In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine neuartige ^Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das ^Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

Zusammenfassung

Funktionelle in-vivo-Bildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz, um die Funktion und Physiologie von Gehirnzellen und Strukturen von Interesse zu studieren. Vor kurzem wurde ein neues Verfahren zur ^Ca 2+ -Imaging Verwendung des Biolumineszenz-GFP-Reporter Aequorin (GA) ist entwickelt worden. Diese neue Technik beruht auf der Fusion von GFP und Aequorin Genen, wodurch ein Molekül in der Lage zum Binden von Calcium und - unter Zugabe von dessen Co-Faktor Coelenterazin - emittierende helle Licht, das durch ein Photon Sammler überwacht werden können. Transgene Linien Tragen des GFP-Aequorin-Gens für Mäusen und Drosophila erzeugt. Bei Drosophila wurde die GFP-Aequorin-Gen unter der Kontrolle des GAL4 / UAS Binärausdruck Systems für die gezielte Expression und Imaging im Gehirn platziert. Dieses Verfahren wurde später gezeigt, dass sie erfassen kann sowohl nach innen ^Ca 2+ -Transienten und Ca ^{2+ aus} inneren speichert -released. Am wichtigsten ist es ermöglicht eine größere Dauer in eine kontinuierliche Aufzeichnung, Imaging in größerer Tiefe innerhalb des Gehirns, und die Aufzeichnung mit hoher zeitlicher Auflösung (bis zu 8,3 ms). Hier präsentieren wir die grundlegende Methode für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu erfassen und zu analysieren, ^Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern, die eine Struktur von zentraler Bedeutung für Lernen und Gedächtnis im Fliegenhirn.

Einleitung

Die grundlegende Strukturierung und Funktion der Aktivitäten innerhalb des Gehirns und seiner diskreten Strukturen sind seit langem ein Gebiet intensiver Studie auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Vielleicht einige der frühesten erfolgreiche Ansätze verwendet werden, um dieses Problem zu beheben waren direkte physiologische Messung der Änderung in der elektrischen Aktivität - aber alternative Methoden, die Live-Darstellung von Spannungsänderungen, pH-Wert oder Calciumkonzentrationen (als Proxy für die Aktivität) zu ermöglichen haben zusätzliche Fähigkeiten gebracht die Untersuchung der neuronalen Aktivität ^1. Bildgebungstechniken tragen eine Vielzahl von Vorteilen, wie reduzierte Invasivität und die Fähigkeit, im gesamten Gehirnstrukturen zu überwachen Aktivität. Außerdem bei Tieren mit gefügig Genetik einschließlich der Fruchtfliege Drosophila, die Entwicklung von genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren, wie Cameleon, GCaMPs und andere ¹ haben Forscher erlaubt, einzelne Nervenzellen, neuronale Populationen und ganzer Gehirn überwachenStrukturen. Während traditionelle fluoreszierende Kalzium-bildgebenden Verfahren unter Verwendung GCaMPs (GFP an Calmodulin fusioniert) oder FRET (CFP und YFP an Calmodulin abgesichert) haben sich als nützliche Techniken eine gute räumliche und zeitliche Auflösung zu sein, die zugrunde liegende Prozess der Lichtanregung erzeugt einige Einschränkungen auf seine experimentelle Anwendungen. Aufgrund der Natur der Lichtanregung, Autofluoreszenz, Photobleaching und Phototoxizität unvermeidlich erzeugt wird, was folglich begrenzt die Tiefe der Strukturen, die abgebildet werden kann, die Dauer der Aufnahme sowie die Echtzeit-kontinuierliche Aufzeichnung. In anderen Worten muss Aufzeichnungen oft intermittierend durchgeführt werden, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden.

