生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

要約

ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa ²⁺を提示します。このアプローチは、Ca ²⁺に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。

要約

in vivoイメージングにおける機能は、脳細胞や興味の構造の機能と生理学を研究するための強力なアプローチとなっています。最近、生物発光レポーターGFP-エクオリン（GA）を用いて、-imaging ^の Ca 2+新しい方法が開発されました。その補因子セレンテラジンを添加した - - 光子コレクタを介して監視することができ、明るい光を発するこの新しい技術は、カルシウムと結合することができる分子を産生する、GFPおよびエクオリン遺伝子の融合に依存しています。 GFP-エクオリン遺伝子を有するトランスジェニック系統は、マウスやショウジョウバエの両方のために生成されている。 ショウジョウバエでは、GFP-エクオリン遺伝子は、脳内の標的発現とイメージングを可能にするGAL4 / UASバイナリ発現系の制御下に置かれています。この方法は、その後に検出することが可能であることが示されている両方のCa ²⁺内側に-transientsと^Ca 2+が内部店から-released。最も重要なことは、連続記録でより長い期間を可能にする脳内の大きい深さでのイメージング、および（8.3ミリ秒まで）高時間分解能での記録。ここでは、キノコ体の中にハエの脳内の学習と記憶の中心構造を^の Ca 2+ -活性を記録し、分析するために生物発光イメージングを使用するための基本的な方法を提示します。

概要

脳とその離散構造内の活動の基本的なパターニングおよび機能は、長い神経科学の分野内の強烈な研究分野となっています。おそらく、この問題に対処するために使用される最も初期の成功のアプローチのいくつかは、電気的活動の変化の直接的な生理学的測定した - への追加機能を持ってきた（活性のためのプロキシとして）電圧、pHまたはカルシウム濃度の変化のライブイメージングを可能にするが、代替の方法は、神経活動¹の研究。イメージング技術は、減少侵襲性および全脳構造内のアクティビティを監視する能力などの利点の広い配列を運びます。また果物ショウジョウバエを飛ぶなど、扱いやすい遺伝学と動物では、そのようなカメレオン、GCaMPs、その他^1と遺伝的にコードされたカルシウム指標の開発は、研究者は、単一ニューロン、ニューロン集団と脳全体を監視することができました構造。 GCaMPs（GFPはカルモジュリンに融合）またはFRET（CFPとYFPがカルモジュリンに融合された）を使用して、より伝統的な蛍光カルシウムイメージング法は、良好な空間と時間分解能を提供する有用な技術であることが証明されているが、光励起の基本プロセスは、実験的に、いくつかの制約がengendersアプリケーション。光による励起、自家蛍光、光退色、及び光毒性の性質上避けられない結果的に画像化することができる構造の深さ、記録の期間だけでなく、記録のリアルタイムの継続を制限する、製造されています。つまり、録音は、多くの場合、これらの望ましくない副作用を回避するために、断続的に実行する必要があります。

なぜなら、これらの課題の、カルシウムイメージングのさらなる代替的な方法が開発されています。最も有望な方法の一つは、カルシウムが結合した後、酵素反応によって生成される光に依存している生物発光イメージングです。 Bioluminescenトンイメージングは​​、光励起を必要とせず、その結果、従来のカルシウムイメージングと同じ問題が発生しません。生物発光レポーターイクオリン- オワンクラゲから分離し、λ（、GFPはまたisolated-たのと同じクラゲは、その3 EFハンド構造を経由して、カルシウムを結合し、その補因子セレンテラジンの酸化と青色光の放出をもたらす、構造変化を起こします= 469 nm）の^2,3。エクオリンは、それが非常に少ないバックグラウンドノイズを生成し、細胞内カルシウム緩衝系⁴と干渉しないため、カルシウムトランジェントを監視することが理想的カルシウム（K _dを = 10μM）に対して非常に低い親和性を有します。エクオリンは、以前にアフリカツメガエルの卵^5の神経誘導の過程をモニターするために使用されてきたが生成された光は、ニューロンの活動のリアルタイムイメージングのために使用するにはあまりに暗いです。この課題、フィリップのBr＆に対処するための努力の中で＃251;てみましょうと、パスツール研究所の同僚はクラゲ⁴内の天然の状態を模倣する、GFPおよびエクオリン遺伝子を融合遺伝子構築物を作成しました。この融合遺伝子産物は、GFPに非放射エネルギーを転送セレンテラジンの酸化につながる構造変化を起こし、エクオリンの3 EFハンド構造を介して再びカルシウムをバインドします。代わりに、エクオリンからの青色光のGFPからの緑色光（λ= 509 nm）でのリリースでは、このエネルギー移動の結果、。 GFPとエクオリンの融合はまた、単独の⁴イクオリンよりも19〜65倍明るい融合タンパク質の生産の光を助けるより大きなタンパク質の安定性を付与します。脳内の生物発光のアプローチを使用すると、連続記録の期間および記録することができる脳内の構造体の数の点では両方のカルシウムイメージングの現在の実験のアプリケーションを拡張します。大まか前作の文脈では、両方のグローバルと大きいことを意味します脳の地域化「活性」の様々な（カルシウム過渡応答のプロキシを介して）監視することができます。さらに重要な活動は容易に脳における基底関数の完全な理解の追求に役立つリアルタイムかつ継続的に、より長くのために監視することができます。

