Usámos GFP-aequorina bioluminescência para a actividade ficha produzido por estímulos naturais, tais como aroma ^{de 7,8,} bem como os componentes celulares estudadas moduladores ^Ca2 + -Atividade nos corpos de cogumelo seguintes estimulação do receptor de acetilcolina nicotínico por aplicação directa ^9. Além disso, temos também usado GFP-aequorina para abordar uma série de questões experimentais que não puderam ser abordadas anteriormente, como a longo prazoimagens de transientes de cálcio espontâneas e visualização de estruturas mais profundas do cérebro ^10. Mais recentemente, temos utilizado o sistema / UAS GAL4 para expressar o receptor de mamífero ATP P2X _{² 11} um canal de cátions, nos neurônios de projeção (PNs) e utilizado o sistema de LexA para expressar GFP-aequorina nos corpos de cogumelo (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a cortesia de B. Pfeiffer, Janelia Quinta, EUA). Isto permitiu-nos para ativar as PNs através da aplicação de ATP, que por sua vez ativa os corpos de cogumelo (um alvo a jusante da PNs), imitando condições mais naturais, como a resposta a um estímulo odor. No geral, esta técnica que combina P2X _{2 e} GFP-aequorina amplia as possibilidades experimentais. Em termos gerais, oferece a oportunidade de compreender melhor os padrões de atividade no cérebro, dando início a novos estudos sobre como os diferentes estímulos e perturbações podem alterar o padrão basal de atividade.

Protocolo

1. Preparação de Amostras

1. Preparação das soluções e configurar
   1. Manter todas as linhas de Drosophila melanogaster a 24 ° C em meio padrão comida. Traseira e mantê-los em baixa densidade no frasco para gerar tamanho padronizado e peso de moscas.
      1. Adicionar 10 fêmeas virgens com 10 homens em um frasco, deixá-los acasalar e transferi-los a cada 2 dias para um novo frasco. Em seguida, 10 dias mais tarde, quando as moscas começar a EFeche, colher as moscas a cada dia. Mantenha um registro preciso da idade das moscas e mantê-los em boas condições.
      2. No dia 3, separar os machos das fêmeas e manter as moscas fêmeas 20 por frasco. Grave as moscas em 4 ou 5 dias de idade.
   2. Preparar a solução de Ringer com as seguintes concentrações: 130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 _mM de MgCl2, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de HEPES, e 36 mM de sacarose e ajustar o pH da solução precisamente a 7,3. Preparar soluções de perfusão de 25 μ; M nicotina e KCl 100 mM em solução de Ringer.
   3. Prepare 1.000 ponteira ul: utilizando uma forma de ponta de lâmina de barbear para uma inclinação (cerca de 35 ° a partir do final de ponta) e remover o excesso de base para além de 1 ½ centímetros da ponta.
   4. Caixa para armazenamento (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) de amostra preparar durante a incubação. Colocar duas esponjas (12 cm x 8 cm x 3 cm) saturado com água no fundo [para evitar a dessecação da amostra] abaixo de um aparelho de cremalheira pequena para colocar em amostras como a sua preparação é completada.
   5. Preparar amostras moscas de modo que eles contêm pelo menos um exemplar do UAS-GFP-aequorina e uma cópia de uma linha de Gal4 para conduzir a expressão de GFP-aequorina de. Linha OK107 Gal4 (a expressão linha de condução principalmente nos corpos de cogumelo) é cruzada com UAS-GFP-aequorina nesta preparação.
      NOTA: O interior da caixa deve ser impermeável e exterior deve bloquear a luz a partir da caixa de entrar para evitar a degradação do coelenterazina durante a incubação.
2. Preparaçãoprepara- das amostras
   1. Gelo anestesiar Drosophila, transferindo-a para um frasco de vidro e manter em gelo durante 2 min antes de ser movido para o prato de Petri arrefecida para posicionamento na ponta da pipeta. Prepare pontas de pipeta em papel de filtro umedecido ligeiramente em 100 ml placa de Petri no gelo sob o microscópio de dissecação.
   2. Suavemente com uma pinça lugar voar dentro da ponta da pipeta.
   3. Usando um pincel empurre e alinhar mosca de tal modo que a cabeça está completamente além da borda de ponta e região dorsal é parcialmente exposta pela seção removida durante ponta shaping (Figura 2B).
   4. Combinar um pequeno (cerca de 3-4 ul) porções dos dois componentes da cola dentária. Aplique a cola cuidadosamente ao redor da frente e de trás da cabeça e pescoço para baixo e ao redor da borda ponta da pipeta - evitando a coroa da cabeça. Deixe a cola seca durante 2 min.
   5. Ponta lugar pipeta com mosca colada através do furo na câmara de gravação (Figura 2D) e gently pressione para fixar no lugar.
   6. Combinam-se as duas componentes de cola de silicone (cerca de 3-4 ul). Aplique cola no lado plano da câmara ao longo da borda onde a câmara e ponteira se reúnem para evitar vazamento de solução de Ringer. Deixe a cola seca durante 2 min.
3. Dissecação
   1. Apor fita sobre o canal de perfusão, a borda curta e que se estende para a parte de trás da câmara.
   2. Coloque câmara com a mosca na quadra dissecção sob o microscópio por sua vez, na lâmpada fluorescente. Pipetar 1 mL de solução de Ringer para dentro da câmara.
   3. Use bisturi fino para remover a cutícula. Fazer incisões paralelas a partir da parte de trás da cabeça para a região antenal. Em seguida, corte ao longo da borda do olho, em seguida, fazer uma incisão perpendicular acima antena conectando as incisões anteriores. Adicione uma incisão paralela final para que na parte de trás da cabeça. Use as belas pinça afiada para remover a cutícula (Figura 2C).
   4. Use uma pinça afiada multa para agarrar suavemente umd limpar exposto tecido respiratório até o cérebro e [fluorescente] corpo cogumelo é claramente visualizado.
   5. Use uma pinça de ultra-afiada para captar com cuidado e beliscar neuroepitelial tecido que cobre o cérebro para permitir a permeação da coelenterazina.
      NOTA: Como alternativa papaína pode ser usado para permeabilizar a neuroepithelia ^9.
   6. Usando uma pipeta, lavar duas vezes com solução de Ringer para remover qualquer resíduo de dissecção e lugar de exemplo na caixa escura.
   7. Pipetar 1 mL de solução de Ringer contendo 5 uM benzil-coelenterazina para dentro da câmara. Fechar a caixa e permitir que a incubação com coelenterazina à temperatura ambiente durante um mínimo de 2 horas.