Wegen dieser Probleme wurden zusätzliche alternative Verfahren der Calcium Bildgebung entwickelt. Einer der vielversprechendsten Methoden ist biolumineszierenden Bildgebung, die auf Licht, das durch eine enzymatische Reaktion nach der Calciumbindung hergestellt beruht. Bioluminescent-Bildgebung erfordert keine Lichtanregung und damit nicht die gleichen Schwierigkeiten wie herkömmliche Calcium Imaging zu erleben. Die Biolumineszenz Reporter Aequorin - von Aequorea victoria isoliert, das gleiche Quallen, von dem GFP wurde auch isolated- bindet Kalzium über seine drei EF-Hand-Strukturen und eine Konformationsänderung, die zur Oxidation von seinem Co-Faktor Coelenterazin und die Freisetzung von blauem Licht (λ = 469 nm) ^2,3. Aequorin hat eine sehr niedrige Affinität für Calcium (K _{d = 10} & mgr; M), was es ideal für die Überwachung Calciumtransienten weil sie erzeugt nur wenig Hintergrundrauschen und nicht mit der intrazellulären Calcium-Puffersystem ⁴ eingreifen lässt. Obwohl Aequorin bereits verwendet wurde, um den Prozess der neuronalen Induktion im Xenopus-Ei ⁵ das erzeugte Licht zu überwachen, ist zu schwach, um für eine Echtzeitabbildung der neuronalen Aktivität verwendet werden. In dem Bemühen, diese Herausforderung, Philippe Br & Adresse# 251; lassen und Kollegen am Institut Pasteur erstellt ein genetisches Konstrukt Verschmelzen GFP und Aequorin Genen, imitiert den nativen Zustand in der Quallen ^4. Dieses Fusions Genprodukt bindet Calcium wieder über die drei EF-Handstrukturen Aequorin, das eine Konformationsänderung führt zu Oxidation von Coelenterazin, die Energie strahlungslos auf die GFP überläuft. Diese Energieübertragung führt zur Freisetzung von grünem Licht (λ = 509 nm) von GFP anstelle von blauem Licht von Aequorin. Die Fusion von GFP und Aequorin verleiht auch höhere Proteinstabilität hilft das Fusionsprotein produzieren Licht 19-65 mal heller als allein ⁴ Aequorin. Unter Verwendung eines Biolumineszenz-Ansatz im Gehirn erweitert die aktuelle experimentelle Anwendung von Calcium-Bildgebung sowohl in Bezug auf die Dauer der kontinuierlichen Aufzeichnung und die Anzahl der Strukturen innerhalb des Gehirns, die aufgezeichnet werden können. Im Großen und Ganzen im Rahmen der bisherigen Arbeit es bedeutet, dass sowohl globale als auch eine größereVielzahl von regionalisierten "Aktivität" des Gehirns (über den Proxy von Calciumtransienten) überwacht werden. Noch wichtiger Aktivität kann mehr überwacht werden, in einem Echtzeit und kontinuierlicher Weise, die ohne weiteres eignet sich für die Ausübung der ein vollständiges Verständnis der Basisfunktion im Gehirn.

In den letzten Jahren haben unser Labor und andere transgene Fliegen, die das GFP-Aequorin unter der Steuerung des binären Expressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-Aequorin) ^5,6 exprimieren entwickelt. Wir GFP-Aequorin-Biolumineszenz durch natürliche Reize wie Duft ^7,8 sowie suchten Zellkomponenten Modulieren ^Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern folgenden Acetylcholinrezeptorstimulation durch direkte nikotinischen Anwendung ^{9 erzeugte} Datensatz Aktivität verwendet. Darüber hinaus haben wir auch verwendet GFP-Aequorin, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die nicht in der Lage gewesen zu bisher angegangen werden, wie Langzeit-AdresseBildgebung der spontanen Calciumtransienten und Visualisierung von tieferen Hirnstrukturen ^10. In jüngerer Zeit haben wir die GAL4 / UAS-System verwendet, um die Säuger-ATP-Rezeptor P2X _{² 11} einen Kationenkanal, in den Projektionsneuronen (PNs) auszudrücken und verwendet die LexA System GFP-Aequorin in den Pilzkörpern exprimieren (MB247-LexA 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a freundlicher Genehmigung von B. Pfeiffer, Janelia Bauernhof, USA). Dies ermöglichte es uns, die PNs durch Anwendung von ATP, das wiederum aktiviert den Pilzkörpern (a nachgeschalteten Ziel des PNs) zu aktivieren, die Nachahmung natürlicher Bedingungen, wie als Antwort auf eine Geruchsreiz. Insgesamt ist diese Technik kombiniert P2X _{2 und} GFP-Aequorin erweitert die experimentellen Möglichkeiten. Im Großen und Ganzen bietet es die Möglichkeit, die Aktivitätsmuster im Gehirn besser zu verstehen, die Einleitung neuer Studien darüber, wie verschiedene Reize und Störungen können die basalen Strukturierung der Aktivitäten zu ändern.

