en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Résumé

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Résumé

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Introduction

Dans les organismes multicellulaires, la migration cellulaire est essentielle à la fois pour le développement de l'embryon où elle assure l'organisation des cellules dans les tissus et organes, et la vie adulte, où elle participe à l'homéostasie tissulaire (cicatrisation des plaies) et l'immunité. En plus de ces fonctions physiologiques, la migration des cellules est également impliqué dans diverses situations pathologiques, y compris, en particulier, les métastases du cancer.

La migration cellulaire a été analysée in vitro pendant des décennies, fournissant une compréhension globale des mécanismes moléculaires assurant les mouvements cellulaires sur des surfaces planes. In vivo cependant, les cellules sont confrontés à un environnement plus complexe. Il est apparu clairement au cours des dernières années que la migration au sein d'un organisme peut être influencé par des signaux externes tels que la matrice extracellulaire, des cellules ou des chimiokines sécrétées guidage migration voisine, et que les mécanismes d'entraînement la migration cellulaire peut varier de ce qui a été décrit in vitro ^1,2. Les mécanismes assurant la migration cellulaire in vivo ont reçu moins d' attention jusqu'à présent, principalement en raison de la difficulté technique accrue, par rapport à des études in vitro. In vivo analyse de la migration cellulaire , en particulier nécessite un accès optique directe aux cellules migrantes, techniques pour marquer les cellules uniques afin de voir leur dynamique et leur morphologie, ainsi que le gain ou la perte de fonction des approches pour tester le rôle des gènes candidats. Jusqu'à présent, seuls quelques systèmes modèles hébergeant ces caractéristiques ont été utilisées pour disséquer vivo la migration cellulaire ^3.

Nous avons récemment utilisé la migration de la plaque préchordale prospective dans les embryons de poisson zèbre début comme un nouveau système de modèle pratique pour évaluer la fonction des gènes candidats dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo ^4,5 dans. Plaque préchordale prospective (également connu sous mesendoderm antérieur) est un groupe de cellules formant au début de Gastrulation sur la face dorsale de l'embryon. Au cours de la gastrulation ce groupe migre collectivement vers le pôle animal de l'embryon ^6-8, pour former la plaque préchordale, un épaississement de mesendodermal, antérieure à la notochorde, et qui sous - tend la plaque neurale. La partie antérieure de la plaque préchordale donnera lieu à l' éclosion de la glande, tandis que sa partie postérieure contribue probablement à la tête mésoderme ^9. Merci au développement externe et de la clarté optique de l'embryon de poisson, la migration cellulaire peut être directement et facilement observée dans cette structure.

La transplantation de cellules est une technique très puissante qui permet la création rapide et facile des embryons en mosaïque ^10. Exprimer des marqueurs fluorescents cytosquelette dans les résultats des cellules transplantées dans l'étiquetage des cellules isolées, la morphologie et la dynamique qui peuvent être facilement observés. La combinaison de cette perte ou gain de fonction des approches permet l'analyse des fonctions des cellules autonomes d'une boîtegène didat.

Le protocole présenté décrit comment nous avons évalué la fonction de la composante sin1 de TORC2 dans le contrôle de la migration cellulaire et l' actine dynamique in vivo ^5. Mais, comme mentionné dans les résultats et discuté plus loin, il pourrait être utilisé pour analyser l'implication potentielle d'un gène candidat pour contrôler la migration des cellules in vivo.

Protocole

Remarque: La figure 1 présente les grandes lignes du protocole.

1. Préparation des aiguilles pour injection et la transplantation

Remarque: Les aiguilles peuvent être préparés à tout moment et stocké. Gardez-les dans une boîte de Pétri, sur une bande de pâte à modeler. Sceller le plat avec du parafilm pour protéger de la poussière.