2. Criação de Imagens

1. Configuração
   1. Comece sistema de gravação: ligar microscópio, computador, câmera e sistema de drenagem e sala de definir controles ambientais até 25 ° C.
   2. Abrir Medição e programa Automation Explorer no computador. Clique em “ dispositivos e interfaces ", em seguida, clique duas vezes no" Ni Devices Movimento "e clique finalmente à direita na"-7334 PCI "e selecione" dispositivo inicializar ".
   3. Abra Photon Imager. Criar uma nova pasta eo nome do primeiro arquivo de gravação. Câmara deve atingir -80 ° C antes de sistema funcionará.
   4. Configure o sistema de perfusão - adicionar KCl, nicotina e solução de Ringer para reservatórios e ajustar para cada solução as descargas a 2 ml / min. Lava-se com solução de Ringer antes de iniciar o experimento.
2. Prepare amostra
   1. Montar lugar imaging bloco prato no monte sob o microscópio com uma ampliação de 5X e inserir tubo de perfusão no canal através de punção.
   2. Defina para o modo de microscópio fluorescente, em seguida, centro e trazer corpos de cogumelo (MB) em foco. Ajuste de 20X e centro-re e foco.
   3. Posição aparelho de drenagem sobre a associação de drenagem, ajustar a altura da derivação de drenagem para que a ponta é apenas above piscina, e executar a solução de Ringer durante 30 segundos para garantir uma drenagem adequada.
   4. Puxe para baixo escudo para lacrar aparelhos da luz. Usando o sistema automatizado em fóton imager fazer ajustes finos para o foco e dar uma imagem de referência fluorescente dos MBs.
3. Gravação
   1. Ajuste a velocidade do fóton para velocidade de gravação desejada (de 50 ms até 1 segundo ou mais). Selecione o modo de fótons e obturador aberto. Genótipo Record, sexo, idade e número da amostra nas entradas do registro. Ajuste caixas posição ROI mais de cálice e corpos celulares (CCB) e lobos medial ao clicar nas caixas de ROI e arrastando enquanto mantém controle.
   2. Ficha de linha de base durante cerca de 5 a 10 min (se for o caso).
   3. Aplicar nicotina durante 1 min. Nota iniciar / parar em log. Lava-se com solução de Ringer durante 5 min.
   4. Espere 5 minutos para a recuperação e preparar KCl entrada de log e timer.
   5. Aplicar KCl durante 1 min. Nota iniciar / parar em log. Lava-se com solução de Ringer durante 1 min.
   6. Interruptorpara o modo fluorescente, dê imagem fluorescente final, e desligue a solução de Ringer.
   7. Pressione o botão "Stop". Caixa de diálogo irá pedir para desligar o sistema. Selecione "Não" para continuar a gravação.
   8. Abrir escudo, sistema de drenagem movimento, lente objetiva interruptor para 5X, remover o tubo de perfusão. Retirar da amostra / gravação prato do palco, limpar lente 20X lavando e limpando a lente duas vezes com água.
   9. Pressione o botão branco jogo no topo da janela do programa para iniciar a próxima gravação.