Protokoll

1. Herstellung der Proben

1. Herstellung von Lösungen und Einrichten
   1. Pflegen Sie alle Drosophila melanogaster Linien bei 24 ° C auf Standard-Lebensmittelmedium. Rear und halten sie in geringer Dichte in der Ampulle, standardisierte Größe und das Gewicht von Fliegen zu erzeugen.
      1. In 10 jungfräulichen Weibchen mit 10 Männern in einem Fläschchen, lassen Sie sie sich paaren und übertragen Sie alle 2 Tage in ein frisches Röhrchen. Dann wurden 10 Tage später, als die Fliegen beginnen zu schlüpfen, ernten die Fliegen jeden Tag. Halten Sie eine genaue Aufzeichnung der im Alter von den Fliegen und halten sie in gutem Zustand.
      2. Am Tag 3, trennen Sie die Männchen von den Weibchen und halten die Weibchen 20 Fliegen pro Fläschchen. Nehmen Sie die Fliegen bei 4 oder 5 Tage alt.
   2. Vorbereitung Ringerlösung mit den folgenden Konzentrationen: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl _{2, 2} mM _CaCl 2, 5 mM HEPES und 36 mM Saccharose und den pH-Wert der Lösung genau 7.3. Bereiten Perfusionslösungen von 25 μ; M Nikotin und 100 mM KCl in Ringer-Lösung.
   3. Bereiten 1.000 ul Pipettenspitze: mit einer Rasierklinge Form Spitze bis schräg (ca. 35 ° vom Ende der Spitze), und entfernen Sie überschüssige Base über 1 ½ Zentimeter von der Spitze.
   4. Vorbereitung Kasten für die Lagerung (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) der Probe während der Inkubation. Legen Sie zwei Schwämme (12 cm x 8 cm x 3 cm) mit Wasser gesättigt in Boden unter einem kleinen Rack Gerät [auf Probe Austrocknung zu verhindern], um die Proben auf ihre Vorbereitung abgeschlossen zu platzieren.
   5. Bereiten Fliegen Proben, so dass sie mindestens 1 Kopie des UAS-GFP-Aequorin und eine Kopie eines Gal4 Linie Expression von GFP-Aequorin zu fahren. OK107 Gal4 Linie (eine Linie die Expression vor allem in den Pilzkörpern) mit UAS-GFP-Aequorin in dieser Zubereitung gekreuzt.
      HINWEIS: Das Innere der Box muss wasserfest sein und die Außenseite muss Licht in Box, um den Abbau von Coelenterazin während der Inkubation zu verhindern blockieren.
2. Preptung von Proben
   1. Eis anästhesiert Drosophila indem sie in eine Glasampulle und auf Eis für 2 min zu halten, bevor sie an der gekühlten Petrischale zur Positionierung in der Pipettenspitze bewegt. Bereiten Pipettenspitzen auf leicht angefeuchteten Filterpapier in 100 ml Petrischale auf Eis unter dem Dissektionsmikroskop.
   2. Vorsichtig mit einer Pinzette Ort fliegen Innenseite Pipettenspitze.
   3. Mit einem Pinsel vorsichtig schieben und ausrichten fly so dass der Kopf vollständig über den Rand der Spitze und der Rückenbereich ist teilweise durch den Abschnitt während der Spitzenformung (2B) entfernt ausgesetzt.
   4. Kombinieren eine kleine (ungefähr 3-4 & mgr; l) Abschnitte der beiden Komponenten des Dentalkleber. Tragen Sie den Klebstoff vorsichtig um die vorderen und hinteren Kopf und Hals auf und rund um die Pipettenspitze Kante - die Vermeidung der Krone des Kopfes. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min.
   5. Platz Pipettenspitze mit geklebten fly durch Loch im Aufnahmeraum (2D) und Gen-tly drücken, um an Ort und Stelle zu sichern.
   6. Kombinieren Sie die beiden Komponenten der Silikonkleber (ungefähr 3-4 & mgr; l). Leim auf der flachen Seite der Kammer entlang der Kante, wo die Kammer und Pipettenspitze treffen, um Leck von der Ringerlösung zu verhindern. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min.
3. Präparation
   1. Bringen Sie Klebeband über die Perfusionskanal kurzen Kante und sich an der Rückseite der Kammer.
   2. Zeigen Kammer mit Fliege auf Dissektion Block unter dem Mikroskop wiederum auf Leuchtstofflampe. Pipettieren 1 ml Ringer-Lösung in die Kammer.
   3. Verwenden Sie feine chirurgische Messer, um Nagelhaut entfernen. Machen parallele Einschnitte von der Rückseite des Kopfes, um anten Region. Dann entlang der Kante des Auges geschnitten dann einen senkrechten Schnitt über Antenne, welche die früheren Inzisionen. Einen endgültigen Schnitt parallel zu der an der Rückseite des Kopfes. Mit den feinen scharfen Pinzette Kutikula (2C) zu entfernen.
   4. Verwenden Sie feinen scharfen Pinzette vorsichtig greifen eind entfernt ausgesetzt klar abgeschlagen Atemwegsgewebe, bis das Gehirn und [fluoreszierenden] Pilzkörper wird übersichtlich visualisiert.
   5. Verwenden Sie ultra-scharfen Pinzette vorsichtig greifen und kneifen abdeckt Gehirn, um für die Permeation des Coelenterazin ermöglichen neuroepithelialen Gewebe.
      HINWEIS: Alternativ Papain kann die Neuroepithels ⁹ permeabilisiert werden.
   6. Unter Verwendung einer Pipette, waschen zweimal mit Ringer-Lösung, um alle Fremdkörper aus Präparation und Ort Probe im dunklen Kasten zu entfernen.
   7. Pipette 1 ml Ringer-Lösung, die 5 uM benzyl-Coelenterazin in die Kammer. Schließen Sie die Box und lassen Inkubation mit Coelenterazin bei RT für ein Minimum von 2 Stunden.

