La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Resumen

Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.

Resumen

la transcripción del gen específico es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. El proceso biológico está mediada por factores de transcripción que se unen regiones reguladoras genómicas que incluyen potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que se someten a modificaciones químicas. Las modificaciones de las histonas conducen a más reprimida, que se activa la transcripción de genes o aplomado, con lo que otro nivel de regulación de puesta a punto de la transcripción génica. Las células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir, los agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardíaco. Proporcionan, en principio, suficiente material para la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), una tecnología ampliamente utilizada para identificar las regiones reguladoras de genes. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de cardiogénesis. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiteninvestigar paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o chip-secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.

Introducción

El corazón es el primer órgano en formarse y llegar a ser funcional en el embrión. El corazón está construido a partir de muchos linajes de células que surgen de la primera y segunda campos corazón embrionario ^1. Desde el blastocisto después de la fertilización etapa de seguimiento a la forma de corazón, las células embrionarias tienen por tanto que tomar muchas decisiones del destino celular. La transcripción de genes está regulada de una manera en tiempo y espacio-dependiente y es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. Tal proceso está mediado por factores de transcripción específicos que se unen regiones reguladoras dentro del genoma incluyendo potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que están sometidas a modificaciones tales como acetilación, metilación, ubiquitinylation, y / o fosforilación. Modificación de las histonas conduce a la transcripción de genes reprimidos, activado o contrapesado dependiendo de qué residuo de lisina de la histona se modifica ^2.

jove_content "> ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ha sido creada hace ³ años y es actualmente la tecnología más ampliamente utilizado con el fin de identificar los objetivos de cualquiera de las histonas modificadas o factores de transcripción ^4. A raíz de la inmunoprecipitación de las histonas o factores de transcripción, DNA unido puede ser ya sea amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o se secuencian. chIP ha superado técnicamente más desafiantes ensayos de retardo en gel ^5. sin embargo chIP no implica la unión directa de un factor de transcripción al ADN, una ventaja de ensayo de retardo en gel. por otra parte, el chip combinado para la secuenciación del ADN ha abierto una nueva perspectiva de todo el genoma en la regulación de genes.

Células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir., Agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardiaco ⁶ y proporcionan, en principio, suficiente material para el chip. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de la cardiogenesis a pesar de su potencial cardiogénico depende de su firma epigenética ^7. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiten para la investigación de paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Sin embargo, el genoma se transcribe de forma ^8-tipo específico tiempo y celular. La regulación epigenética de la transcripción génica tiene que ser estudiado dentro de las regiones localizadas. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.

Protocolo

1. DNA-proteína entrecruzamiento

1. Fijar en tubos de 15 ml de células cosechadas-ES (2 x 10 ⁶ células para regular de chip, 2 x 10 ⁵ células de microchip), los cuerpos embrioides (EBS) generadas a partir de células madre embrionarias y tejidos del corazón de embriones disecados de embriones E9.5 ratón (auriculoventricular canal, tracto de salida del ventrículo y) usando formaldehído al 1% en PBS durante o células en tampón de permeabilización PB2 de tejidos embrionarios. Colocar los tubos en un agitador orbital a una velocidad de 60 rpm a temperatura ambiente durante exactamente 10 min.
2. Detener la reacción de reticulación mediante la adición de glicina a una concentración final de 125 mM y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente en el agitador orbital a una velocidad de 60 rpm.