3. Análise e Criação de Vídeo

1. Extrair valores de fótons
   1. Abra o programa de análise de fóton (por exemplo, Photon Viewer) e aberto arquivo de planilha primeira amostra.
   2. Selecione a guia de controle de exibição. Selecione o ROI clicando na região, mantendo o controle. Ajuste o tamanho, a orientação ea forma de regiões de interesse para abranger GFP CCB iluminado e lobos medial.
   3. Adicionar uma adiçãoal ROI, clicando em "Definir ROI" e clicando e arrastando na tela para criar o novo ROI.
   4. Selecione a aba "Filme" para reproduzir vídeo fóton. Ajuste "width sec" e "passos SEC" como desejado. Reajuste colocação ROI conforme necessário.
   5. Selecione capturas de tela representativas de fluorescência da GFP, a resposta nicotina e resposta KCl. Imagem pasta screenshots de culturas e em uma apresentação de slides para posterior análise e comparação.
   6. Ajuste tanto a "largura sec" e "segundo passo" para a velocidade de gravação em segundos. Selecione duração da análise movendo marcadores de cinza no painel superior para a região do suporte antes do início do estímulo e apenas após o fim resposta.
   7. Selecione "Suspender vistas ao jogar" imprensa "<< REW" e pressione "PLAY>". Selecione a aba "Contagem Taxa Chart" e unidades de ajustar conforme desejado e cores de linha para combinar a cor ROI.
   8. Quando a análise é terminada, Pressione "Contagem Export Data Rate". Selecione capturas de tela do combinado gravações CCB e região do lóbulo medial do interesse de cada lado. Imagem pasta screenshots de culturas e em um slide com imagens de resposta. Este slide será utilizada mais tarde na análise final.
2. Exemplo Análise: um método para a análise de dados de fotões extraídos detalhados
   1. Abra os arquivos de planilha na pasta "Contagem Taxa de Exportações".
   2. Reformatar as células da primeira coluna denominada tempo para exibir a hora em hora e minutos.
   3. Referência a lâmina correspondente para a amostra. Remova todos os valores, exceto as colunas para o tempo e os dois representante ROIs.
   4. Determinar estimulação nicotina hora de início - disponível em arquivo de log na entrada principal pasta- remover dados adicionais antes de iniciar ou valor de realce.
   5. Encontre mais alto / valor de pico tanto para CCB e lóbulo medial e marca / highlight.
   6. Determinar início de resposta e tempo do fim para ambosCCB e lóbulo medial através da criação de uma estimativa utilizando ponto de tempo de resposta correspondente representada graficamente no slide e selecione valor real pela mudança de valores na proximidade com esses pontos. Destaque a região entre esses pontos, tanto no CCB e lobos medial. Como alternativa, use uma macro ^9.
   7. Combine todas as amostras de um grupo experimental em uma nova planilha.
   8. Alinhar no pico através da determinação do valor de linha é para cada valor de pico CCB. Subtrair os valores mais baixos a partir do mais alto valor de linha para determinar o valor aproximado linha onde os dados da amostra devem ser copiados novamente para. Verificar que todos os valores de pico estão alinhados.
   9. Copie a folha duas vezes e apagar tanto as colunas lóbulo medial ou as colunas CCB criação de páginas de única CCB ou valores lóbulo medial.
   10. Remover dados após as todas as respostas CCB ter terminado. Criar quatro linhas rotulado Total de fótons, a resposta de comprimento (duração), pico de amplitude e latência de resposta. Copie e cole este novamente abaixo dos originais.
   11. Use a função SUM para determinar total de fótons durante a resposta. Use a função COUNT para determinar o comprimento da resposta. Copie e vincular mais alto célula de valor para determinar o valor de amplitude de pico. Use função COUNT - seleccionar a partir do início da perfusão de nicotina para o início da resposta - para determinar a resposta de latência.
   12. Copiar valores usando a função de ligação e multiplicar (todos exceto amplitude máxima) pela gravação velocidade em segundos.
   13. Gráficos Bar / caixa pode ser criada para os parâmetros calculados, como Total de Fótons, Peak Amplitude e Response Corpo, se assim for desejado (ex .: Figura 5B, C, D).
   14. Na coluna após a resposta de fotões de dados em bruto, a média dos pontos de dados em bruto para cada ponto de tempo utilizando a função média. Se desejado seguimento com uma coluna de determinar o erro padrão da média (SEM), para cada um dos valores de fotões em média de um ponto de tempo.
   15. Use a coluna média para construir um profil médio de respostae [Graph] para o grupo de amostra CCB. Para fazer isso, selecione a coluna que especifica o tempo que os valores do eixo-x da coluna e dos valores médios de fótons como o eixo-y e, finalmente, selecionar a ferramenta scatterplot criação gráfico.
   16. Repetir este procedimento de análise com os dados dos lobos mediais.
3. Criando imagens para o vídeo
   1. Visualizador de fóton aberto.
   2. Selecione a guia de controle de exibição. Clique em ROI, mantendo controle para selecionar, remover e / ou minimizá-la.
   3. Modificar "width sec" (tempo de acumulação) como desejado para determinar o conteúdo de cada quadro.
   4. Modificar "sec passo" para definir a sobreposição de cada quadro.
   5. Selecione "visões de exportação durante a reprodução de" pressionar "<< REW" e "PLAY>". As imagens para o vídeo será exportada para a pasta "Vista exportações" como uma série de arquivos de .png.
4. Usando Virtual Dub para fazer vídeo: um método para vídeo creation detalhada
   1. Crie uma nova pasta chamada "resultats" na pasta vista exportações que contém as imagens.
   2. Traga de script (renommer.VBS) para a pasta de imagens.
   3. Clique duas vezes em renommer.VBS para ser executado.
   4. Imagens serão automaticamente renomeados numericamente e copiados para a pasta "resultats".
   5. Abrir VirtualDub.exe.
   6. Selecione o arquivo de vídeo aberto - selecione primeira imagem (imagens subsequentes será carregado automaticamente).
   7. Selecionar vídeo - selecione a velocidade de fotogramas ajustar conforme desejado.
   8. Selecionar vídeo - selecione compressão selecione Cinepak Codec pelo raio.
   9. No arquivo AVI selecione Salvar como o vídeo será criado automaticamente.

