analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Resumen

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Resumen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Introducción

En los organismos multicelulares, la migración celular es esencial tanto para el desarrollo del embrión en el que se asegura la organización de células en tejidos y órganos, y para la vida adulta, en el que toma parte de la homeostasis del tejido (cicatrización de heridas) y la inmunidad. Además de estas funciones fisiológicas, la migración celular también participa en diversas situaciones patológicas, incluyendo, en particular, la metástasis del cáncer.

La migración celular se ha analizado in vitro durante décadas, proporcionando una comprensión global de los mecanismos moleculares que garanticen movimientos de la célula en superficies planas. In vivo, sin embargo, las células se enfrentan a un entorno más complejo. Es claramente apareció en los últimos años que la migración dentro de un organismo puede estar influenciada por las señales externas, tales como la matriz extracelular, las células o quimiocinas secretadas migración de guía vecina, y que los mecanismos que impulsan la migración de células puede variar de lo que se ha descrito in vitro ^1,2. Los mecanismos que garanticen en la migración celular in vivo han recibido menos atención hasta ahora, principalmente debido a la mayor dificultad técnica, en comparación con los estudios in vitro. In vivo análisis de la migración de células, en particular, requiere de acceso óptico directo a células que migran, las técnicas para marcar las células únicas en para ver su dinámica y morfología, así como ganancia o pérdida de la función se acerca a probar el papel de los genes candidatos. Hasta ahora, sólo unos pocos sistemas modelo que albergan estas características se han utilizado para diseccionar en la migración celular in vivo ^3.

Recientemente hemos utilizado la migración de la placa precordal prospectivo en los primeros embriones de pez cebra como un nuevo sistema conveniente modelo para evaluar la función de los genes candidatos en el control de la migración de células en vivo ^4,5. prechordal placa prospectivo (también conocido como mesendoderm anterior) es un grupo de células que forman en el inicio de Gastrulation en el lado dorsal del embrión. Durante la gastrulación este grupo migra colectivamente hacia el polo animal del embrión ^6-8, para formar la placa precordal, un engrosamiento mesendodermal, anterior a la notocorda, y subyacente a la placa neural. La parte anterior de la placa prechordal dará lugar a la glándula de la eclosión, mientras que su parte posterior, probablemente contribuye a la cabeza mesodermo ^9. Gracias al desarrollo externo y la claridad óptica de la embrión de pez, la migración celular puede ser directa y fácilmente observarse en esta estructura.

Trasplante de la célula es una técnica muy potente que permite la creación rápida y fácil de los embriones de mosaico ^10. Expresan marcadores fluorescentes citoesqueleto de las células trasplantadas resultados en el etiquetado de las células aisladas, la morfología y la dinámica de las cuales se pueden observar con facilidad. La combinación de esta a la pérdida o ganancia de función se acerca permite el análisis de funciones de las células autónoma de una latagen didato.

El protocolo presentado describe cómo se evaluó la función del componente SIN1 TORC2 en el control de la dinámica de la migración celular y de actina in vivo ^5. Pero, como se menciona en los resultados y más discutido, podría ser utilizado para analizar la implicación potencial de cualquier gen candidato en el control de la migración celular in vivo.

Protocolo

Nota: La Figura 1 presenta el esquema del protocolo.

1. Preparación de las agujas para inyección y Trasplante

Nota: Las agujas se puede preparar en cualquier momento y se almacena. Mantenerlos en una placa de Petri, en una banda de pasta de modelar. Sellar la placa con parafilm para proteger del polvo.

1. Para agujas de inyección, tirar de un capilar de vidrio (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,58 mm, sin filamento (véase la lista de materiales)) con un extractor de micropipeta (véase la lista de materiales). Prefiero agujas cortas y delgadas (sección cónica de unos 5 mm), ya que son más eficientes para perforar el corion.
   Nota: Las agujas de inyección son de un solo uso.
2. Aguja para el trasplante de células
   1. Tirar de un capilar de vidrio (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,78 mm, sin filamento (véase la lista de materiales)) con un extractor de micropipeta.
   2. Tcantar una microforge (véase la lista de materiales), cortar la punta de la aguja en el punto donde el diámetro interior es de 35 micras (un poco más que el diámetro de las células a ser trasplantado).
   3. Bisel de corte de la extremidad del capilar con un microgrinder (véase la lista de materiales) con un ángulo de 45 °.
   4. Opcionalmente, tirar de una lengüeta en el extremo de la aguja usando un microforge. Para ello, toque el filamento caliente con la punta del bisel y tire de ella fuera rápidamente, creando una lengüeta que puede ayudar a penetrar en el embrión.
   5. Montar la aguja en un soporte de aguja colocada en una jeringa. El uso de la jeringa, enjuagar el interior de la aguja tres veces con ácido fluorhídrico 2% para eliminar los residuos de vidrio, y luego enjuagar tres veces con acetona.
      Precaución: ácido fluorhídrico es tóxico, manipular bajo el capó, con guantes.
      Nota: Las agujas de trasplante de células pueden ser utilizadas varias veces.