ここ数年では、私たちの研究室などがバイナリ発現系の制御下でGFP-エクオリン（GAL4 / UAS-GFP-エクオリン^{）5,6を発現するトランスジェニック}ハエを開発しました。私たちは、このような香り^7,8と同様に、直接ニコチンアプリケーション⁹によりアセチルコリン受容体刺激後のキノコ体中のCa ²⁺ -活性を調節する細胞成分を研究などの自然の刺激によって生産活動を記録するために、GFP-エクオリン生物発光を使用しています。また、我々はまた、長期のような以前に対処することができていない実験的な質問の数に対処するために、GFP-エクオリンを使用していました自発的カルシウムトランジェントと深い脳構造の視覚化^10の撮像 。最近では、我々は、投射ニューロン（PNS）で、哺乳類のATP受容体P2X ₂ ¹¹陽イオンチャネルを発現することがGAL4 / UASシステムを使用し、キノコ体（MB247-のLexA中のGFP-エクオリンを表現するのLexAシステムを使用していました13XLexAop2-IVS-G5A-BP）（B.ファイファー、Janeliaファーム、米国）の礼儀。これは、私たちは、このような匂い刺激に対する応答として、より自然条件を模倣し、今度はキノコ体（PNSの下流の標的）を活性化ATPの適用により手形債権を活性化することができました。全体的にこのP2X _{2を組み合わせた}技術およびGFP-エクオリンは、実験の可能性を拡張します。広義には、活動の基礎パターニングを変更することができますどのように異なる刺激と摂動についての新しい研究を開始し、より良い脳の活動のパターンを理解する機会を提供しています。