1. Pour aiguilles d'injection, tirez un capillaire en verre (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,58 mm, sans filament (voir la liste des matériaux)) avec un extracteur micropipette (voir la liste des matériaux). Préférez aiguilles courtes et minces (partie conique d'environ 5 mm), car ils sont plus efficaces pour percer le chorion.
   Remarque: Les aiguilles d'injection sont à usage unique.
2. Aiguille pour la transplantation de cellules
   1. Tirez un capillaire en verre (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,78 mm, sans filament (voir la liste des matériaux)) avec un extracteur micropipette.
   2. Uchanter une microforge (voir la liste des matériaux), couper la pointe de l'aiguille au point où le diamètre intérieur est de 35 um (un peu plus que le diamètre des cellules à transplanter).
   3. Bevel le bout du capillaire avec un micromoteur (voir la liste des matériaux) avec un angle de 45 ° de coupe.
   4. Eventuellement, tirer un ardillon sur l'extrémité de l'aiguille en utilisant un microforge. Pour cela, appuyez sur le filament chaud avec la pointe du biseau et tirez rapidement loin, créant une barbe qui peut aider à pénétrer l'embryon.
   5. Monter l'aiguille sur un porte-aiguille fixée à une seringue. À l'aide de la seringue, rincer l'intérieur de l'aiguille à trois reprises avec de l'acide fluorhydrique à 2% pour éliminer les résidus de verre, puis rincer trois fois avec de l'acétone.
      Attention: l'acide fluorhydrique est toxique, manipuler sous le capot, avec des gants.
      Remarque: Les aiguilles de transplantation de cellules peuvent être utilisés plusieurs fois.

2. Préparation de laVaisselle pour injection et Cell Transplantation

1. Chauffer 50 ml d'embryon moyenne ¹¹ contenant 0,5 g d'agarose dans un micro - ondes pendant 1 min à pleine puissance pour obtenir 1% d' agarose dans un milieu d'embryon. Refroidir le gel d'agarose à environ 60 ° C et verser 50 ml dans une boîte de Pétri 90 mm. Placer à la surface du gel un moule spécialement conçu (voir la liste de matériel), soit avec des lignes pour le plat d'injection ou de puits pour le plat de la transplantation de cellules.
   1. Observez le flotteur de moule sur l'agarose, si l'agarose est pas trop chaud. Après le gel d' agarose est réglé, retirer le moule avec une pince (Figure 2A - B).
      Remarque: Les plats peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à quelques semaines. Gardez-les dans une boîte humide fermée, pour éviter le séchage.
2. Placer le plat dans un 28 ° C incubateur 30 min avant utilisation.