Resultados

A fusão de GFP a aequorina permite visualizar a região de interesse antes da imagem de bioluminescência através da excitação de GFP em modo fluorescente no microscópio (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Uma das maneiras mais simples para estimular os corpos de cogumelo é através da activação dos receptores nicotínicos de acetilcolina ionotrópicos. Embora a acetilcolina é o ligando endógeno deste receptor, descobrimos que a nicotina produz respostas mais reprodutíveis nos corpos de cogumelo. Isto ?...

Discussão

A abordagem de GFP-aequorina à base bioluminescente recentemente desenvolvido aqui apresentada permite a gravação funcional in vivo de Ca ²⁺ -Atividade em diferentes neurónios, assim como, se desejado, em outro tipo de células, tais como células estreladas rim como relatado em Cabrero et ai. de 2013 ^5.

Modificações, resolução de problemas, componentes adicionais e etapas críticas

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
CaCl2	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
KCl	prolabo	26 764.298	normapur
MgCl2	prolabo	25 108.295	normapur
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
dental glue	3M ESPE™	46954	Protemp IV
silicon glue	3M ESPE™	36958	Express 2 Regular Body Quick
tape	3M Scotch	122s	3M Scotch Magic Tape
pipette tips	Corning Incorporated	4868	100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)			hand made
incubation box			hand made
forceps (No. 5)	Fine Science Tools	11252-00	Micro-dissecting forceps
curved forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Micro-dissecting forceps
glue applicator			hand made
knife	Fine Science Tools	10316-14	5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (cooled to -80 °C)
Microscope	Nikon		Eclipse-E800
immersion objective lens	Nikon		20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III		leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box	Science Wares		Custom built by Science Wares
peristaltic pump	Gilson		Minipuls 2
tubing	Fisher Scientific	depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system	Warner	64-0135  (VC-66CS)	Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2	Martin et al., 2007, Ref. 1	N/A	No stocks {currently} publicly available
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP	B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.	(STOCK #1117340)	pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2	Lima and Misenboeck, Ref. 11	N/A	No stocks {currently} publicly available
OK107	Bloomington stock center	854	http://flystocks.bio.indiana.edu/