analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Resumo

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Resumo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Introdução

Em organismos multicelulares, a migração celular é essencial tanto para o desenvolvimento do embrião em que assegura a organização de células em tecidos e órgãos, e para a vida adulta, em que participa a homeostase do tecido (cicatrização de ferimentos) e imunidade. Em adição a estas funções fisiológicas, a migração de células, também está envolvido em diversas situações patológicas, incluindo, em particular, a metástase do cancro.

A migração celular foi analisado in vitro ao longo de décadas, proporcionando uma compreensão global dos mecanismos moleculares que garantem movimentos celulares em superfícies planas. In vivo no entanto, as células são confrontados por um ambiente mais complexo. É claramente apareceu nos últimos anos que a migração dentro de um organismo pode ser influenciada por estímulos externos, tais como a matriz extracelular, as células ou quimioquinas segregadas orientadores migração vizinha, e que os mecanismos de condução migração de células pode variar do que foi descrito in vitro ^1,2. Os mecanismos que garantam na migração celular vivo têm recebido menos atenção até agora, principalmente por causa do aumento da dificuldade técnica, em comparação com estudos in vitro. In vivo análise da migração celular em particular requer acesso óptico direto para as células migram, técnicas para marcar células únicas em a fim de ver a sua dinâmica e morfologia, assim como o ganho ou a perda de função de abordagens para testar o papel dos genes candidatos. Até agora, apenas alguns sistemas modelo que albergam estas características têm sido utilizadas para dissecar na migração celular in vivo ^3.

Recentemente, utilizou a migração da placa pré-cordal prospectivo em embriões de peixe-zebra iniciais como um novo sistema modelo conveniente para avaliar a função de genes candidatos para controlar a migração celular in vivo em ^4,5. placa pré-cordal prospectivo (também conhecido como mesendoderm anterior) é um grupo de formação de células no início de Gastrulation no lado dorsal do embrião. Durante a gastrulação este grupo migra em conjunto em direcção ao polo animal do embrião ^6-8, para formar a placa pré-cordal, um espessamento mesendodermal, anterior ao da notocorda e da placa neural subjacente. A parte anterior da placa precordial dará origem à glândula incubação, enquanto a sua parte posterior provavelmente contribui para a cabeça mesoderme ^9. Graças ao desenvolvimento externo e clareza óptica do embrião de peixe, a migração de células pode ser facilmente e directamente observado nesta estrutura.

O transplante celular é uma técnica muito potente que permite a criação rápida e fácil de embriões de mosaico ^10. Expressando marcadores fluorescentes do citoesqueleto em células transplantadas resultados na marcação de células isoladas, a morfologia e a dinâmica das quais pode ser facilmente observado. Combinando isso a perda ou ganho de função se aproxima permite a análise de funções das células-autônoma de uma latagene didata.

O protocolo apresentado descreve como avaliamos a função do componente SIN1 TORC2 no controle da migração celular e actina dinâmica in vivo ^5. Mas, como mencionado nos resultados discutidos e ainda mais, que poderia ser utilizado para analisar a implicação potencial de qualquer gene candidato para controlar a migração celular in vivo.

Protocolo

Nota: A Figura 1 apresenta o esquema do protocolo.

1. Preparação das agulhas para injeção e Transplante

Nota: As agulhas podem ser preparados em qualquer momento e armazenado. Mantê-los em uma placa de Petri, em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme para proteger da poeira.

1. Para agulhas de injeção, puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,58 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta (ver lista de materiais). Prefere agulhas curtas e finas (parte afunilada de cerca de 5 mm), como eles são mais eficientes para perfurar o córion.
   Nota: As agulhas de injecção são de uso único.
2. Agulhas para Transplante de Células
   1. Puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,78 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta.
   2. vocêcantar uma microforge (ver lista de materiais), corte a ponta da agulha no ponto em que o diâmetro interno é de 35 uM (um pouco mais do que o diâmetro das células a serem transplantadas).
   3. Bevel a extremidade cortada do capilar com um microgrinder (ver lista de materiais) com um ângulo de 45 °.
   4. Opcionalmente, puxar uma barbela sobre a extremidade da agulha utilizando um microforge. Para isso, tocar o filamento quente com a ponta do bisel e rapidamente o puxar para fora, criando uma farpa que pode ajudar a penetração do embrião.
   5. Montar a agulha num suporte de agulha ligada a uma seringa. Usando a seringa, lavar o interior da agulha três vezes com ácido fluorídrico a 2% para eliminar os resíduos de vidro, e em seguida enxaguar três vezes com acetona.
      Cuidado: o ácido fluorídrico é tóxico, manipular sob o capô, com luvas.
      Nota: As agulhas de transplantação de células pode ser utilizado várias vezes.