3. Collecte des embryons et injection

1. Injection Solution Préparation
   Remarque: domaine de liaison à l'actinede la levure de protéines 140 (ABP-140), tels que Lifeact lié à mCherry actine (dénommé ABP140-mCherry) est utilisée pour visualiser l'actine polymérisée dans la cellule, afin d'analyser l'activité protrusion. Ajouter un composé à tester la fonction d'un gène candidat (par exemple , l' ARNm de construction négative ou constitutivement active dominante, ou des oligonucléotides morpholino). Pour évaluer les fonctions de sin1 comme décrit dans les résultats (Figure 3), nous avons utilisé des oligonucléotides morpholino. Comme témoin, on a utilisé un groupe morpholino identique à celui sin1 morpholino , mais pour 5 nucléotides répartis le long de la séquence de telle sorte que ce contrôle morpholino ne correspond pas à l'ARN cible.
   1. Sin1 Décongeler et morpholinos de contrôle 5-mismatch (solutions mères 2 mM), et ABP140-mCherry ARNm sur la glace. Ajouter 375 ng d'ARNm (75 ng / ul final) et 0,75 ul de sin1 ou 5-mismatch morpholino de contrôle (0,3 mM final) dans un tampon Danieau (58 mM de NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM _MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO _{3) 2,} 5,0 mM de HEPES , pH 7,6) pour atteindre un volume total de 5 ul.
2. Embryo Collection
   Remarque: pour cette expérimentation a mis en place les deux embryons donateurs et d' accueil sont transgéniques, exprimant la GFP sous le contrôle de l'goosecoid (SGC) promoteur afin de visualiser la plaque préchordale prospective ^11.
   1. Recueillir Tg (SGC: gfp) œufs. Placez environ 80 oeufs dans un plat de 90 mm de Pétri remplie avec le milieu de l'embryon et incuber à 28 ° C.
3. Injecter Embryons donateurs
   1. En vertu d'un stéréomicroscope, presser doucement embryons collectés avec une pince dans les lignes d'un plat d'injection rempli avec le milieu de l'embryon. En utilisant des pinces, orienter les embryons avec les cellules vers le haut. Placer le plat d'injection dans l'incubateur à 28 ° C jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade 4 cellules (1 h après la fécondation).
   2. Charger une aiguille d'injection avec 2 pi deSolution d'injection. Insérez l'aiguille dans un porte-aiguille (voir la liste des matériaux) qui est placé dans un micro-manipulateur (voir la liste des matériaux) et de raccords en polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube (voir la liste des matériaux) à un transjecteur d'air (voir la liste des matériaux ).
   3. Ouvrez le capillaire en touchant doucement la pointe avec une pince fine. Si nécessaire, couper le capillaire ouvert en pinçant son extrémité.
   4. Entrer dans l'un des quatre cellules avec l'aiguille et injecter la solution dans la cellule afin de remplir 70% du volume de la cellule (2 nl). Injecter 30 embryons.
      Remarque: Obtenir l'aiguille dans la cellule peut être difficile, car la membrane plasmique est douce. Visant à la jonction entre la cellule et le jaune facilite la pénétration de l'aiguille.
   5. Placer les embryons dans le 28 ° C incubateur jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de la sphère (4 heures après la fécondation).

4. Préparation de la Embryons pour la Cellule Transplantation

1. Préparer 20 ml de milieu d'embryon avec 200 ul de pénicilline / streptomycine (voir la liste des matériaux) (Pen / Strep EM).
2. Dechorionation des embryons au stade de la sphère (4 heures après la fécondation)
   Remarque: les embryons dechorionated sont très fragiles et vont exploser en cas de contact avec de l'air ou de plastique. Ils doivent donc être placés dans des boîtes d'agarose revêtues, et transférés avec des pipettes Pasteur en verre poli au feu.
   1. En utilisant une pipette Pasteur en plastique, transférer les embryons hôtes recueillies à l'étape 3.2 et les embryons donneurs injectés à l'étape 3.3 en deux 35 mm des boîtes de Petri revêtues d'agarose à 1% dans le milieu de l'embryon et remplis de Pen / Strep EM. Gardez embryons hôtes et des embryons donateurs dans deux plats séparés.
   2. extraire manuellement les embryons de leurs chorions avec des pinces fines (voir la liste des matériaux).
   3. Placer les embryons dans le 28 ° C incubateur jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de blindage (6 heures après la fécondation).