プロトコル

試料の調製

1. ソリューションの作成と設定
   1. 標準の食品媒体に24℃ですべてのキイロショウジョウバエのラインを維持します。ハエの標準化されたサイズと重量を生成するために、バイアルに低密度でそれらを維持し、背面。
      1. バイアル中の10人の男性と10処女雌を追加し、それらを交尾させ、新鮮なバイアルに2日おきにそれらを転送します。ハエが孵化するために起動したときに続いて10日後に、毎日ハエを収穫。ハエの年齢の正確な記録を維持し、良好な状態で保管してください。
      2. 3日目に、女性から男性を分離し、女性に1バイアル当たり20ハエを保ちます。 4、5日齢でハエを記録します。
   2. 以下の濃度でリンゲル液を準備します。130のNaCl、5mMのKCl、2のMgCl _2、2mMの_CaCl 2を、5 mMのHEPES、および36mMのスクロースと正確に7.3に溶液のpHを調整します。 25μの灌流溶液を調製します;リンゲル液中のMニコチン及び100mMのKCl。
   3. 斜めに（先端の端から約35°）をカミソリの刃の形状チップを使用し、先端から1½センチを超えて過剰の塩基を除去：1,000μlのピペットチップを準備します。
   4. インキュベーション中にサンプルを保存するための箱（23センチメートルX 17センチメートルX 8.5センチメートル）を準備します。置き2のスポンジ（12×8 cmでcmで×3 cm）を、それらの準備が完了するようにサンプルを配置するために小型の装置ラックの下に[サンプル乾燥を防ぐために、ボトムに水で飽和させました。
   5. これらは、GFP-エクオリンの発現を駆動するために、UAS-GFP-エクオリンとのGal4ラインのコピーの少なくとも1コピーを含むように、ハエのサンプルを準備します。 OK107のGal4ライン（主にキノコ体のライン駆動式）がこの製剤にUAS-GFP-エクオリンと交配されます。
      注：ボックスの内側には防水でなければならず、外側はインキュベーション中にセレンテラジンの劣化を防止するために、ボックスに入るの光を遮断しなければなりません。
2. 予備校サンプルのaration
   1. 氷をガラスバイアルに移すことによって、ショウジョウバエを麻酔し、ピペットチップ内に位置決めするために冷却したペトリ皿に移動される前に、2分間氷上に保ちます。解剖顕微鏡下で氷の上で100ミリリットルのペトリ皿に少し湿らせたろ紙上にピペットチップを準備します。
   2. 静かに鉗子場所にピペットチップの内側に飛びます。
   3. そっと押して、頭が先端の端を越え、完全であり、背部が部分的に先端整形（ 図2B）の間に除去部により露出するようにフライを揃えるブラシを使用しました。
   4. 歯科接着剤の二つの成分の小さい（約3〜4μL）部分を結合します。ピペットチップのエッジにと周りにダウン前面と背面の頭と首の周りに慎重に接着剤を適用します - 頭の冠を回避することができます。 2分間の接着剤が乾燥してみましょう。
   5. 記録チャンバー（ 図2D）とGENの穴に接着されたフライのある場所ピペットチップTLYの場所に固定するために押します。
   6. シリコン接着剤（約3〜4マイクロリットル）の2つのコンポーネントが結合します。室とピペットチップは、リンゲル液の漏れを防止するために会う縁に沿って室内の平らな面に接着剤を適用します。 2分間の接着剤が乾燥してみましょう。
3. 解剖
   1. 灌流チャネルを介してテープを貼って、短辺及び室の背面に拡張します。
   2. 蛍光灯の顕微鏡ターンの下で解剖台のフライと室を置きます。ピペット室へのリンゲル液の1ミリリットル。
   3. キューティクルを除去するために、細かい手術用メスを使用してください。触角の領域に頭の後ろから並列の切開を行います。その後、前の切開部を接続するアンテナ上の垂直切開を行い、目の縁に沿って切断。頭の後ろのそれへの最終的な切開を平行にしてください。キューティクル（ 図2C）を除去するために細かい鋭いピンセットを使用してください。
   4. 静かに把握する細かい鋭いピンセットを使用してください脳と[蛍光]キノコ体が明確に可視化されるまで離れて露出した呼吸組織をクリアdは。
   5. 慎重に把握し、セレンテラジンの浸透を可能にするために脳を覆っている神経上皮組織を挟ま超鋭いピンセットを使用してください。
      注：またはパパインneuroepithelia ^9を透過するために使用することができます。
   6. ピペットを用いて、解剖から任意の破片を除去し、暗箱内のサンプルを配置するためにリンゲル溶液で2回洗い流します。
   7. ピペットでチャンバー内に5μMベンジルセレンテラジンを含むリンゲル液の1ミリリットル。ボックスを閉じて、2時間の最小室温でセレンテラジンとのインキュベーションを可能にします。

2.イメージング

1. セットアップ
   1. システムの記録を開始：25℃に顕微鏡、コンピュータ、カメラや排水システムの電源をオンにし、設定室内環境制御。
   2. コンピュータで開い計測およびオートメーションエクスプローラプログラム。クリック ＆＃8220;デバイスとインタフェース」、その後をダブルクリックし、「NIモーションデバイス」との最後に右クリックし、「PCI-7334」を選択し ""デバイスを初期化。
   3. フォトンイメージャを開きます。新しいフォルダを作成し、最初の記録ファイルに名前を付けます。システムが機能するためにカメラを-80℃に到達しなければなりません。
   4. 灌流システムのセットアップ - のKClを追加し、ニコチン、および貯水池にリンゲル液をインクルードし、各溶液を2 ml /分で放電ように調整。実験を開始する前リンゲル液で洗います。
2. サンプルを準備します
   1. 場所イメージングは​​5倍の倍率で顕微鏡下でマウント上にブロック皿をマウントし、穿刺を通してチャンネルに灌流チューブを挿入します。
   2. その後、蛍光モードに顕微鏡を設定し、中心と焦点にキノコ体（MBS）をもたらします。 20Xおよび再中心と焦点を調整します。
   3. 先端があるように排水プールの上に位置排水装置は、ちょうどabov排水シャントの高さを調整Eのプール、十分な排水を確保するために30秒間リンゲル液を実行します。
   4. 光から装置を密封するためにシールドをプルダウン。光子イメージャに自動化システムを使用して、フォーカスの微調整を行い、MBの参照蛍光画像を取ります。
3. レコーディング
   1. （1秒以上まで50ミリ秒から）所望の記録速度に光子の速度を調整します。フォトンモードとオープンシャッターを選択します。レコード遺伝子型、性別、年齢、およびログエントリのサンプル数。 ROIボックスをクリックし、コントロールを押しながらドラッグすることで、がくと細胞体（CCB）と内側ローブの上に位置ROIボックスを調整します。
   2. 約5〜10分間の録音のベースライン（希望として）。
   3. 1分間のニコチンを適用します。ログに開始/停止に注意してください。 5分間リンゲル液で洗浄します。
   4. 回復のために5分待ってから、塩化カリウムログエントリとタイマーを準備します。
   5. 1分間のKClを適用します。ログに開始/停止に注意してください。 1分間のリンゲル液で洗います。
   6. スイッチ蛍光モードに、最終的な蛍光画像を取り、リンゲル液をオフにします。
   7. 押し、「停止」。ダイアログボックスには、システムを遮断するように依頼します。記録を継続するために「いいえ」を選択します。
   8. オープンシールド、灌流チューブを取り外し、5倍に排水システム、スイッチレンズ対物レンズを移動させます。段階からサンプル/記録皿を取り出し、水で2回レンズをすすぐと拭いて20Xレンズをきれいに。
   9. 次の記録を開始するために、プログラムウィンドウの上部にある白い再生ボタンを押します。