2. Preparación de laVajilla para inyección y Trasplante de células

1. Heat 50 ml de embrión medianas ¹¹ que contienen 0,5 g de agarosa en un microondas durante 1 min a plena potencia para obtener 1% de agarosa en medio de embrión. Enfriar el gel de agarosa a aproximadamente 60 ° C y se vierte los 50 ml en una placa de Petri 90 mm. Colocar en la superficie del gel de un molde especialmente diseñado (véase la lista de materiales), o bien con las líneas para el plato inyección o con pozos para el plato trasplante de células.
   1. Observar el flotador en el molde de agarosa, si la agarosa no esté demasiado caliente. Después de establecer el gel de agarosa, se desmolda con unas pinzas (Figura 2 A - B).
      Nota: Los platos se pueden almacenar a 4 ° C, hasta unas pocas semanas. Mantenerlos en una caja cerrada húmeda, para evitar la desecación.
2. Coloque el plato en una incubadora de 28 ° C 30 minutos antes de su uso.

3. Recolección de embriones e Inyección

1. Inyección de la solución Preparación
   Nota: dominio de unión a actinade la proteína 140 (ABP-140), tales como Lifeact unido a mCherry unión a la actina de levadura (referido como ABP140-mCherry) se utiliza para visualizar la actina polimerizada dentro de la célula, con el fin de analizar la actividad de protrusión. Añadir otro compuesto para probar la función de un gen candidato (por ejemplo, mRNA de constructo negativo o constitutivamente activa dominante, o oligonucleótidos morfolino). Para evaluar las funciones de sin1 como se describe en los resultados (Figura 3), se utilizaron oligonucleótidos morfolino. Como control, se utilizó una morfolino idéntica a la morfolino sin1 pero por 5 nucleótidos distribuidos a lo largo de la secuencia de modo que este morfolino de control no coincide con el ARN diana.
   1. Sin1 descongelación y morfolinos de control 5-desajuste (2 mM de soluciones madre), y ABP140-mCherry ARNm en hielo. Añadir 375 ng de ARNm (75 ng / l final) y 0,75 l de morfolino de control sin1 o 5-desajuste (0,3 mM final) en tampón Danieau (NaCl 58 mM, 0,7 mMKCl, 0,4 mM _MgSO4, Ca 0,6 mM (NO _{3) 2,} 5,0 mM HEPES pH 7,6), para llegar a un volumen total de 5 l.
2. Colección de Embriones
   Nota: para establecer este experimental hasta dos embriones de donantes y de acogida son transgénico, que expresa la GFP bajo el control de la goosecoid (SGC), el promotor con el fin de visualizar la placa prechordal prospectivo ^11.
   1. Recoger Tg (SGC: GFP) huevos. Colocar aproximadamente 80 huevos en un plato de 90 mm de Petri llena de medio de embrión y se incuba a 28 ° C.
3. Inyectar embriones de donantes
   1. Bajo un microscopio estereoscópico, apriete suavemente los embriones obtenidos con fórceps en las líneas de un plato lleno de inyección de medio de embrión. El uso de pinzas, orientar los embriones con las células hacia la parte superior. Coloque el plato de inyección en la incubadora a 28 ° C hasta que los embriones han llegado a la etapa de 4 células (1 hora después de la fecundación).
   2. Cargar una aguja de inyección con 2 l desolución de inyección. Insertar la aguja en un soporte de la aguja (véase la lista de materiales) que se coloca en un micromanipulador (véase la lista de materiales) y se conecta con politetrafluoroetileno tubo (PTFE) (véase la lista de materiales) a una Transjector aire (véase la lista de materiales ).
   3. Abra el capilar tocando suavemente la punta con unas pinzas finas. Si es necesario, cortar el capilar abierta pellizcando su extremidad.
   4. Introduzca una de las cuatro células con la aguja e inyectar la solución dentro de la célula con el fin de llenar el 70% del volumen de la celda (2 nl). Inyectar 30 embriones.
      Nota: Obtención de la aguja en la célula puede ser difícil, ya que la membrana plasmática es suave. Con el objetivo de la unión entre la célula y la yema facilita la penetración de la aguja.
   5. Colocar los embriones en el 28 ° C incubadora hasta que hayan alcanzado la etapa de esfera (4 horas después de la fecundación).