5. Cell Transplantation

1. Disposer les embryons pour la transplantation de cellules.
   1. Sous un stéréomicroscope fluorescent, sélectionner des embryons donateurs exprimant ABP140-mCherry (rouge) dans le bouclier (vert).
   2. En utilisant une pipette Pasteur polie au feu, transférer les embryons dans les puits de la boîte de transplantation de cellules remplie de Pen / Strep EM. Placer les embryons hôtes dans une rangée et les embryons donateurs dans la rangée voisine.
   3. L'utilisation d'un cil, orienter soigneusement les embryons avec le bouclier vers le haut.
      Remarque: la position de l'écran peut être évaluée par l'expression de la GFP ou anatomiquement.
2. Transplantation System Set-up.
   Remarque: Le système de transplantation est composé d'un porte-aiguille (voir la liste des matériaux) relié à un tube de PTFE (voir la liste des matériaux) et un connecteur de tube (voir la liste des matériaux) à une seringue Hamilton équipée d'un micro-drive (voir la liste des matériaux). Le porte-aiguilleest montée sur un micromanipulateur 3 voies (voir la liste des matériaux).
   1. Au moyen d'un porte-aiguille fixée à une seringue, rincer l'aiguille pour la transplantation de cellules avec 70% d'éthanol. Sec en aspirant l'air dans l'aiguille. Ne pas sécher en soufflant, car cela peut entraîner dans la poussière se coincer dans la partie conique de l'aiguille.
   2. Insérer l'aiguille dans le porte-aiguille reliée à la seringue Hamilton, avec le biseau vers le haut.
3. Bouclier à bouclier Cell Transplantation
   1. Entrez le bouclier d'un embryon donneur avec l'aiguille de transplantation et établit environ 10-20 cellules marquées avec ABP140-mCherry. Eviter soigneusement dessin jaune.
   2. Transplanter les cellules dans le bouclier de l'embryon hôte. Répétez jusqu'à ce que tous les embryons hôtes ont été transplantés.
   3. Retirez tous les embryons endommagés avec une pipette Pasteur polie au feu. Placer les embryons transplantés dans l'incubateur à 28 ° C et laissez-les récupérer pendant environ 30 min.
   4. En utilisant une aiguillesupport fixé à une seringue, rincer l'aiguille de transplantation de cellules avec de l'eau et placez-le dans une boîte de Pétri sur une bande de pâte à modeler. Sceller le plat avec du parafilm.

6. (EN OPTION) Single Cell Transplantation

Remarque: Dans l'embryon, les cellules adhèrent les unes aux autres, de sorte qu'il est difficile d'en tirer une seule cellule dans l'aiguille de transplantation. Nous avons développé un protocole modifié pour transplanter facilement les cellules progénitrices plaque préchordale simples. L'idée consiste à dissocier les cellules avant transplantation. Parce que les cellules progénitrices plaque préchordale isolées ont tendance à perdre leur identité, nous les imposons génétiquement une identité de plaque préchordale prospective, en activant la voie de signalisation Nodal, en l'absence du facteur de transcription Sox32. Nous avons vérifié que les cellules induites se comportent comme des cellules progénitrices plaque préchordale endogènes ^8. Voici les étapes spécifiques pour effectuer des transplantations de cellules isolées. cellule dissociation est obtenue en plaçant des embryons dans Ringer sans ^calcium-11, la dissection d' un explant et mécaniquement en remuant.

1. A l'étape 2.1, préparer le plat de transplantation avec 1% d'agarose dans Ringer sans calcium au lieu de Embryo Medium.
2. A l' étape 3.1, en ​​plus de ABP140-mCherry ARN et morpholino sin1, ajouter 3 ng d'ARN codant pour la forme active du récepteur Nodal Taram-A (0,6 ng / ul final) et 1,25 ul de morpholino contre sox32 (solution mère à 2 mM, d'où 0,5 mM final).
3. Après l'étape 4, le transfert de trois embryons donneurs sélectionnés dans le plat pour la transplantation de cellules remplie de Pen / Strep Ringer sans calcium à l'aide d'une pipette Pasteur polie au feu. Avec des pinces fines, disséquer un explant contenant les cellules injectées (cellules marquées ABP140-mCherry). Rapidement jeter le reste des embryons.
4. Avec un cil, remuer doucement jusqu'à ce que l'expiant cellules se dissocient.
5. Dressez une seule cellule isolée dans l'aiguille de transplantationet le transplanter dans le bouclier d'un embryon hôte.
6. En utilisant une pipette Pasteur polie au feu, transférer les embryons dans un plat d'agarose revêtu rempli de Pen / Strep EM. Placer les embryons dans l'incubateur à 28 ° C pendant 30 min.

7. Embryon de montage

1. Imaging Chambre
   1. Méthode 1: utiliser une chambre d'imagerie composée d'une lame en plastique (75 * 25 * 0,5 mm) percé de 4 trous (diamètre 5,5 mm), avec 3 mm des bords élevés sur un côté (figure 2C - D). Collez une lamelle de verre sur la face arrière, avec la colle cyanoacrylate (super glue).
      Remarque: A la fin de l'expérience, placer la chambre dans l'eau pendant une nuit pour enlever la lamelle et de se débarrasser des résidus de colle avec du papier de verre.
   2. Méthode 2: utiliser 35 mm MatTek plats à fond de verre (voir la liste des matériaux) avec un trou de 10 mm.
2. embryon de montage
   1. Remplir un flacon en verre avec 1 ml de chaud 0,2% d'agarose dans un milieu d'embryon.Gardez-le à 42 ° C dans un bloc thermique.
   2. Sous le stéréomicroscope fluorescent, sélectionnez un embryon dans lequel les globules rouges transplantés font partie de la plaque préchordale prospective marquée en vert ( à savoir les cellules transplantées rouges sont dans la plaque préchordale prospective verte, et ont commencé à migrer vers le pôle animal).
   3. Transfert d'un embryon sélectionné dans la solution d'agarose avec une pipette Pasteur polie au feu. Jeter l'excès de milieu d'embryon de la pipette. Dessiner l'embryon dans la pipette avec de l'agarose et transfert de l'embryon dans la chambre d'imagerie, le dépôt d'une goutte d'agarose. Avant agarose est défini, orienter l'embryon avec un cil. Placer la plaque préchordale potentiel vers le haut pour l'imagerie avec un microscope droit ou sur le fond en verre pour une imagerie avec un microscope inversé. Attendez jusqu'à ce que l'agarose est fixé (environ 1 min, en fonction de la température ambiante) avant de monter un autre embryon dans le prochain puits de la chambre.
      Remarque: un cha d'imageriembre contenant 4 puits permet de monter jusqu'à 4 embryons.
   4. Lorsque l'agarose est réglé, remplir la chambre avec Pen / Strep EM pour éviter le séchage.

8. Imagerie en direct

1. Utilisez un objectif à long terme 40X immersion dans l'eau. Utilisez des filtres appropriés à l'image GFP et mCherry (pour la GFP: excitation BP 470/40, diviseur de faisceau FT 510, et l'émission BP 540/50; pour mCherry: excitation BP 578/21, diviseur de faisceau FT 596, et l'émission LP 641 / 75). Régler la durée d'exposition afin d'optimiser la dynamique de l'image.
2. Pour l'image toutes les cellules de la plaque, acquérir z-piles, en commençant quelques microns au-dessus de la plaque préchordale prospective (dans l'ectoderme) et se terminant quelques microns en dessous de la plaque préchordale prospective (dans le jaune). Utilisez un z-étape de 2 pm. Pour optimiser la vitesse d'acquisition, changer de couleur entre les z-piles plutôt que entre les images.
   Remarque: Cela peut conduire à de légères différences entre les images vertes et rouges, mais pas un problème puisque aucune co précise-localisation entre les signaux verts et rouges est nécessaire. Pour réduire davantage le temps d'imagerie et de l'exposition à la lumière, vert peut être acquis qu'une fois tous les 5 points de temps, ce qui est suffisant pour identifier les cellules progénitrices plaque préchordale.
3. L'utilisation de ces paramètres, l'image jusqu'à 4 embryons dans l'intervalle de temps de deux minutes qui est nécessaire pour analyser la fréquence et l'orientation saillie. Pour l'analyse de la saillie durée de vie, de réduire l'intervalle de temps de 30 secondes pour obtenir une meilleure résolution temporelle. Image de 60% à 80% épibolie épibolie.