3.分析とビデオの作成

1. 光子値を抽出
   1. 光子解析プログラム（例えば、フォトンビューア）を開き、最初のサンプルのスプレッドシートファイルを開きます。
   2. 表示制御]タブを選択します。コントロールを押しながら地域をクリックすることでROIを選択します。 GFP照らさCCBと内側ローブを包含するように関心領域の大きさ、向きや形状を調整します。
   3. さらに追加アルROI「投資収益率の定義」をクリックし、クリックして新しいROIを作成するために、画面上でドラッグすることもできます。
   4. 光子動画を再生するには「ムービー」タブを選択します。必要に応じて、「秒幅」と「秒のステップ」を調整してください。 ROIの配置は、必要に応じて再調整します。
   5. GFP蛍光、ニコチン応答とのKCl応答の代表的なスクリーンショットを選択します。後で分析や比較のためのプレゼンテーションのスライドに作物スクリーンショットとペーストイメージ。
   6. 「秒幅」と秒単位で記録速度を「秒ステップ」の両方を調整します。刺激開始前だけ応答終了後ブラケット領域にトップパネルの灰色のマーカーを移動させることにより、分析の長さを選択します。
   7. 押して "<< REW」を押して「PLAY>」を「再生しながら景色を一時停止」を選択します。 「レートチャートをカウント」し、必要に応じてユニットを調整し、線の色は、ROIの色に合わせて、タブを選択します。
   8. 分析が完了すると、押して「エクスポート速度データ」を参照して下さい。組み合わせ録音のCCBと各側面からの関心の中葉領域のスクリーンショットを選択します。応答画像をスライドに作物スクリーンショットとペーストイメージ。このスライドは、後に最終的な分析に使用されます。
2. 例分析：詳述抽出光子データの分析のための一つの方法
   1. 「料金の輸出をカウント」フォルダ内のスプレッドシートファイルを開きます。
   2. 細胞を時間と分で時間を表示するには、最初の列ラベルの時間を再フォーマットします。
   3. サンプルに対応するスライドを参照。時間の列と2つの代表的なのROIを除くすべての値を削除します。
   4. ニコチン刺激開始時刻を決定する - 主にログエントリファイルで使用可能な起動またはハイライト値の前に追加のデータを削除するフォルダ - 。
   5. CCBと中葉とマーク/ハイライトの両方のための最高/ピーク値を検索します。
   6. 両方の応答の開始および終了時間を決定します以下からの時間のポイントを使用して推定値を作成することにより、CCBと内側ローブは、スライド上の応答をグラフ化し、これらの点に近接した値の変化により、実際の値を選択するには、対応します。 CCBと内側ローブの両方で、これらの点の間の領域を強調表示します。また^、9マクロを使用します。
   7. 新しいスプレッドシートの上に1つの実験グループのすべてのサンプルを結合します。
   8. 行の値を決定することによりピークに位置合わせし、各CCBピーク値のためのものです。そのサンプルデータはに再コピーする必要がありますおおよその行の値を決定するために、最も高い行値から低い値を引きます。すべてのピーク値が合っていることを確認します。
   9. 二回シートをコピーし、内側ローブ列のみCCBまたは内側ローブ値のページを作成CCBの列のいずれかを削除します。
   10. すべてのCCB応答が終了した後にデータを削除します。総光子、応答長（持続時間）、ピーク振幅をラベル4つの行を作成し、応答待ち時間。再び原稿の下にこれをコピーして貼り付けます。
   11. 応答の間に合計光子を決定するために、SUM関数を使用してください。応答の長さを決定するために、COUNT関数を使用してください。ピーク振幅値を決定するために、最も高い値のセルをコピーしてリンクします。 COUNT関数を使用してください - 応答レイテンシを決定するために - ニコチンの灌流の開始からの応答の開始に選択します。
   12. コピー値リンク機能を使用して、秒でスピードを記録することによって、（ピーク振幅を除くすべて）を掛けます。
   13. そう（例： 図5B、C、D）必要に応じて、バー/ボックスのグラフは、そのような総光子、ピーク振幅、および応答長として計算されたパラメータのために作成することができます。
   14. 生データ光子応答後の欄に、平均関数を用いて、各時点での生データポイントを平均。時点における平均光子値のそれぞれについて、平均値の標準誤差（SEM）を決定する列を持つ場合、所望の追跡。
   15. 平均応答プロフィールを構築するために、平均列を使用CCBのサンプルグループの電子[グラフ]。これはx軸の値のような時間を指定するカラムとy軸として、平均光子値の列を選択し、最終的に散布グラフ作成ツールを選択することができません。
   16. 内側ローブからのデータをこの解析手順を繰り返します。
3. ビデオ用の画像を作成します
   1. オープン光子ビューア。
   2. 表示制御]タブを選択します。 、選択削除、および/またはそれを最小限にするための制御を保持しながら、ROIをクリックします。
   3. 「秒幅」とは、各フレームの内容を決定するために、所望のように（蓄積時間）を変更します。
   4. 各フレームのオーバーラップを定義するには、「秒ステップ」を変更します。
   5. 押して "<< REW」、次に「演奏中にエクスポート・ビュー」を「PLAY>」を選択します。ビデオ用の画像は、.PNGファイルのシリーズとして「ビューの輸出」フォルダにエクスポートされます。
4. ビデオを作るために、仮想ダブを使用して：ビデオcのための1つの方法は詳細reation
   1. 画像を含むビューをエクスポートしたフォルダに「resultats」という名前の新しいフォルダを作成します。
   2. 画像のフォルダにスクリプト（renommer.VBS）を持参してください。
   3. renommer.VBSをダブルクリックして実行します。
   4. 画像は自動的に数値的に名前を変更し、「resultats」フォルダにコピーされます。
   5. VirtualDub.exeを開きます。
   6. オープンビデオファイルを選択します - （後続の画像は自動的にロードされます）最初の画像を選択します。
   7. 動画を選択 - 選択フレームレート、必要に応じて調整します。
   8. 選択圧縮半径にCinepakコーデックを選択 - ビデオを選択します。
   9. ファイルでは、ビデオが自動的に作成されたAVIとして保存]を選択します。

結果

エクオリンへのGFPの融合は、私たちは顕微鏡（ 図3A、4A、6A、6E）に蛍光モードでGFPの励起されて前の生物発光イメージングに興味のある私たちの地域を可視化することができます。キノコ体を刺激する最も簡単な方法の一つは、イオンチャネル型ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化によるものです。アセチルコリンは、この受容体の内因性リガンドであるが、我々はニコ?...

ディスカッション

必要に応じて、ここで紹介する最近開発された生物発光ベースのGFP-エクオリンアプローチは、Cabrero らに報告されているように腎臓星状細胞などの細胞の他の種類で、異なる神経細胞におけるCa ²⁺ -活性のインビボで機能的記録で可能にする、など。 2013年^5。

修正、トラブルシューティング、追加のコンポーネント、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
CaCl2	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
KCl	prolabo	26 764.298	normapur
MgCl2	prolabo	25 108.295	normapur
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
dental glue	3M ESPE™	46954	Protemp IV
silicon glue	3M ESPE™	36958	Express 2 Regular Body Quick
tape	3M Scotch	122s	3M Scotch Magic Tape
pipette tips	Corning Incorporated	4868	100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)			hand made
incubation box			hand made
forceps (No. 5)	Fine Science Tools	11252-00	Micro-dissecting forceps
curved forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Micro-dissecting forceps
glue applicator			hand made
knife	Fine Science Tools	10316-14	5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (cooled to -80 °C)
Microscope	Nikon		Eclipse-E800
immersion objective lens	Nikon		20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III		leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box	Science Wares		Custom built by Science Wares
peristaltic pump	Gilson		Minipuls 2
tubing	Fisher Scientific	depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system	Warner	64-0135  (VC-66CS)	Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2	Martin et al., 2007, Ref. 1	N/A	No stocks {currently} publicly available
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP	B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.	(STOCK #1117340)	pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2	Lima and Misenboeck, Ref. 11	N/A	No stocks {currently} publicly available
OK107	Bloomington stock center	854	http://flystocks.bio.indiana.edu/