2. Lisis celular y la fragmentación de la cromatina

1. Lavar dos veces las células reticuladas se volvieron a suspender en 10 ml de PBS 1x o tejidos de embriones se volvieron a suspender en 1 ml PB2. Centrifugar a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante.
2. Añadir inhibidores de la proteasa para amortiguar PB1 o PB2 (2 mg / ml de leupeptina, 1 mg / ml de aprotinina, y PMSF 0,1 mM) (Tabla 1). Resuspender el sedimento celular o tejido embrionario de la etapa 2.1 en 1 ml de tampón PB1 o PB2 respectivamente. Pipetear arriba y abajo y resuspender las células o tejidos. Usar una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 21 para homogeneizar las células o tejidos. Se incuba a 4 ° C (en una rueda) para 10 min.
3. Centrifugar a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
4. Resuspender el precipitado en 300 l de tampones respectivos SB (tabla 1), complementado con inhibidores de la proteasa en un tubo limpio (certificado RNasa, DNasa y libre de pirógenos) para evitar cualquier degradación del ADN. Incubar durante 15 a 30 min en hielo.
5. Sonicar las muestras a 4 ° C para cortar la cromatina utilizando un aparato de ultrasonidos de acuerdo con los programas listados en la Tabla 2 para cada material. Ajustar la duración de la sonicación en función de la siguiente aplicación ( es decir, PCR o secuenciación). tamaño de ADN esquilada debe estar alrededor de 500 pb para PCR y 300 pb para la secuenciación.
6. Centrifugar el lisado celular se sometió a ultrasonidos durante 10 minutos a 6000 xga 4 ° C, transferir el sobrenadante (cromatina) en un tubo limpio de 1,5 ml y desechar el sedimento.
7. Diluir la cromatina en solución (sobrenadante de tampón B) durante 10 veces con agua y evaluar la densidad óptica usando 1,5 l en un nano-espectrofotómetro. Se obtiene la concentración de proteínas en mg / l utilizando la siguiente fórmula: 1,55 x DO ₂₈₀ - 0,76 x ₂₆₀ OD.

Buffer	Utilización	Composición				materiales
UN	permeabilización	PB1: 5 mM TUBOS pH 8; 85 mM KCl; 0,5% de NP40				Todas
		PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, NaCl 15 mM, MgCl2 mM KCl 4 60 mM, 0,5% de Triton X-100				tejido embrionario
segundo	Lisis / sonicación	SB1: SDS al 1%; EDTA 10 mM; mM Tris-HCl pH 8 50				ESC
		SB2: 50 mM HEPES-KOH pH7.9; 140 mM; 1 mM EDTA; 0,1% de desoxicolato; 0,1% de SDS				EB
		SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, NaCl 15 mM; KCl 60 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM; 1% de Triton-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% laurilsarcosina				tejido embrionario
do	tampón chip	NaCl 150 mM; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; EDTA 5 mM; 0,5% de NP40; 1% de Triton-X100.				Todas
re	DNA / proteína elución	D1: 1% de SDS; 100mM NaHCO 3 D2: 50 mM Tris pH 7,6 mM EDTA / 5, DTT 15 mM, 2% SDS
mi	ADN preparación de perlas de unión	E: 20% de PEG 8000; NaCl 2,5 M; mM Tris-HCl 10 pH 8; 1 mM EDTA

Tabla 1. buffers chip.

Material	programa de tratamiento con ultrasonidos
Células madre embrionarias	15 ciclos de 30 s ON y OFF 30 seg
cuerpos embrionarios	30 ciclos de 30 s ON y OFF 30 sec
tejidos embrionarios	21 ciclos de 30 s ON y OFF 30 sec

Tabla 2. Programas de sonicación.

3. La inmunoprecipitación ylavados

1. Lávese las perlas 3 veces de Proteína A conjugada con tampón C. Tomar 100 l de perlas en un tubo limpio de 1,5 ml y añadir 1 ml de tampón C (Tabla 1). El tubo se transfiere luego a un imán; esperar durante 1 minuto y aspirar el sobrenadante. Repetir dos veces la etapa de lavado.
2. Incubar anticuerpo generado contra histonas modificadas o factor de transcripción (concentraciones que se indican en la Tabla 3) con 20 l de proteína lavada granos conjugados y 1 ml de tampón C suplementado con inhibidores de la proteasa en un tubo limpio de 1,5 ml. Establecer las muestras en un aparato rotatorio a 40 rpm durante al menos 2 horas a 4 ° C.
3. Lavado de anticuerpos perlas de complejos de 3 veces con 1 ml de tampón C (manipulación descrito en 3.1).
4. Preparar 2 tubos, uno que contiene 150 g de complejos de la cromatina y de anticuerpos-Beads y el otro tubo que contiene 150 g de la cromatina y 20 l de perlas lavadas; Añadir 1 ml de tampón C suplementado con inhibidores de la proteasa a cada tuboe incubar las muestras en una rueda que gira a 40 rpm durante la noche a 4 ° C.
   NOTA: La concentración de la cromatina debe ser al menos 300 g para inmunoprecipitar un factor de transcripción o para CHIP secuencial.