4. Preparación de los embriones para la célula Transplantation

1. Preparar 20 ml de medio de embrión con 200 l de penicilina / estreptomicina (véase la lista de materiales) (penicilina / estreptomicina EM).
2. Dechorionation de los embriones en la etapa de esfera (4 horas después de la fecundación)
   Nota: Los embriones dechorionated son muy frágiles y va a explotar en caso de contacto con el aire o plástico. Ellos por lo tanto necesitan ser colocados en placas de agarosa-revestido, y se transfiere con pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego.
   1. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico, transferir embriones huésped recogidos en el paso 3.2 y embriones de donantes inyectados en la etapa 3.3 en dos placas de Petri de 35 mm recubiertas de agarosa al 1% en medio de embrión y llenos de penicilina / estreptomicina EM. Mantener embriones de acogida y los embriones de donantes en dos platos separados.
   2. extraer manualmente los embriones de sus chorions con unas pinzas finas (véase la lista de materiales).
   3. Colocar los embriones en la incubadora a 28 ° hasta que hayan alcanzado la etapa de protección (6 horas después de la fecundación).

5. El trasplante de la célula

1. Organizar los embriones para el trasplante de células.
   1. Bajo un microscopio estereoscópico fluorescente, seleccione embriones de donantes que expresan ABP140-mCherry (rojo) dentro de la protección (verde).
   2. Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de los embriones en los pocillos de la placa de trasplante de células lleno de Pen / Strep EM. Colocar los embriones de acogida en una fila y los embriones de donantes en la fila vecina.
   3. El uso de una pestaña, orientar cuidadosamente los embriones con el escudo arriba.
      Nota: la posición de la pantalla se puede evaluar mediante la expresión de GFP o anatómicamente.
2. Trasplante de configuración del sistema de seguimiento.
   Nota: El sistema de trasplante se compone de un soporte de aguja (véase la lista de materiales) conectado con un tubo de PTFE (véase la lista de materiales) y un conector de tubo (véase la lista de materiales) a una jeringa Hamilton equipada con un micro-unidad (consulte la lista de Materiales). El soporte de la agujaestá montado en un micromanipulador de 3 vías (véase la lista de materiales).
   1. El uso de un soporte de aguja unida a una jeringa, enjuague la aguja para el trasplante de células con 70% de etanol. Seca al absorber el aire en la aguja. No dejar secar por soplado, ya que esto puede resultar en polvo se queda pegada en la parte cónica de la aguja.
   2. Insertar la aguja en el soporte de aguja conectada a la jeringa Hamilton, con el bisel hacia arriba.
3. Escudo-a-escudo Trasplante de células
   1. Introduzca el escudo de un embrión donante con la aguja y el trasplante de elaborar unos 10-20 células marcadas con ABP140-mCherry. Evita cuidadosamente dibujo yema.
   2. Transplante las células en el escudo de la embrión de acogida. Repita hasta que todos los embriones de acogida han sido trasplantados.
   3. Retire cualquier embriones dañados con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar los embriones trasplantados en la incubadora a 28 ° C y dejar que ellos se recuperen durante aproximadamente 30 minutos.
   4. Usando una agujatitular unida a una jeringa, enjuague la aguja trasplante de células con agua y colocarlo de nuevo en una placa de Petri en una banda de pasta de modelar. Sellar la placa con parafilm.

6. (OPCIONAL) Trasplante de los organismos unicelulares

Nota: En el embrión, las células se adhieren entre sí, de modo que es difícil sacar una sola célula en la aguja del trasplante. Hemos desarrollado un protocolo modificado fácilmente para trasplantar células progenitoras placa prechordal individuales. La idea es de disociar las células antes del trasplante. Debido a que las células aisladas prechordal placa progenitoras tienden a perder su identidad, que genéticamente las imponen una identidad prechordal placa prospectivo, mediante la activación de la vía de señalización nodal, en ausencia del factor de transcripción Sox32. Hemos comprobado que estas células inducidas se comportan como células progenitoras placa prechordal endógenos ^8. A continuación se presentan los pasos específicos para llevar a cabo trasplantes de células individuales. dissocia celularción se logra mediante la colocación de los embriones en Ringer libre de calcio ^11, la disección de un explante y mecánicamente agitándolo.