2. Preparação daLoiça para injeção e Transplante de Células

1. Calor 50 ml de embrião médio ^11, que contém 0,5 g de agarose, num forno de microondas durante 1 minuto na potência máxima para obter 1% de agarose em forma de embriões. Arrefece-se a gel de agarose a cerca de 60 ° C e verter 50 ml em uma placa de Petri de 90 mm. Coloque na superfície do gel de um molde especialmente projetado (ver lista de materiais), ou com linhas para o prato de injecção ou com poços para o prato transplante de células.
   1. Observe o flutuador mofo no agarose, se a agarose não é muito quente. Depois o gel de agarose é definido, remover o molde com uma pinça (Figura 2A - B).
      Nota: os pratos podem ser armazenadas a 4 ° C, até algumas semanas. Mantê-los em uma caixa molhada fechada, para evitar a secagem.
2. Colocar a cápsula num incubador de 28 ° C 30 min antes da utilização.

3. Recolha de embriões e Injection

1. Injecção Preparação de Solução
   Nota: domínio de ligação à actinada levedura proteína 140 (SPA-140) tal como Lifeact obrigado a mCherry se liga à actina (referido como ABP140-mCherry) é usado para visualizar actina polimerizada no interior da célula, a fim de analisar a actividade protuberante. Adicione outro composto a testar a função de um gene candidato (por exemplo, ARNm de construção negativo dominante ou constitutivamente activa, ou oligonucleótidos morfolino). Para avaliar as funções de SIN1 como descrito nos resultados (Figura 3), foram utilizados oligonucleótidos morfolino. Como um controlo, foi utilizado um morfolino idêntico ao morfolino SIN1 mas durante 5 nucleótidos distribuídos ao longo da sequência de modo a que este morfolino controlo não coincidir com o ARN alvo.
   1. SIN1 Thaw e morpholinos de controlo de 5 de incompatibilidade (2 solução de ações mm) e ABP140-mCherry mRNAs no gelo. Adicionar 375 ng de mRNAs (75 ng / mL final) e 0,75 mL de quer morfolino controle SIN1 ou 5-incompatibilidade (0,3 mM final) em tampão Danieau (NaCl 58 mM, 0,7 mMKCl, 0,4 mM de _MgSO4, 0,6 mM de Ca _{(NO3) 2,} 5,0 mM de HEPES pH 7,6), para alcançar um volume total de 5 mL.
2. de colheita de embriões
   Nota: para esta montagem experimental ambos os embriões de dadores e de acolhimento são transgênicos, expressando a GFP sob o controle do Goosecoid (GSC) promotor, a fim de visualizar a placa precordial prospectivo ^11.
   1. Recolha Tg (GSC: GFP) ovos. Colocar cerca de 80 ovos em um prato de 90 milímetros de Petri cheio com o meio de embrião e incubar a 28 ° C.
3. Injetar embriões doadores
   1. Sob um microscópio estereoscópico, esprema delicadamente embriões coletadas com pinça na linhas de um prato de injeção preenchido com meio embrião. Utilizando uma pinça, orientar os embriões com as células em direção ao topo. Colocar o prato de injecção na incubadora a 28 ° C até os embriões terem atingido o estádio de 4 células (1 h após a fertilização).
   2. Coloque uma agulha de injecção com 2 ul desolução de injecção. Inserir a agulha em um suporte de agulha (ver lista de materiais) que é colocado em um micro-manipulador (ver lista de materiais) e conectado com politetrafluoretileno (PTFE) tubo (ver lista de materiais) para um Transjector ar (ver lista de materiais ).
   3. Abra o capilar tocando delicadamente a ponta com uma pinça fina. Se necessário, cortar o capilar aberto por beliscar sua extremidade.
   4. Entre uma das quatro células, com a agulha e injectar a solução no interior da célula, a fim de preencher 70% do volume da célula (2 nl). Injectar 30 embriões.
      Nota: Obtendo a agulha na célula pode ser difícil, porque a membrana plasmática é macio. Visando a junção entre a célula ea gema facilita a penetração da agulha.
   5. Coloque os embriões em 28 ° C incubadora até que tenham atingido a fase esfera (4 horas após a fertilização).

4. Preparação dos embriões para o celular Transplantatíon

1. Prepare 20 ml de meio de embrião com 200 mL de penicilina / estreptomicina (ver lista de materiais) (Pen / Strep EM).
2. Dechorionation dos embriões na fase esfera (4 h após a fertilização)
   Nota: embriões dechorionated são muito frágeis e vai explodir em caso de contacto com o ar ou plástico. Eles precisam, portanto, ser colocado em pratos revestidos com agarose, e transferido por meio de pipetas de Pasteur de vidro polido ao fogo.
   1. Usando uma pipeta de Pasteur de plástico, transferir embriões de acolhimento recolhidos no passo 3.2 e embriões de dadores injetados no passo 3.3 em duas 35 milímetros placas de Petri revestidas com agarose a 1% em meio embrião e preenchidos com Pen / Strep EM. Manter embriões de acolhimento e embriões de dadores em dois pratos separados.
   2. extrair manualmente os embriões de seus córions com uma pinça fina (ver lista de materiais).
   3. Coloque os embriões no C incubadora de 28 ° até que tenham atingido a fase escudo (6 horas após a fertilização).

Transplante 5. celular

1. Organizar os embriões para o transplante de células.
   1. Sob um microscópio estereoscópico fluorescente, selecione embriões doadores expressar ABP140-mCherry (vermelho) dentro do escudo (verde).
   2. Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões nos poços do prato de transplante de células preenchido com Pen / Strep EM. Coloque os embriões de acolhimento em uma linha e os embriões de dadores na linha limítrofe.
   3. Usando um cílio, orientar cuidadosamente os embriões com o escudo para cima.
      Nota: a posição da blindagem pode ser avaliado por expressão da GFP ou anatomicamente.
2. Transplante System Set-up.
   Nota: O sistema de transplante é composto por um suporte de agulha (ver lista de materiais) ligado com um tubo de PTFE (veja lista de Materiais) e um conector do tubo (ver lista de materiais) a uma seringa Hamilton equipado com um micro-drive (ver lista de Materiais). O suporte de agulhaestá montado sobre um micromanipulador de 3 vias (ver lista de Materiais).
   1. Utilizando um suporte de agulha ligada a uma seringa, a agulha para lavar o transplante de células com 70% de etanol. Seca-se por sucção de ar para dentro da agulha. Não secar por sopro, pois isso pode resultar em pó ficar preso na parte afilada da agulha.
   2. Inserir a agulha no suporte de agulha ligada à seringa Hamilton, com o bisel para cima.
3. Shield-to-escudo Transplante de Células
   1. Digite o escudo de um embrião doador com a agulha transplante e elaborar cerca de 10-20 células marcadas com ABP140-mCherry. Cuidadosamente evitar o desenho gema.
   2. Transplante as células para a blindagem do embrião hospedeiro. Repita até que todos os embriões de acolhimento foram transplantados.
   3. Remova todos os embriões danificados com uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Colocar os embriões transplantados na incubadora a 28 ° C e deixá-los recuperar durante cerca de 30 min.
   4. Usando uma agulhatitular ligada a uma seringa, lave a agulha transplante de células com água e colocá-lo de volta em uma placa de Petri em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme.

6. (Opcional) Transplante de Células Individual

Nota: No embrião, as células aderem umas às outras, de modo que é difícil tirar apenas uma célula em que a agulha transplante. Nós desenvolvemos um protocolo modificado para transplantar facilmente células progenitoras placa precordial individuais. A ideia é a dissociar-se as células antes de transplante. Como as células progenitoras placa precordial isolados tendem a perder a sua identidade, nós geneticamente impor-lhes uma identidade placa precordial prospectivo, pela ativação da via de sinalização Nodal, na ausência do fator de transcrição Sox32. Verificamos que estas células induzidas se comportam como células progenitoras placa precordial endógenos ^8. Abaixo estão os passos específicos para realizar transplantes de células individuais. dissocia celularção é conseguida pela colocação em embriões Ringer isenta de cálcio ^11, dissecando um explante e mecanicamente agitando-o.

1. No passo 2.1, preparar o prato transplante com 1% de agarose em Ringer livre de cálcio em vez de Embryo Médio.
2. No passo 3.1, em adição a ABP140-mCherry ARN e morfolino SIN1, adicionar 3 ng de ARN que codificam para a forma activa do receptor nodal taram-A (0,6 ng / mL final) e 1,25 ul de morfolino contra sox32 (solução mãe a 2 mM, 0,5 mM, consequentemente, final).
3. Após o passo 4, a transferência de três embriões doadores selecionados no prato para o transplante de células preenchido com Pen / Strep Ringer livre de cálcio usando uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Com uma pinça fina, dissecar um explante contendo as células injetadas (ABP140-mCherry células marcadas). Eliminar rapidamente o resto dos embriões.
4. Com um cílio, agitar suavemente o explante até que as células se dissociam.
5. Elaborar uma única célula isolada na agulha transplantee transplantá-la para a blindagem de um embrião hospedeiro.
6. Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões numa placa revestida de agarose-preenchido com Pen / Strep EM. Colocar os embriões na incubadora a 28 ° C durante 30 min.

7. Embrião de montagem

1. imagiologia Câmara
   1. Método 1: usar uma câmara de imagem composta de uma lâmina de plástico (75 * 25 * 0.5 mm) perfurado com 4 furos (5,5 mm de diâmetro), com bordas de 3 mm em um lado (Figura 2C - D). Cole uma lamela de vidro na parte de trás, com cianoacrilato cola (super cola).
      Nota: No final do experimento, coloque a câmara na água por uma noite para remover a lamela e se livrar de resíduos de cola com papel de areia.
   2. Método 2: Usar 35 mm Mattek vidro pratos inferiores (ver lista de materiais) com um buraco de 10 mm.
2. montagem embrião
   1. Encher um frasco de vidro com 1 ml de agarose quente 0,2% em meio embrião.Mantê-la a 42 ° C num bloco de calor.
   2. Sob o microscópio estereoscópico fluorescente, selecionar um embrião nas quais o Red células transplantadas são parte da placa precordial prospectivo marcados em verde (ou seja, células transplantadas vermelhas estão dentro da placa precordial prospectivo verde, e já começaram a migrar para o pólo animal).
   3. Transferir um embrião seleccionado para a solução de agarose com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo. Descartar o excesso de meio de embrião a partir da pipeta. Desenhar o embrião na pipeta com agarose, e transferência do embrião na câmara de imagem, depositar uma gota de agarose. Antes de agarose é definido, orientar o embrião com um cílio. Colocar a placa pré-cordal potencial para cima para imagiologia com um microscópio vertical, ou na parte inferior de vidro para imagiologia com um microscópio invertido. Aguardar até que a agarose é definida (cerca de 1 min, dependendo da temperatura ambiente) antes de montar outra embrião no poço seguinte da câmara.
      Nota: um cha de imagemmber contendo 4 poços permite a montagem de até 4 embriões.
   4. Quando a agarose é definido, encher a câmara com Pen / Strep EM para evitar a secagem.

8. Imagens ao vivo

1. Use um 40X de imersão em água da lente de longo alcance. Use filtros adequados para a imagem GFP e mCherry (para GFP: excitação BP 470/40, divisor de feixe FT 510, e emissão BP 540/50; para mCherry: excitação BP 578/21, divisor de feixe FT 596 e LP emissão de 641 / 75). Ajuste a duração da exposição, a fim de otimizar a dinâmica de imagem.
2. Para imagem todas as células na placa, adquirir z pilhas, começando alguns microns uma por cima da placa pré-cordal prospectivo (em ectoderme) e terminando uma alguns microns abaixo da placa pré-cordal prospectivo (na gema). Usar um passo de Z-2 uM. Para otimizar a velocidade de aquisição, mudar as cores entre Z-stacks, em vez de entre os quadros.
   Nota: Isto pode levar a pequenas diferenças entre as imagens vermelhas e verdes, mas não é um problema, já que nenhum co preciso-localization entre os sinais de verde e vermelho é necessária. Para reduzir ainda mais o tempo de imagem e exposição à luz, verde pode ser adquirida apenas uma vez a cada 5 pontos no tempo, o que é suficiente para identificar as células progenitoras placa precordial.
3. Usando essas configurações, a imagem até 4 embriões dentro do intervalo de tempo de dois minutos que é necessário analisar a frequência protrusão e orientação. Para a análise do ciclo de vida protrusão, reduzir o intervalo de tempo para 30 segundos para obter maior resolução de tempo. Imagem de 60% a 80% epiboly epiboly.

Análise 9. Dynamics celular

1. Carregar imagens 4D em ImageJ
   Nota: Dependendo do software utilizado para a aquisição, as imagens são armazenadas em formatos diferentes (um arquivo por imagem, um arquivo por z-stack, um arquivo para todo o experimento). Alguns Plugins ImageJ estão disponíveis on-line para abrir pilhas 4D. Nossos dados são armazenados como um arquivo por z-stack. Uma vez que o conjunto de dados pode ser grande, pode ser conveniente para abrir apenas uma parte dele (cerca de time pontos, ou uma sub do z-stack, ou 8-bit convertido imagens ...). Nós usamos uma custom-made ImageJ plugin para fazê-lo, o que nós ficaríamos felizes para distribuir a pedido.
2. Análise da Orientação e Freqüência de saliências celulares
   1. Use imagens GFP para determinar a direção principal da migração placa precordial prospectivo. Leve isso como uma referência para as medições angulares saliências celulares. Girar a pilha, de modo que este sentido de referência é paralelo a um dos lados da imagem.
   2. Siga uma célula. Ferramenta Selecionar ângulo. Para cada quadro e cada protuberância, utilizar a ferramenta ângulo para medir o ângulo entre a saliência e a direcção de referência (Figura 3A). Use o comando Analisar / Medir para armazenar o valor (ou pressione M no teclado). Salvar os resultados como um arquivo txt. Repita com a próxima célula.
   3. Importe os dados para distribuição ângulo trama R e como histogramas. Use o teste de Kolmogorov-Smirnov (ks.test em R) para comparar diferentes condições.
      Nota: A ferramenta ângulo fornece valores compreendidos entre 0 ° e 180 °, permitindo a utilização de testes estatísticos clássicos e os testes não circulares.
   4. Com este conjunto de dados, calcular a frequência de emissão, conforme o número de protuberâncias por célula por minuto. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições.
3. Análise do celular Saliências Lifetime
   1. Para cada célula e cada saliência, medida duração saliência (número de quadros durante o qual a saliência está presente X intervalo de tempo entre os quadros).
   2. Importe os dados para R. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições.
      Nota: Outras características de migração pode ser interessante analisar, a fim de caracterizar a migração celular. Estes incluem faixas de células, para velocidade, direção e medidas de persistência, ou morfologia celular. Alguns aplicativos de software comerciais estão disponíveis para medir estas características, mas um grande número de apli software open-sourcecátions e plugins ImageJ também estão disponíveis, como, por exemplo, adaptar-se a analisar morfodinâmica ^12, diper olhar para trajetórias celulares e persistência direcional ^13, CellTrack para rastrear limites da célula durante a migração ^14.

Resultados

A técnica apresentada foi utilizado para analisar o papel da SIN1, um dos principais componentes do Tor complexa 2 (TORC2), no controle da migração celular vivo. O uso do transplante de células permite marcação de células isoladas e análise dos efeitos em células-autônoma. Filme S1 mostra a migração de células progenitoras da placa pré-cordal transplantados. rotulagem actina com ABP140 permite a visualização fácil de saliências citoplasmáticos ricas e...

Discussão

Este protocolo apresenta uma forma fácil para estudar o papel de um gene candidato na migração de células in vivo, através da combinação da criação de embriões quiméricos que utilizam o transplante de células com imagens ao vivo.

Criação de embriões mosaico

O estudo da dinâmica de uma célula requer a visualização do seu contorno para analisar extensões citoplasmáticas. Isto pode ser conseguido por marcação das células isoladas num...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm)	Harvard Apparatus	300085	standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)	Harvard Apparatus	300085	thin-walled
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers	Dumont Fine Science Tools	11254-20	5F
glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Air transjector	Eppendorf	5246
Micro-forge	Narishige	MF-900
Microgrinder	Narishige	EG-44
Micromanipulator (for injection)	Narishige	MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation)	Leica	Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe	Narishige	IM-9B
Micropipette puller	David Kopf Instruments	Model 720
Transplantation mold	Adapative Science Tools	PT-1
Needle holder	Narishige	HI-7
Tube connector	Narishige	CI-1
PTFE tubing	Narishige	CT-1