2. Imaging

1. Konfiguration
   1. Starten Sie die Aufnahme-System: Schalten Sie Mikroskop, Computer, Kamera und Entwässerungssystem und stellen Raum Umweltkontrollen bis 25 ° C.
   2. Offene Measurement and Automation Explorer-Programm auf dem Computer. Klicke auf “ Geräte und Schnittstellen ", doppelklicken Sie dann auf" NI Motion Devices "und schließlich klicken Sie rechts auf" PCI-7334 "und wählen Sie" Gerät initialisieren ".
   3. Öffnen Photon Imager. Neuen Ordner anlegen und benennen erste Aufnahmedatei. Kamera darf -80 ° C zu erreichen, bevor System wird funktionieren.
   4. Richten Sie Perfusionssystem - fügen KCl, Nikotin und Ringer-Lösung zu Lagerstätten und so das jeder Lösung Entladungen bei 2 ml / min einzustellen. Mit Lösung Ringer vor Beginn der Experiments waschen.
2. Bereiten Probe
   1. Platz Bildgebung Montageblock Teller auf dem Berg unter dem Mikroskop zu 5fache Vergrößerung und legen Perfusion Rohr in den Kanal durch Punktion.
   2. Set Mikroskop Fluoreszenzmodus dann Zentrum und bringen Pilzkörper (MBS) in den Fokus. Passen Sie auf 20X und Wiederzentrum und Fokus.
   3. Position Drainagevorrichtung über Drainagebecken, Höhe einstellen des Drainage Shunt so dass die Spitze ist nur Above-Pool, und führen Ringer-Lösung für 30 Sekunden, um das Abfließen zu gewährleisten.
   4. Pull-Down-Schild den Inhalt vor Licht abzudichten Gerät. Unter Verwendung des automatisierten Systems in Photonen-Imager Feineinstellungen, um den Fokus und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der MBs.
3. Aufnahme
   1. Einstellen Photonengeschwindigkeit auf gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit (von 50 ms bis zu 1 s oder mehr). Photonen-Modus auswählen und offener Blende. Nehmen Genotyp, Geschlecht, Alter und Probennummer im Log-Einträge. Stellen Sie die Position ROI Boxen über Kelch und Zellkörper (CCB) und mediale Lappen durch Klicken auf die ROI-Boxen und Ziehen bei gedrückter Steuerungs.
   2. Record Grundlinie für etwa 5 bis 10 min (je nach Wunsch).
   3. Gelten Nikotin für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung für 5 min waschen.
   4. Warten Sie 5 Minuten für die Wiederherstellung und bereiten KCl Protokolleintrag und Timer.
   5. Gelten KCl für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung während 1 min waschen.
   6. SchalterFluoreszenzmodus, nehmen Sie endgültige Fluoreszenzbild und schalten Sie Ringerlösung.
   7. Drücken Sie auf "Stop". Dialogfeld werden Sie gefragt, zum Ausschalten des Systems. Wählen Sie "Nein", um die Aufnahme fortzusetzen.
   8. Öffnen Schild, verschieben Drainagesystem, Schaltlinsenobjektiv bis 5X, entfernen Perfusion Rohr. Entfernen Probe / Aufnahme Gericht aus Stufe reinigen 20X Linse durch Spülen und zweimal wischen Sie das Objektiv mit Wasser.
   9. Drücken Sie die Play-Taste weiß am oberen Rand des Programmfensters, um die nächste Aufzeichnung zu starten.