9. Dynamics Cell Analyse

1. Charger images 4D en ImageJ
   Remarque: Selon le logiciel utilisé pour l'acquisition, les images sont stockées dans des formats différents (un fichier par image, un fichier par z-stack, un fichier pour l'ensemble de l'expérience). Certains Plugins ImageJ sont disponibles en ligne pour ouvrir des piles 4D. Nos données sont stockées sous forme d'un fichier par z-stack. Parce que l'ensemble de données peut être grand, il peut être commode d'ouvrir seulement une partie de celui-ci (certains timles points e, ou une sous-partie de la pile en Z ou 8 bits converties images ...). Nous utilisons un ImageJ plug-in sur-mesure de le faire, que nous serions heureux de distribuer sur demande.
2. Analyse de l'orientation et de la fréquence des Protrusions cellulaires
   1. Utiliser des images GFP pour déterminer la direction principale de prospective migration de la plaque préchordale. Prenez cela comme une référence pour les mesures de l'angle des saillies cellulaires. Faire tourner la pile, de sorte que cette direction de référence est parallèle à un côté de l'image.
   2. Suivez une cellule. Outil de sélection d'angle. Pour chaque cadre et chaque saillie, utilisez l'outil d'angle pour mesurer l'angle entre la saillie et la direction de référence (figure 3A). Utilisez la commande Analyser / Mesurer pour stocker la valeur (ou appuyez sur M sur le clavier). Enregistrer les résultats dans un fichier txt. Répéter l'opération avec la cellule suivante.
   3. Importez les données dans la distribution de R et l'angle de la parcelle sous forme d'histogrammes. Utilisez le test de Kolmogorov-Smirnov (ks.test en R) pour comparer les différentes conditions.
      Remarque: L'outil d'angle fournit des valeurs comprises entre 0 ° et 180 °, ce qui permet l'utilisation de tests statistiques classiques et des tests non circulaires.
   4. Avec cet ensemble de données, calculer la fréquence d'émission que le nombre de saillies par cellule par minute. Utiliser Student T-test (t.test en R) pour comparer des conditions différentes.
3. Analyse de la Cellule Protrusions Lifetime
   1. Pour chaque cellule et chaque saillie, la durée du dépassement de mesure (nombre de trames au cours de laquelle la saillie est présent x intervalle de temps entre les trames).
   2. Importez les données dans R. Utiliser Student T-test (t.test en R) pour comparer les différentes conditions.
      Remarque: Les autres caractéristiques de migration peut être intéressant d'analyser afin de caractériser la migration cellulaire. Ceux-ci comprennent des pistes de cellules, pour la vitesse, la direction et les mesures de la persistance ou la morphologie des cellules. Certaines applications de logiciels commerciaux sont disponibles pour mesurer ces caractéristiques, mais un grand nombre d'appli de logiciels open-sourcecations et plugins ImageJ sont également disponibles, comme par exemple ADAPT pour analyser morphodynamique ^12, DIPER à regarder les trajectoires cellulaires et la persistance directionnelle ^13, Celltrack pour suivre les limites des cellules lors de la migration ^14.

Résultats

La technique présentée a été utilisé pour analyser le rôle des sin1, l' une des composantes essentielles de la Tor complexe 2 (TORC2), dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo. L'utilisation de la transplantation de cellules permet de marquage des cellules et l'analyse des effets sur les cellules autonomes isolées. Film S1 montre la migration des cellules progénitrices de la plaque préchordale transplantées. étiquetage actine avec ABP1...

Discussion

Ce protocole présente un moyen facile d'étudier le rôle d'un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo, en combinant la création d'embryons chimères en utilisant une transplantation de cellules avec l' imagerie en direct.

Création d'embryons mosaïques

Étude de la dynamique d'une cellule nécessite la visualisation de son contour pour analyser les extensions cytoplasmiques. Ceci peut être réalisé par marquage d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm)	Harvard Apparatus	300085	standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)	Harvard Apparatus	300085	thin-walled
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers	Dumont Fine Science Tools	11254-20	5F
glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Air transjector	Eppendorf	5246
Micro-forge	Narishige	MF-900
Microgrinder	Narishige	EG-44
Micromanipulator (for injection)	Narishige	MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation)	Leica	Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe	Narishige	IM-9B
Micropipette puller	David Kopf Instruments	Model 720
Transplantation mold	Adapative Science Tools	PT-1
Needle holder	Narishige	HI-7
Tube connector	Narishige	CI-1
PTFE tubing	Narishige	CT-1