1. En el paso 2.1, preparar el plato con el trasplante de agarosa al 1% en Ringer libre de calcio en lugar de embriones Medio.
2. En la etapa 3.1, además de ABP140-mCherry ARN y morfolino sin1, añadir 3 ng de ARN que codifica la forma activa del receptor Nodal Taram-A (0,6 ng / l final) y 1,25 l de morfolino contra sox32 (solución madre a 2 mM, por lo tanto, 0,5 mM final).
3. Después del paso 4, la transferencia de tres embriones de donantes seleccionados en el plato para el trasplante de células lleno de Pen / Strep Ringer libre de calcio con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Con unas pinzas finas, diseccionar un explante que contiene las células inyectadas (ABP140-mCherry células marcadas). Rápidamente desechar el resto de los embriones.
4. Con una pestaña, agitar suavemente el explante hasta que las células se disocian.
5. Elaborar una única célula aislada de la aguja del trasplantey trasplantar en el escudo de un embrión de acogida.
6. Utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de los embriones en un plato de agarosa recubiertas de llenado de Pen / Strep EM. Coloque los embriones en la incubadora a 28 ° C durante 30 min.

7. Montaje de embriones

1. Cámara de imagen
   1. Método 1: utilizar una cámara de imágenes compuesto por un tobogán de plástico (75 * 25 * 0,5 mm) perforado con 4 agujeros (5,5 mm de diámetro), con 3 mm de bordes altos, por un lado (Figura 2 C - D). Pegue un cubreobjetos de vidrio en la parte trasera, con pegamento de cianoacrilato (pegamento).
      Nota: Al final del experimento, coloque la cámara en el agua durante una noche para eliminar el cubreobjetos y deshacerse de residuos de cola con papel de lija.
   2. Método 2: utilizar 35 mm MatTek vidrio platos de fondo (véase la lista de materiales) con un agujero de 10 mm.
2. montaje de embriones
   1. Llenar un vial de vidrio con 1 ml de caliente 0,2% de agarosa en medio de embrión.Mantenerlo a 42 ° C en un bloque de calor.
   2. Bajo el microscopio estereoscópico fluorescente, seleccionar un embrión en el que el rojo células trasplantadas son parte de la placa prechordal prospectivo marcada en verde (es decir, células trasplantadas son rojos dentro de la placa prechordal prospectivo verde, y han comenzado a migrar hacia el polo animal).
   3. Transferencia de un embrión seleccionado en la solución de agarosa con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Desechar el exceso de medio de embrión a partir de la pipeta. Dibuje el embrión en la pipeta con agarosa, y transferir el embrión en la cámara de formación de imágenes, depositando una gota de agarosa. Antes se establece agarosa, orientar el embrión con una pestaña. Colocar la placa precordal prospectivo hacia arriba para formación de imágenes con un microscopio vertical, o en el fondo de vidrio para formación de imágenes con un microscopio invertido. Espere hasta que la agarosa se establece (alrededor de 1 min, dependiendo de la temperatura ambiente) antes de montar otro embrión en el siguiente pozo de la cámara.
      Nota: un cha de imagenmbre que contiene 4 pozos permite montar hasta 4 embriones.
   4. Cuando se establece la agarosa, llenar la cámara con penicilina / estreptomicina EM para evitar la desecación.

8. imágenes en vivo

1. Utilice un objetivo de largo alcance 40X de inmersión en agua. Utilice los conjuntos de filtro a la imagen GFP y mCherry (para GFP: excitación BP 470/40, divisor de haz FT 510, y la emisión de 540/50 BP; para mCherry: excitación BP 578/21, divisor de haz FT 596, y LP emisión de 641 / 75). Ajustar duración de la exposición con el fin de optimizar la dinámica de la imagen.
2. Para imagen todas las células en la placa, adquirir z-pilas, empezando una pocas micras por encima de la placa precordal prospectivo (en el ectodermo) y finalización de una pocas micras por debajo de la placa precordal prospectivo (en la yema). Use un z-paso de 2 micras. Para optimizar la velocidad de adquisición, cambiar colores entre z-pilas en lugar de entre bastidores.
   Nota: Esto puede conducir a ligeras diferencias entre las imágenes verde y rojo, pero no es un problema ya que no precisa coSe requiere -localization entre las señales verde y rojo. Para reducir aún más el tiempo de formación de imágenes y la exposición a la luz, verde puede ser adquirido sólo una vez cada 5 puntos de tiempo, lo cual es suficiente para identificar células progenitoras placa prechordal.
3. El uso de tales ajustes, la imagen hasta 4 embriones dentro del intervalo de tiempo de dos minutos que es necesario analizar la frecuencia protuberancia y la orientación. Para el análisis de toda la vida saliente, reducir el intervalo de tiempo de 30 segundos para obtener una mayor resolución de tiempo. Imagen de un 60% a un 80% epibolia epibolia.

Análisis 9. Dinámica Celular

1. Cargar imágenes en 4D ImageJ
   Nota: Dependiendo del software utilizado para la adquisición, las imágenes se almacenan en diferentes formatos (un archivo por imagen, un archivo por z-pila, un archivo para todo el experimento). Algunos plugins ImageJ están disponibles en línea para abrir pilas 4D. Nuestros datos se almacenan como un archivo por z-pila. Debido a que el conjunto de datos puede ser grande, puede ser conveniente para abrir solamente parte de ella (algunos timlos puntos E, o una subparte de la pila Z, o de 8 bits convertidos imágenes ...). Utilizamos un plugin de ImageJ medida para hacerlo, lo que estaremos encantados de distribuir bajo petición.
2. El análisis de la orientación y de frecuencia de protuberancias celulares
   1. Use imágenes GFP para determinar la dirección principal de la migración prechordal placa prospectivo. Toma esto como una referencia para mediciones de ángulos salientes celulares. Girar la pila, de modo que esta dirección de referencia es paralela a un lado de la imagen.
   2. Siga una célula. Herramienta de selección de ángulo. Para cada trama y cada saliente, utilice la herramienta de ángulo para medir el ángulo entre la protuberancia y la dirección de referencia (Figura 3A). Utilice el comando Analizar / Medir para almacenar el valor (o pulse M en el teclado). Guardar los resultados como un archivo txt. Repita con la siguiente celda.
   3. Importar los datos en la distribución de R y el ángulo de trama como histogramas. Utilice la prueba de Kolmogorov-Smirnov (ks.test en I) para comparar diferentes condiciones.
      Nota: La herramienta ángulo proporciona valores comprendidos entre 0 ° y 180 °, lo que permite el uso de pruebas estadísticas clásicas y pruebas no circulares.
   4. Con este conjunto de datos, calcular la frecuencia de emisión como el número de salientes por célula por minuto. El uso del estudiante t-test (t.test en I) para comparar diferentes condiciones.
3. Análisis de la célula salientes Lifetime
   1. Para cada célula y cada saliente, duración saliente medida (número de tramas durante las cuales el saliente está presente x intervalo de tiempo entre tramas).
   2. Importar los datos en R. Uso t de Student (t.test en I) para comparar diferentes condiciones.
      Nota: Otras características de migración puede ser interesante analizar con el fin de caracterizar la migración celular. Estos incluyen pistas de células, para la velocidad, la dirección y las mediciones de la persistencia o la morfología celular. Algunas aplicaciones de software comerciales disponibles para medir estas características, pero un gran número de apli software de código abiertocationes y plugins ImageJ también están disponibles, como por ejemplo ADAPT para analizar Morfodinámica ^12, Diper a mirar las trayectorias celulares y persistencia direccional ^13, CellTrack para realizar un seguimiento límites de las celdas durante la migración ^14.

Resultados

La técnica presentada se utilizó para analizar el papel de sin1, uno de los componentes principales de la Tor complejo 2 (TORC2), en el control de la migración celular in vivo. El uso de trasplante de células permite el etiquetado de las células y análisis de los efectos de células autónoma aisladas. Película S1 muestra la migración de las células progenitoras de la placa precordal trasplantados. etiquetado de actina con ABP140 permite la visualización fáci...

Discusión

Este protocolo presenta una forma fácil de estudiar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo, mediante la combinación de la creación de embriones quiméricos utilizando el trasplante de células con imágenes en directo.

Creación de embriones de mosaico

El estudio de la dinámica de una célula requiere la visualización de su contorno para analizar extensiones citoplasmáticas. Esto se puede lograr mediante el etiquetado de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm)	Harvard Apparatus	300085	standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)	Harvard Apparatus	300085	thin-walled
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers	Dumont Fine Science Tools	11254-20	5F
glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Air transjector	Eppendorf	5246
Micro-forge	Narishige	MF-900
Microgrinder	Narishige	EG-44
Micromanipulator (for injection)	Narishige	MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation)	Leica	Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe	Narishige	IM-9B
Micropipette puller	David Kopf Instruments	Model 720
Transplantation mold	Adapative Science Tools	PT-1
Needle holder	Narishige	HI-7
Tube connector	Narishige	CI-1
PTFE tubing	Narishige	CT-1