分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

要約

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

要約

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

概要

多細胞生物において、細胞遊走は、組織や器官への細胞の組織化を確実に胚の発達のために、それが組織の恒常性（創傷治癒）および免疫性に関与する成人用の両方に必須です。これらの生理学的な機能に加えて、細胞遊走はまた、特に、癌転移を含む多様な病的状態に関与しています。

細胞遊走は、平坦な表面上での細胞の移動を確保する分子機構の全体的な理解を提供する、数十年にわたってインビトロで分析された。 インビボではしかしながら、細胞は、より複雑な環境に直面しています。明らかに、移行を誘導する細胞や分泌ケモカイン隣接、そのような細胞外マトリックスとして生体内移行が外部の合図によって影響され得ることは、過去数年に登場し、その記載されているものと異なる場合があり、細胞移動を駆動機構のin vitroで^1,2。 生体内の細胞遊走に確保するメカニズムは、in vitro試験に比べて、主に増加した技術的な困難のため、これまであまり注目されてきた。特に、細胞遊走のインビボ分析遊走細胞への直接的な光アクセスを必要とする、でユニークな細胞を標識するためのテクニックその原動力と形態、ならびにゲインまたは機能の損失を見るためには、候補遺伝子の役割をテストするために近づきます。これまでのところ、これらの特性を保有するだけ少数のモデル系は、 インビボ細胞遊走³ に切開するために使用されています。

我々は最近、 生体内の細胞遊走^4,5 に制御する際に候補遺伝子の機能を評価するために、新しい便利なモデルシステムとして初期のゼブラフィッシュの胚に前向き脊索前板の移行を使用していました。 （また、前方の中内として知られている）前向き脊索前板はGASTの開始時に形成する細胞群であります胚の背側にrulation。原腸形成時に、このグループをまとめ脊索前板、中内胚葉の肥厚、脊索に前方、および神経板の下にあるを形成するために、胚^6-8の動物極に向かって移動します。その後部の可能性が高い中胚葉^9を頭に貢献しながら、脊索前板の前方部分は、孵化腺を生じさせます。外部開発及び魚類胚の光学的透明度のおかげで、細胞遊走を直接かつ容易にこの構造では観察することができます。

細胞移植は、モザイク胚¹⁰を迅速かつ簡単に作成できます非常に強力なテクニックです。単離された細胞を標識に移植された細胞の結果で蛍光細胞骨格マーカーを発現する、の形態とダイナミクスを容易に観察することができます。機能の喪失またはゲインにこれ​​をアプローチ組み合わせることにより、缶の細胞自律的な機能の分析を可能にしますdidate遺伝子。

提示されたプロトコルは、我々は生体内 ⁵ に細胞遊走およびアクチンダイナミクスを制御する際にTORC2コンポーネントSIN1の機能を評価する方法について説明します。しかし、結果に記載し、さらに説明するように、 インビボでの細胞遊走を制御する任意の候補遺伝子の潜在的な含意を分析するために使用することができます。

プロトコル

注： 図1は、プロトコルの概要を提示します。

注射や移植のための針の作製

注針はいつでも調製し、保存することができます。粘土の帯に、ペトリ皿に保管してください。ほこりから保護するために、パラフィルムで皿を密封します。

1. 注射針の場合は、マイクロピペットプラーで（ 材料のリストを参照）（フィラメント（ 材料のリストを参照）することなく、直径0.58ミリメートルの内部に、直径1.0ミリメートル外）ガラスキャピラリーを引き出します。彼らは絨毛膜を貫通するためのより効率的であるように短く、細い針（約5mmのテーパー部）を好みます。
   注：注射針は使い捨てです。
2. 細胞移植のための針
   1. マイクロピペットプラーと（フィラメント（ 材料のリストを参照）することなく、直径0.78ミリメートルの内部に、直径1.0ミリメートル外）ガラスキャピラリーを引き出します。
   2. U（材料のリストを参照）マイクロフォージを歌う、内径は（移植する細胞の直径よりもわずかに多く）は35μmである点で、針の先端を切りました。
   3. 45°の角度でベベルmicrogrinderと毛細血管の切断端（ 材料のリストを参照）。
   4. 必要に応じて、マイクロフォージを使用して、針の先端にバーブを引っ張ります。このために、傘の先端で熱フィラメントに触れると急速に胚を貫通することができバーブを作成し、それを引き離します。
   5. 注射器に取り付けられた針ホルダーの針をマウントします。シリンジを用いて、ガラスの残留物を除去し、次いで、アセトンで3回リンスし、2％フッ化水素酸で針の内部を3回洗浄します。
      注意：フッ酸は毒性があり、手袋をして、ボンネットの下に操作します。
      注：細胞移植針を数回使用することができます。

の調製インジェクションおよび細胞移植のための食器

1. 熱フルパワーで1分間電子レンジでアガロース0.5gを含む¹¹培地胚50mlの胚培地中で1％アガロースを取得します。約60℃まで、アガロースゲルを冷却し、90 mmのペトリ皿中で50ミリリットル注ぎます。特別に設計された金型（材料のリストを参照）、いずれかの注射皿のためのラインで、または細胞移植皿のためのウェルを有するゲルの表面に配置します。
   1. アガロースが高すぎない場合、アガロースに金型floatを守ってください。アガロースゲルが設定された後、鉗子（ - B 図2A）で金型を削除します。
      注：料理は数週間まで、4℃で保存することができます。乾燥を避けるために、閉じられた湿った箱に保管してください。
2. 使用前に28℃のインキュベーターで30分で皿を置きます。

3.胚の収集と注入

1. 注射溶液の調製
   注：アクチン結合ドメイン酵母アクチンのmCherryを（ABP140-mCherryをと呼ばれる）に結合したそのようなLifeactような結合タンパク質140（ABP-140）は、突出活性を分析するために、細胞内の重合アクチンを可視化するために使用されます。候補遺伝子（ドミナントネガティブまたは構成的に活性な構築物を例えば、mRNA、またはモルホリノオリゴヌクレオチド）の機能をテストするために他の化合物を追加します。結果（ 図3）に記載のようにSIN1の機能を評価するために、我々は、モルホリノオリゴヌクレオチドを使用します。対照として、我々はSIN1のモルホリノと同一のモルホリノを使用するが、この制御モルホリノは標的RNAと一致しないように配列に沿って分布する5ヌクレオチドについて。
   1. 解凍SIN1と5-ミスマッチ対照モルホリノ（2 mMのストック溶液）、そして氷上でABP140-mCherryをするmRNA。 mRNAの375 ngの（75 ngの/最終μL）およびSIN1または5-ミスマッチ対照モルホリノいずれかの0.75μL（0.3 mMの最終）Danieauバッファー（58 mMの塩化ナトリウム、0.7mMの中を追加KCl、0.4mMのMgSO ₄を、0.6ミリモルのCa（NO _3）2、5.0 mMのHEPES pHは7.6）を、5μlの総体積に到達します。
2. 胚コレクション
   注：両方のドナーとホスト胚は将来の脊索前板^11を可視化するために、 グースコイド （GSC）プロモーターの制御下でGFPを発現する、トランスジェニックで設定し、この実験のために。
   1. 卵：Tgは（GFP GSC）を収集します。胚培地で満たされた90ミリメートルペトリ皿に約80卵を置き、28℃でインキュベートします。
3. ドナー胚を注入
   1. 実体顕微鏡下では、静かに胚培地で満たされた注射皿のラインにピンセットで収集した胚を絞ります。鉗子を使用して、上部に向かって細胞と胚を向けます。胚は4細胞期（1時間後に受精）に到達するまで28℃のインキュベーター内注入皿を置きます。
   2. の2μlの注射針をロード注射液。空気transjectorに（材料のリストを参照してください）マイクロマニピュレーターに入れ、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブ（ 材料のリストを参照）に接続された針ホルダ（材料のリストを参照）で針を挿入します（材料のリストを参照してください。 ）。
   3. 優しく細かい鉗子で先端を触れることにより、キャピラリーを開きます。必要に応じて、その先端をつまんでオープンキャピラリーを切りました。
   4. 針で4つのセルのいずれかを入力し、細胞容積（2 NL）の70％を満たすために、セル内の溶液を注入します。 30胚を注入します。
      注：原形質膜が柔らかいように、細胞に針を得ることは、困難な場合があります。細胞と卵黄の間の接合部に目指して針の貫通を容易にします。
   5. 彼らは球ステージ（4時間後に受精）に到達するまで28℃のインキュベーターで胚を置きます。

セルTransplantatのための胚の4準備イオン

1. 200μlのペニシリン/ストレプトマイシン（材料のリストを参照してください）​​（ペニシリン/ストレプトマイシンEM）で胚培地20mlを準備します。
2. 球の段階での胚のDechorionation（4時間後の受精）
   注：Dechorionated胚は非常に壊れやすく、空気やプラスチックとの接触の場合に爆発します。したがって、これらは、アガロースでコーティングされた皿に入れ、ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて転送する必要があります。
   1. プラスチック製パスツールピペットを用いて、胚培地に1％アガロースで被覆し、ペニシリン/ストレプトマイシンEMで充填された2つの35ミリメートルペトリ皿にステップ3.3で注入ステップ3.2で収集ホスト胚およびドナー胚を移します。二つの別々の皿でホスト胚およびドナー胚を保管してください。
   2. 手動で微ピンセット（材料のリストを参照）との絨毛膜から胚を抽出します。
   3. 彼らはシールドステージ（6時間後に受精）に到達するまで28℃のインキュベーターで胚を置きます。

5.細胞移植

1. 細胞移植のために胚を配置します。
   1. 蛍光実体顕微鏡下では、選択したドナー胚はABP140-mCherryをシールド内（赤）（緑）を発現します。
   2. ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、ペニシリン/ストレプトマイシンEMで満たされた細胞移植皿のウェルに胚を移します。隣の行に1行のホスト胚およびドナー胚を置きます。
   3. まつげを使用して、慎重にシールドを上にして胚を向けます。
      注：シールドの位置は、GFP発現または解剖学によって評価することができます。
2. 移植システムセットアップ。
   注：移植システムは、マイクロドライブを搭載したハミルトンシリンジにPTFEチューブ（ 材料のリストを参照）、チューブコネクタに接続された針ホルダ（材料のリストを参照してください）（ 材料のリストを参照）で構成されている（リストを参照してください材料の）。持針器3ウェイマイクロマニピュレータに搭載されている（ 材料のリストを参照）。
   1. 注射器に取り付けられた針ホルダを使用して、70％エタノールで細胞移植のために針をすすぎます。針に空気を吸い込むことにより、ドライ。これは埃が針のテーパ部で立ち往生になる可能性があるため、吹き付けて乾燥させないでください。
   2. ベベル上向きで、ハミルトンシリンジに接続された針ホルダーに針を挿入します。
3. シールド・ツー・シールド細胞移植
   1. 移植針でドナー胚のシールドを入力し、ABP140-mCherryをで標識された約10〜20セルを描きます。慎重に卵黄を描く避けます。
   2. 宿主胚のシールドに細胞を移植します。すべてのホスト胚を移植されるまで繰り返します。
   3. ファイアーポリッシュパスツールピペットで破損した胚を削除します。 28℃のインキュベーターで移植した胚を置き、それらを約30分間回復しましょう​​。
   4. 針を使用して注射器に取り付けたホルダーは、水で細胞移植針をすすぎ、粘土のバンドにペトリ皿に戻ってそれを置きます。パラフィルムで皿を密封します。

6.（任意）単一細胞移植

注：移植針で1つのセルだけを描画することが困難であるように胚では、細胞は、互いに接着します。私たちは、簡単に、単一の脊索前板前駆細胞を移植するために修正されたプロトコルを開発しました。アイデアは、移植前に細胞を解離することです。単離された脊索前板前駆細胞は、それらの同一性を失う傾向があるので、我々は、遺伝子Sox32転写因子の非存在下で、Nodalのシグナル伝達経路を活性化することによって、それらを将来の脊索前板の同一性を課します。我々は、これらの誘導された細胞は、内因性脊索前板前駆細胞⁸のように振る舞うことを確認しました。以下は、単一細胞移植を実行するための具体的な手順は次のとおりです。細胞dissociaンは、カルシウムを含まないリンガー¹¹に胚を置く植片を解剖し、機械的にそれを攪拌することにより達成されます。

1. ステップ2.1では、代わりに胚中のカルシウムフリーリンガー中の1％アガロースでの移植の料理を準備。
2. ステップ3.1では、ABP140-mCherryをRNAおよびSIN1モルホリノに加えて、2で3（最終0.6 ngの/μl）をノーダル受容体Taram-Aの活性形態をコードするRNAのngのとsox32に対するモルホリノの1.25μlの（ストック溶液を追加mMの、したがって、0.5 mMの最終）。
3. ステップ4の後、ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、ペニシリン/ストレプトマイシンカルシウムフリーリンガーで満たされた細胞移植のため皿に3つの選択されたドナー胚を移します。細かいピンセットで、注入された細胞（ABP140-mCherryを標識された細胞）を含む外植を分析。急速に胚の残りを捨てます。
4. 細胞が解離するまでまつ毛と、そっと外植片をかき混ぜます。
5. 移植針で単一の単離された細胞を描きますそして、宿主胚のシールドにそれを移植。
6. ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、ペニシリン/ストレプトマイシンEMで満たされたアガロースでコーティングされた皿に胚を移します。 30分間28℃のインキュベーターで胚を置きます。

取り付け7.胚

1. イメージング商工会議所
   1. 方法1：1の側（ 図2C - D）に3ミリメートル高いエッジで、4つの穴（5.5ミリメートルの直径）が貫通プラスチックスライド（75 * 25 * 0.5ミリメートル）で構成される撮像チャンバを使用しています。シアノアクリレート系接着剤（スーパーグルー）で、裏面のカバーガラスを接着。
      注意：実験の最後に、カバースリップを削除し、サンドペーパーで接着剤残基を取り除くために一晩水にチャンバーを配置。
   2. 方法2：10ミリメートル穴と35ミリメートルマテックのガラスボトムディッシュを（ 材料のリストを参照）を使用します。
2. 胚の取り付け
   1. 胚培地中でホット0.2％アガロースの1ミリリットルのガラスバイアルを埋めます。ヒートブロックで42℃で、それを保管してください。
   2. 蛍光実体顕微鏡下では、移植された細胞を赤くした胚を選択し、緑色で標識された将来の脊索前板の一部（ すなわち赤移植された細胞は緑色の将来の脊索前板内にあり、かつ動物極に向かって移行し始めている）されています。
   3. ファイアーポリッシュパスツールピペットでアガロース溶液中に、選択した胚を転送します。ピペットからの胚培地の過剰を捨てます。アガロースとピペットで胚を描き、撮像チャンバ内に胚を転送する、アガロースの液滴を堆積させます。アガロースが設定される前に、まつげを持つ胚を向けます。正立顕微鏡とイメージングのために上向きに前向き脊索前板を置き、または倒立顕微鏡の撮像用ガラス底に。アガロースは、チャンバーの次のウェル内の別の胚をマウントする前に（室温に応じて、1分程度）に設定されるまで待ちます。
      注：イメージング茶4ウェルを含むmberは4胚まで取り付けることができます。
   4. アガロースが設定されている場合、乾燥を避けるために、ペニシリン/ストレプトマイシンEMでチャンバを充填します。

8.ライブイメージング

1. 40X水浸長距離レンズを使用してください。 GFPのために（画像GFPとmCherryをに適切なフィルターセットを使用します。励起BP 40分の470、ビームスプリッタFT 510、及び発光BP 50分の540; mCherryをするために：励起BP 21分の578、ビームスプリッタFT 596、および発光LP 641 / 75）。画像のダイナミクスを最適化するために、露光時間を調整します。
2. プレート内のすべてのセルの画像に、（外胚葉中）前向き脊索前板上記数μmを開始し、（卵黄中）前向き脊索前板下の数μmを終了、z軸スタックを取得します。 2ミクロンのzステップを使用してください。取得速度を最適化するために、z軸スタックの間ではなく、フレーム間で色を切り替えます。
   これは、緑と赤の画像間のわずかな違いにつながる可能性があり、ない正確な共同以来の問題ではありません注：緑と赤の信号の間-localizationが必要となります。光をさらに撮像時間と暴露を低減するために、緑のは一度だけ脊索前板前駆細胞を同定するのに十分である、すべての5つの時間点を、取得することができます。
3. 突起周波数および方位を分析する必要がある2分の時間間隔内で4の胚に、画像のような設定を使用して。突起寿命の分析のために、より高い時間分解能を得るために30秒の時間間隔を減少させます。 80％の被包に60％の被包からの画像。

9.細胞動態解析

1. ImageJの中に4D画像を読み込みます
   注：取得のために使用するソフトウェアによっては、画像が異なる形式で保存されている（画像ごとに1ファイル、zスタックごとに1ファイル、実験全体に1つのファイル）。いくつかのImageJのプラグイン4Dスタックを開くことがオンラインで入手できます。我々のデータは、zスタックごとに1つのファイルとして格納されます。データセットが大きくなる可能性があるので、それの一部だけ（いくつかのティムを開くために便利ですeは点、またはzスタックの下位区分、または8ビットの変換画像...）。私たちは、リクエストに応じて配布するために幸せになるこれは、そうするためにカスタムメイドのImageJのプラグインを使用します。
2. オリエンテーションの分析および細胞突起の頻度
   1. 将来の脊索前板の移動の主方向を決定するために、GFPの画像を使用してください。細胞突起角の測定のための基準としてこれを取ります。この基準方向が画像の一辺と平行になるように、スタックを回転させます。
   2. 一つのセルに従ってください。角度ツールを選択します。各フレームおよび各突出部は、突出部と基準方向（ 図3A）との間の角度を測定するために、角度ツールを使用します。 （キーボード上やプレスM）の値を格納するために測定/分析コマンドを使用します。 txtファイルとして結果を保存します。次のセルで繰り返します。
   3. ヒストグラムとしてR、プロットの角度分布にデータをインポートします。さまざまな条件を比較するためにコルモゴロフ - スミルノフ検定（Rでks.test）を使用します。
      注：角度ツールは、古典的な統計的検定と円形でないテストの使用を可能にする、0°と180°の間に含まれる値を提供します。
   4. このデータセットを用いて、毎分細胞あたりの突起の数と発光周波数を算出します。使用異なる条件を比較するスチューデントT検定（Rでt.test）。
3. 細胞突起寿命の解析
   1. 各セルと各突出部は、突出期間（突起がフレーム間に存在するのx時間間隔である間のフレーム数）を測定します。
   2. さまざまな条件を比較するためにR.使用スチューデントT検定（Rでt.test）にデータをインポートします。
      注：他のマイグレーション機能は、細胞遊走を特徴づけるために分析することは興味深いことができます。これらは、速度、方向、持続性の測定のための細胞トラック、または細胞の形態が含まれます。いくつかの商用ソフトウェア・アプリケーションは、これらの機能を測定するために利用可能であるが、オープンソース・ソフトウェア・アプリの数が多いですカチオンとImageJのプラグインは、細胞の軌跡と指向性持続性¹³を見てDiPer、例えばとしてmorphodynamics ^12を分析することADAPT、また、移行¹⁴時のセルの境界を追跡するCellTrackご利用いただけます。

結果

提示された技術は、 インビボ細胞遊走に制御する際に、SIN1、Torの錯体2（TORC2）のコア要素の1つの役割を分析するために使用しました。細胞移植の使用は、単離された細胞と細胞自律的効果の分析の標識化を可能にします。映画S1は、移植脊索前板前駆細胞の遊走を示しています。 ABP140とアクチン標識がアクチン豊富な細胞質突起の容易な可視化を可能?...

ディスカッション

このプロトコルは、ライブイメージングと細胞移植を使用してキメラ胚の生成を組み合わせることにより、 インビボでの細胞遊走における候補遺伝子の役割を研究するための簡単な方法を提示します。

モザイク胚の作成

細胞のダイナミクスを研究することは、細胞質拡張を分析するために、その輪郭の可視化が必要となります。良好な視覚的...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm)	Harvard Apparatus	300085	standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)	Harvard Apparatus	300085	thin-walled
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers	Dumont Fine Science Tools	11254-20	5F
glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Air transjector	Eppendorf	5246
Micro-forge	Narishige	MF-900
Microgrinder	Narishige	EG-44
Micromanipulator (for injection)	Narishige	MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation)	Leica	Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe	Narishige	IM-9B
Micropipette puller	David Kopf Instruments	Model 720
Transplantation mold	Adapative Science Tools	PT-1
Needle holder	Narishige	HI-7
Tube connector	Narishige	CI-1
PTFE tubing	Narishige	CT-1