3. Analyse und Video Creation

1. Auszug Photonenwerte
   1. Öffnen Sie das Photon-Analyse-Programm (zB Photon Viewer) und offene erste Probentabellendatei.
   2. Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Wählen Sie die ROI, indem Sie auf die Region bei gedrückter Steuerungs. Passen Sie Größe, Ausrichtung und Form der Bereiche von Interesse, um GFP beleuchtet CCB und mediale Lappen umfassen.
   3. Fügen Sie einen Zusatzal ROI, indem Sie auf und auf "ROI definieren" und Ziehen auf dem Bildschirm, um die neue ROI erstellen.
   4. Wählen Sie die "Movie", um Photonen-Video zu spielen. Stellen Sie "s Breite" und "sec Schritte" nach Wunsch. Nachstellen ROI Platzierung wie nötig.
   5. Wählen Vertreter Screenshots der GFP-Fluoreszenz, Nikotin Antwort und KCl Antwort. Crop Screenshots und Bild Paste in eine Präsentationsfolie zur späteren Analyse und Vergleich.
   6. Passen Sie sowohl die "s Breite" und "sec Schritt", um die Aufnahmegeschwindigkeit in Sekunden. Wählen Sie Länge von Analyse, indem graue Markierungen auf obere Platte an der Halterung Region vor Stimulus Initiierung und unmittelbar nach Ansprechen Ende.
   7. Wählen Sie "Suspend Blick während des Spielens" Presse "<< REW" und drücken Sie "PLAY>". Wählen Sie die Registerkarte "Zählrate Chart" und passen Einheiten wie gewünscht und Linienfarben, um ROI Farbe.
   8. Wenn die Analyse abgeschlossen istDrücken Sie "Export Zählratendaten". Wählen Sie Screenshots von kombinierten Aufnahmen CCB und mediale Lappen Region von Interesse von jeder Seite. Crop Screenshots und Bild Paste in einem Objektträger mit Reaktions Bilder. Diese Folie wird später in der endgültigen Analyse verwendet werden.
2. Beispiel Analyse: eine Methode zur Analyse der extrahierten Photonendaten detailliert
   1. Öffnen Sie das Tabellenkalkulationsdateien in "Zählrate Exporte" -Ordner.
   2. Formatieren Sie die Zellen der ersten Spalte mit der Zeit, um die Zeit in Stunden und Minuten angezeigt.
   3. Verweisen Sie auf das entsprechende Schieber für die Probe. Entfernen Sie alle Werte außer den Spalten für die Zeit und die beiden Vertreter ROIs.
   4. Bestimmen Sie Nikotin-Stimulation Startzeit - im Protokolleintrag Datei im Haupt Ordner- Zusatzdaten vor der Inbetriebnahme oder Highlight-Wert zu entfernen.
   5. Finden höchste / Spitzenwert sowohl für CCB und mediale Keule und Zeichen / Highlight.
   6. Bestimmen Sie Antwort Start- und Endzeit für beideCCB und mediale Lappen durch die Schaffung einer Schätzung unter Verwendung von Zeitpunkt aus entsprechenden grafisch dargestellt Reaktion auf Folie und wählen Sie Ist-Wert von Wertewandel in der Nähe zu diesen Punkten. Streichen den Bereich zwischen diesen Punkten in sowohl der CCB und mediale Lappen. Alternativ können Sie einen ^Makro-9.
   7. Kombinieren Sie alle Proben einer Versuchsgruppe auf einem neuen Arbeitsblatt.
   8. Richten Sie am Gipfel durch die Bestimmung der Zeilenwert ist für jede CCB Spitzenwert. Subtrahieren Sie die unteren Werte von höchsten Zeilenwert um ungefähre Zeilenwert, wo die Probe Daten müssen erneut kopiert werden, zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass alle Spitzenwerte ausgerichtet sind.
   9. Kopieren Sie das Blatt zweimal und entweder der medialen Lappens Spalten oder die CCB Spalten Erstellen von Seiten von nur CCB oder medialen Lappens Werte zu löschen.
   10. Daten zu entfernen, nachdem die alle CCB Antworten wurden beendet. Erstellen Sie vier Zeilen markiert Gesamt Photonen, Antwortlänge (Dauer), Peak-Amplitude und Antwortlatenz. Kopiere den wieder unter den Originalen.
   11. Verwenden Sie die Funktion SUMME, um insgesamt Photonen während der Reaktion zu bestimmen. Verwenden Sie die COUNT-Funktion, um Länge der Antwort zu bestimmen. Kopieren und verbinden höchsten Wert Zelle zu Spitzenamplitudenwert zu bestimmen. Verwenden Sie COUNT-Funktion - vom Beginn der Perfusion von Nikotin zu Beginn der Reaktion zu wählen - den Antwortlatenzzeit zu bestimmen.
   12. Copy-Werte mit Hilfe der Verknüpfungsfunktion und mehrfach (alle außer Spitzenamplitude) durch Aufzeichnung Geschwindigkeit in Sekunden.
   13. Bar / box Graphen kann für berechneten Parameter wie Total Photonen, Spitzenamplitude und Antwortlänge erzeugt werden, wenn dies gewünscht wird (Bsp .: 5B, C, D).
   14. In der Spalte nach der Rohdaten Photonenreaktion, der Mittelwert der Rohdatenpunkte für jeden Zeitpunkt unter Verwendung von Durchschnittsfunktion. Wenn mit einer Säule zur Festlegung der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) gewünschten folgen, für jeden der gemittelten Photonenwerte zu einem Zeitpunkt.
   15. Verwenden Sie die durchschnittliche Spalte, um eine durchschnittliche Antwort profil konstruierene [Graph] für die CCB Probengruppe. Wählen Sie dazu die Spalte die Angabe der Zeit wie die x-Achse Werte und die Spalte des durchschnittlichen Photonenwerte als der y-Achse und schließlich die Streudiagrammerstellung Werkzeug auswählen.
   16. Wiederholen dieses Analyseverfahren mit den Daten aus den medialen Lappen.
3. Erstellen von Images für das Video
   1. Offene Photonen Betrachter.
   2. Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Klicken Sie auf ROI bei gedrückter Steuerungs auszuwählen, zu entfernen und / oder zu minimieren, ist es.
   3. Ändern "sec Breite" (Akkumulationszeit), wie gewünscht, den Inhalt jedes Rahmens zu bestimmen.
   4. Ändern "sec Schritt", um die Überlappung der einzelnen Frames zu definieren.
   5. Wählen Sie "Export Blick während des Spielens" Presse "<< REW" und dann "PLAY>". Die Bilder für das Video wird an den "Blick Exporte" Ordner als eine Reihe von PNG-Dateien exportiert werden.
4. Eine Methode für Video c: Verwenden von Virtual Dub Video zu machen,reation detaillierten
   1. Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen "resultats" in der Ordneransicht Exporte mit den Bildern.
   2. Bringen Sie script (renommer.VBS) in den Ordner mit Bildern.
   3. Klicken Sie doppelt auf renommer.VBS zu laufen.
   4. Bilder werden automatisch numerisch umbenannt und auf "resultats" Ordner kopiert werden.
   5. Offene VirtualDub.exe.
   6. Wählen offenen Video-Datei - wählen Sie zuerst eine Bild (nachfolgenden Bildern wird automatisch geladen).
   7. Wählen Sie Video - wählen Framerate wie gewünscht einzustellen.
   8. Wählen Sie Video - wählen Kompression wählen Cinepak Codec von Radius.
   9. In Datei wählen Sie Speichern als AVI-Video wird automatisch erstellt.

Ergebnisse

Die Fusion der GFP zu Aequorin erlaubt uns, unsere Region von Interesse vor der Biolumineszenz-Bildgebung durch Anregung von GFP in Fluoreszenzmodus am Mikroskop (Abbildung 3A, 4A, 6A, 6E) zu visualisieren. Eine der einfachsten Möglichkeiten, um die Pilzkörper zu stimulieren, durch Aktivierung der ionotropen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Obwohl Acetylcholin ist der endogene Ligand dieses Rezeptors haben wir gefunden, dass Nikotin erzeugt reproduzierbarer Antworten in den Pilzkörpern. Dies ist...

Diskussion

Das kürzlich entwickelte Biolumineszenz basierende GFP-Aequorin hier vorgestellte Ansatz ermöglicht in vivo funktionelle Aufnahme ^von Ca 2+ -Aktivität in verschiedenen Neuronen sowie wenn gewünscht, mit anderen Arten von Zellen, wie zum Beispiel Nierensternzellen nach Cabrero et al. 2013 ^5.

Modifikationen, Fehlersuche, zusätzliche Komponenten und kritischen Schritte

Drosophila...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
CaCl2	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
KCl	prolabo	26 764.298	normapur
MgCl2	prolabo	25 108.295	normapur
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
dental glue	3M ESPE™	46954	Protemp IV
silicon glue	3M ESPE™	36958	Express 2 Regular Body Quick
tape	3M Scotch	122s	3M Scotch Magic Tape
pipette tips	Corning Incorporated	4868	100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)			hand made
incubation box			hand made
forceps (No. 5)	Fine Science Tools	11252-00	Micro-dissecting forceps
curved forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Micro-dissecting forceps
glue applicator			hand made
knife	Fine Science Tools	10316-14	5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (cooled to -80 °C)
Microscope	Nikon		Eclipse-E800
immersion objective lens	Nikon		20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III		leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box	Science Wares		Custom built by Science Wares
peristaltic pump	Gilson		Minipuls 2
tubing	Fisher Scientific	depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system	Warner	64-0135  (VC-66CS)	Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2	Martin et al., 2007, Ref. 1	N/A	No stocks {currently} publicly available
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP	B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.	(STOCK #1117340)	pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2	Lima and Misenboeck, Ref. 11	N/A	No stocks {currently} publicly available
OK107	Bloomington stock center	854	http://flystocks.bio.indiana.edu/