Estándar	concentración (ng / l)	Volumen (l)	La concentración total de ADN (ng)
UN	10.0	1	10.0
segundo	5.00	1	5.00
do	2.50	1	2.50
re	1.25	1	1.25
mi	0,625	1	0,625
F	0.3125	1	00.3125
GRAMO	0,156	1	0,156
MARIDO	0.0	1	0.0

Tabla 3. concentraciones estándares.

4. La elución del ADN, Intercambio de enlace de Reversión y digestión con proteinasa K

1. Establecer las muestras en el bastidor magnético. Recuperar el sobrenadante que contiene la cromatina anticuerpo no unido.
   Nota: Las muestras se pueden congelar rápidamente en nitrógeno líquido a ese paso y se almacenaron a -80 ° C. La cromatina se puede utilizar en otros ensayos de inmunoprecipitación con otro anticuerpo. Lavar cada muestra 3 veces con 1 ml de tampón C (manipulación descrito antes).
2. La elución de la proteína unida al anticuerpo mediante la adición de 150 l de tampón D1 o D2 si chip secuencial que se ha hecho (Tabla 1) para materiales de chip se lavan y se incuban las muestras durante 20 minutos a 50 ° C en un bloque de calentamiento.
3. Retire los tubos deel bloque de calentamiento y se puso muestras en el bastidor magnético, recuperar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml limpio (certificado RNasa, DNasa, y libre de pirógenos) y desechar las perlas.
4. Utilice sobrenadante para un chip secuencial adición de 1 a 3 g del segundo anticuerpo en 2 volúmenes de tampón C o revertir de reticulación mediante la adición de 5 M NaCl para obtener una concentración final de 200 mM.
5. Preparar una muestra de entrada de la cromatina en un tubo de 1,5 ml limpio (certificado RNasa, DNasa, y libre de pirógenos), teniendo la misma cantidad de la cromatina como la de la muestra IP (150 g) en un volumen final de 150 l de agua (RNasa DNasa libre de agua). Añadir NaCl 5 M a una concentración final de 200 mM. Incubar las muestras durante la noche a 65 ° C.
6. Al día siguiente, extraer muestras del bloque de calentamiento, añadir EDTA 250 mM para obtener una concentración final de 12,5 mM y proteinasa K para obtener una concentración final de 250 g / ml en el material de chip y digerir a 55 ° C durante 2 horas en el bloque de calentamiento.

5. Aislamiento de ADN utilizando perlas de unión al ADN

1. Preparación de perlas
   1. Empezar a llevar las perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, vórtice las cuentas muy a fondo. Los granos se establecen, por lo que trabajar rápido al pipetear. Se transfiere 1 ml de perlas en el tubo limpio de 1,5 ml (certificado RNasa, DNasa y libre de pirógenos).
   2. Establecer en el imán, espere durante 2 - 3 minutos para la solución de aclarar, sobrenadante de descarte. Retirar del imán, añadir 1 ml de EDTA 0,5 M y se mezcla mediante breve agitación en vórtex.
   3. Repita el paso 5.1.2 dos veces, y desechar el sobrenadante al final.
   4. Retirar del imán, añadir 1 ml de tampón E y poco a poco volver a suspender las perlas. Transferir toda la mezcla (perlas en tampón E) en 50 ml de tampón E. Se ponen en un agitador y se deja la mezcla lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora.
   5. los granos de prueba de unión a ADN, siguiendo el protocolo de purificación descrito a continuación, utilizando 3 Condiciones experimentales: 50 l de perlas / 50 l de ADN (1 volumen / volumen 1), 100 l de perlas/ 50 l de ADN (2 volúmenes / volumen 1) y 125 l de perlas / 50 l de ADN (2,5 volúmenes / 1 volumen). Deje migrar ADN purificado en un gel de agarosa al 1,5% para comprobar el tamaño de los fragmentos (Figura 1A).
2. purificación de ADN
   1. Añadir 425 l (2,5 volúmenes) de ADN perlas magnéticas que se unen a cada muestra de ADN (aproximadamente 170 l). Resuspender lentamente pipeteando arriba y hacia abajo (alrededor de 10 veces) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Colocar en el imán durante 5 minutos, y luego aspirar el sobrenadante y desechar (el imán).
   3. Añadir 600 l de etanol recién hecho 80% al tubo en el imán, esperar durante 1 minuto, se aspira el sobrenadante y desechar y repita el paso anterior una vez más.
   4. Dar una vuelta rápida, durante 5 segundos (microfuga), colocar el tubo en el imán y eliminar las últimas gotas de etanol. Deje secar durante 1 min a TA
   5. Eluir el ADN mediante la adición de 20 l de DNasa RNasa libre de agua. Retirar del imán y agitar la muestra.
   6. Incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente y luego colocar las muestras en el imán. Aspirar ADN eluido en un nuevo tubo (certificado RNasa, DNasa y libre de pirógenos).
   7. Ejecutar el DNA de la fracción de entrada en un gel de agarosa al 1,5% para comprobar el tamaño de fragmentos de ADN (Figura 1B).

6. Cuantificación de ADN usando un instrumento de detección de fluorescencia

1. Diluciones seriadas en agua 1 g de ADN (escalera de 1 kb) para dar un total de 7 diluciones más un punto de no-ADN (diluciones recogidos en la Tabla 3).
2. Preparar una solución de PCR Green I tinte, suficiente para todas las muestras (ADN y diluciones estándar purificado AH): diluir 10,000x el colorante verde en tampón 1x TE.
3. Añadir 1 l de cada muestra de ADN (DNA y diluciones estándar purificado AH) a 10 mezcla colorante verde l 1x en cubetas capilares para ser leído en un fluorímetro a 488 nm de longitud de onda. Para el ensayo de no-ADN, use 1 l del tampón 1x TE.
4. Construiruna curva de calibración utilizando un software gráfico y determinar las concentraciones relativas a la gama de muestras de ADN en ng / l. El ADN está listo para PCR o para hacer bibliotecas de secuenciación.

7. PCR

1. Selección de cebadores
   1. Diseño cebadores de interés para interrogar a las regiones genómicas de interés. Diseño cebadores para amplificar regiones potenciadoras de genes utilizando la UCSC genoma navegador. Los potenciadores se prevé adicionalmente usando H3K4me1 o p300 chip-ss ⁹ de datos disponibles en el conjunto de datos GEO.
2. PCR
   1. las reacciones se realizan de PCR para 45 ciclos (8 seg 95 ° C, 8 seg 60 ° C, 8 seg 72 ° C) utilizando un tiempo real termociclador PCR en 25 l de la mezcla de colorante verde, ADN 2 ng, y 0,5 l de mezcla de cebadores (20 M solución de reserva) ^10.
3. Análisis de enriquecimiento
   1. Calcular enriquecimiento absoluto el supuesto de que como máximo 1% de nucleosoma se inmunoprecipitaron ^11.
   2. consider la genómico como si enriquecido muestras de 10 ng IP muestran un mayor enriquecimiento en comparación con 0,1 ng de ADN de entrada.
   3. Expresar los resultados como el aumento en veces de enriquecimiento de más de una región no enriquecido después de la normalización a la entrada y el ajuste con una muestra de control no específico.
   4. Tenga en cuenta la entrada de ADN que se diluye en 100 (o factor de dilución DF).
   5. Normalizar la entrada usando la siguiente ecuación 2 ^-ΔCt x 100%, donde -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Entrada x DF].
   6. Ajuste de control utilizando la siguiente ecuación (Ct [IP] -ΔCt [NS]), donde NS es la muestra no específica (sin anticuerpo IP, o IgG IP).
   7. Calcular el enriquecimiento de pliegue de la muestra, tal como 2 ^-ΔΔCt. Un archivo que incluye todos los pasos de cálculos con fórmulas en las que solamente cada muestra PCR puede introducirse facilitará el análisis de los resultados.

Resultados

La Figura 1A ilustra la primera preparación de perlas de unión al ADN y el control de calidad utilizando ADN de diferentes tamaños (escalera de 1 kb). 0NE, se añadieron 2 y 2,5 volúmenes (1 a 3) de los granos a un volumen de la muestra para purificar fragmentos de ADN de alto y bajo tamaño molecular.

Las figuras 1 B, C, D son ejemplos típicos de geles de ADN de ADN agitado cuando todo e...

Discusión

La epigenética se ha convertido en un importante campo de investigación en biología del desarrollo. ¿Cómo un programa genético se activa en las células embrionarias para permitir que las células de la adquisición de una identidad específica dentro de un linaje embrionario ha sido durante mucho tiempo una cuestión clave para los biólogos del desarrollo.

ChIP se ha usado ampliamente en los últimos años y combinado para la secuenciación del ADN después de la mejora en la resoluc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues