Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей

Резюме

Тонкая настройка регуляции транскрипции генов лежит в основе эмбриональных клеток решения судьбы. Здесь мы опишем иммунопреципитации хроматина, используемые для изучения эпигенетической регуляции как сердца дифференцировки стволовых клеток и развития сердца эмбрионов мыши.

Аннотация

Конкретная транскрипции гена является ключевым биологическим процессом, который лежит в основе решения судьбы клеток во время эмбрионального развития. Биологический процесс опосредуется факторами транскрипции, которые связывают геномных регуляторных областей, включая усилителями и пропагандистов сердца конститутивных генов. ДНК обернута вокруг гистонов, которые подвергают химической модификации. Модификации гистонов дополнительно приводят к подавленной, активировать или уравновешенного транскрипции генов, в результате чего еще один уровень тонкой регуляции настройки транскрипции генов. Эмбриональные стволовые клетки (ES - клетки) резюмировать в эмбриональных телец (т.е. клеточные агрегаты) или в 2D культуре на ранних ступенях развития сердца. Они обеспечивают в принципе достаточно материала для иммунопреципитации хроматина (CHIP), технология широко используется для идентификации генов регуляторных областей. Кроме того, ЭС клетки человека представляют собой клеточную модель человека из кардиогенеза. На более поздних стадиях развития, мышиных эмбриональных тканей позволяютисследуя конкретные эпигенетические ландшафты, необходимые для определения идентичности клеток. Здесь мы описываем протоколы чиповых, последовательного ChIP с последующей ПЦР или брелка-секвенирования с использованием ES-клеток, эмбриональных телец и сердечные специфические эмбриональные регионы. Эти протоколы позволяют исследовать эпигенетической регуляции сердечного транскрипции генов.

Введение

Сердце является первым органом, который будет сформирован и стать функциональным в зародыше. Сердце строится из многих клеточных клонов , которые вытекают из первого и второго полей эмбриональных сердца ^1. От после оплодотворения бластоцисты стадии до форме сердца, эмбриональные клетки имеют, таким образом, чтобы принимать множество решений клеточных судеб. Транскрипции генов регулируется в во времени и пространстве-зависимым образом и является ключевым биологическим процессом, который лежит в основе решения судьбы клеток во время эмбрионального развития. Такой процесс опосредовано специфическими факторами транскрипции, которые связываются регуляторные области в пределах генома, включая энхансеры и промоторы генов сердечных конститутивные. ДНК обернута вокруг гистонов, которые подвергаются модификации, такие как ацетилирование, метилирование, убиквитинилирование, и / или фосфорилирования. Модификация гистонов приводит к подавленной, активировать или уравновешенного транскрипции генов в зависимости от которой остаток лизина гистона модифицированного ^2.

jove_content "> иммунопреципитации хроматина анализ (ЧИП) была создана лет назад ³ и в настоящее время является наиболее широко используемой технологией с целью выявления целей либо модифицированных гистонов или транскрипционных факторов ^4. Следуя иммунопреципитации гистонов или факторов транскрипции, связанной ДНК может быть либо усиливается с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенировали. ЧИП имеет технически преодолеть более сложные гель замедляющие анализы ^5. Однако ЧИП не подразумевает прямого связывания фактора транскрипции с ДНК, преимущество геля замедляющей анализа. с другой стороны, чиповых в сочетании с секвенирования ДНК открыло новую геному перспективу регуляции генов.

ES - клетки (ES - клетки) резюмировать в эмбриональных органов (то есть., Клеточные агрегаты) или в 2D культуре на ранних стадиях развития сердца ⁶ и обеспечить в принципе достаточно материала для микросхеме. Кроме того, ЭС клетки человека представляют собой клеточную модель человеческого Саrdiogenesis хотя их кардиогенный потенциал зависит от их эпигенетической подписи ^7. На более поздних стадиях развития, мышиных эмбриональных тканей позволяют исследовать специфические эпигенетические ландшафты, необходимые для определения идентичности клеток. Тем не менее, геном расшифрован таким образом , ⁸ типоспецифичной затрат времени и клеток. Эпигенетическая регуляция транскрипции генов должен быть изучен в локализованных областях. Здесь мы описываем протоколы чиповых, последовательного ChIP с последующей ПЦР или секвенирования с использованием ES-клеток, эмбриональных телец и сердечные специфические эмбриональные регионы. Эти протоколы позволяют исследовать эпигенетической регуляции сердечного транскрипции генов.

протокол

1. ДНК-белок Сшивание

1. Фикс в 15 мл пробирки заготовленные-ES - клетки (2 × 10 ⁶ клеток для регулярного Чипа, 2 х 10 ⁵ клеток для микрочипом), эмбриональные тельца (ЭТ) , полученные из клеток ES и эмбриональных тканей сердца расчлененный из эмбрионов мыши E9.5 (атриовентрикулярная канал, тракт оттока и желудочки) с использованием 1% формальдегида в PBS для клеток или в пермеабилизации PB2 буфере для эмбриональных тканей. Место труб на орбитальном шейкере со скоростью 60 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение ровно 10 минут.
2. Остановить реакцию сшивки путем добавления глицин до конечной концентрации 125 мМ и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере со скоростью 60 оборотов в минуту.

2. лизиса клеток и хроматина Фрагментация

1. Промыть дважды сшитых клетки ресуспендировали в 10 мл PBS 1X или эмбриональные ткани ресуспендировали в 1 мл PB2. Центрифуга при 1000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Откажитесь от супернатантов.
2. Добавить ингибиторы протеазы в буфер PB1 или PB2 (2 мкг / мл лейпептина, 1 мкг / мл апротинина, и 0,1 мМ ФМСФ) (таблица 1). Ресуспендируют осадок клеток или эмбриональных тканей, полученной на стадии 2.1, в 1 мл буфера PB1 или PB2 соответственно. Пипеткой вверх и вниз и ресуспендирования клеток или тканей. С помощью 1 мл шприц с иглой 21 калибра гомогенизировать клеток или ткани. Инкубируют при температуре 4 ° С (на колесе) в течение 10 мин.
3. Спин вниз при 3000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
4. Ресуспендируют осадок в 300 мкл соответствующих буферов SB (таблица 1) , дополненной ингибиторами протеазы в чистую пробирку (Гарантированный RNase-, DNase- и апирогенной) для предотвращения какого - либо ухудшения ДНК. Инкубируют в течение 15 30 мин на льду.
5. Разрушать ультразвуком образцы при температуре 4 ° С для сдвига хроматина с помощью обработки ультразвуком в соответствии с программами , перечисленных в таблице 2 , для каждого материала. Отрегулируйте продолжительность обработки ультразвуком в зависимости от следующего приложения ( т.е., PCR или секвенирование). Жакет размер ДНК должна быть около 500 пар оснований для ПЦР и 300 пар оснований для секвенирования.
6. Центрифуга обрабатывали ультразвуком клеточный лизат в течение 10 мин при 6000 х г при температуре 4 ° С, передавать супернатант (хроматина) в чистую 1,5 мл трубки и выбросить осадок.
7. Развести хроматина в растворе (супернатант буфер В) в течение 10 раз водой и оценки оптической плотности с использованием 1,5 мкл в нано-спектрофотометре. Получить концентрацию белков в мкг / мкл с использованием следующей формулы: 1,55 х OD ₂₈₀ - 0,76 х OD _260.

буфер	использование	Состав				материалы
	пермеабилизирующего	PB1: 5 мМ PIPES pH 8; 85 мM KCl; 0,5% NP40				Все
		PB2: 15 мМ HEPES, рН 7,6, 15 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2 60 мМ KCl, 0,5% Тритон Х-100				эмбриональной ткани
В	Лизис / Озвучивание	SB1: 1% ДСН; 10 мМ ЭДТА; 50 мМ Трис-HCl, рН 8				ESC
		SB2: 50 мМ HEPES-KOH pH7.9; 140 мм; 1mM ЭДТА; 0,1% дезоксихолат; 0,1% ДСН				ЭТ
		SB3: 15 мМ HEPES, рН 7,6, 15 мМ NaCl, 60 мМ КСl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA; 1% Triton-X100, 0 0,1% ДСН, 0,5% laurylsarcosine				эмбриональной ткани
С	буфер чИП	150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 5 мМ ЭДТА; 0,5% NP40; 1% Triton-X100.				Все
D	ДНК / белок Элюирование	D1: 1% ДСН; 100мМ NaHCO 3 D2: 50 мМ Трис, рН 7,6 / 5 мМ ЭДТА, 15 мМ ДТТ, 2% ДСН
Е	ДНК-связывающие препарат шарики	Е: 20% ПЭГ 8000; 2,5 М NaCl; 10 мМ Трис-HCl, рН 8; 1mM ЭДТА

Таблица 1. ChIP буферы.

материал	программа Ультразвуком
Эмбриональные стволовые клетки	15 циклов 30 сек ВКЛ и ВЫКЛ 30 сек
эмбриональных телец	30 циклов 30 сек ВКЛ и ВЫКЛ 30 сек
Эмбриональные ткани	21 циклов 30 сек ВКЛ и ВЫКЛ 30 сек

Таблица 2. Ультразвуком Программы.

3. иммунопреципитация иПримочки

1. Промыть 3 раза белок А-конъюгированные бусинки буфером С. Взять 100 мкл бусин в чистой 1,5 мл пробирку и добавляют 1 мл буфера С (таблица 1). Трубку затем переносят на магнит; ждать в течение 1 мин и аспирата супернатант. Повторите дважды этап промывки.
2. Выдержите в антителе , выработанном против модифицированных гистонов или фактора транскрипции (концентрации приведены в таблице 3) с 20 мкл промытой белка конъюгированного бусин и 1 мл буфера С , дополненной ингибиторами протеазы в чистую 1,5 мл трубки. Набор образцов на ротатор при 40 оборотах в минуту в течение по крайней мере 2 часов при температуре 4 ° С.
3. Вымойте антитело-бусинки комплексы 3 раза с 1 мл буфера С (манипуляции описаны в разделе 3.1).
4. Подготовьте 2 трубки, одна из которых содержит 150 мкг хроматина и антител бусинок комплексов, а другой трубки, содержащей 150 мкг хроматина и 20 мкл промытых бус; Добавить 1 мл буфера C, дополненных с ингибиторами протеазы в каждую пробиркуи инкубировать образцов на вращающемся колесе при 40 оборотах в минуту в течение ночи при температуре 4 ° С.
   Примечание: Концентрация хроматина должна быть не менее 300 мкг для иммунопреципитации фактор транскрипции или для последовательного микросхеме.

стандарт	концентрация (нг / мкл)	Объем (мкл)	Общая концентрация ДНК (нг)
	10,0	1	10,0
В	5.00	1	5.00
С	2.50	1	2.50
D	1,25	1	1,25
Е	0.625	1	0.625
F	0,3125	1	00,3125
г	0.156	1	0.156
ЧАС	0.0	1	0.0

Таблица 3. Стандарты концентрации.

4. ДНК элюирования, Перекрестная ссылка Сторнирование и протеиназы К Пищеварение

1. Набор образцов в магнитном стойке. Восстановление супернатант, содержащий несвязанного хроматина антитела.
   Примечание: Образцы могут быть быстро замораживали в жидком азоте на этом шаге и хранили при -80 ° С. Хроматина могут быть использованы в других иммунопреципитации с другими антителами. Промыть каждый образец 3 раза по 1 мл буфера С (манипуляционных описано ранее).
2. Элюции антитело-связанный белок путем добавления 150 мкл буфера для D1 или D2 , если последовательный чип должен быть сделан (таблица 1) к промытым ChIP материалов и инкубировать образцов в течение 20 мин при 50 ° С в нагревательном блоке.
3. Удалить из пробиркинагревательный блок и поместить образцы в магнитной стойке, восстановить супернатант в чистую 1,5 мл трубки (сертифицированный RNase-, DNase- и пирогенов) и отказаться от бортов.
4. Используйте супернатант для последовательного ChIP добавлением от 1 до 3 мкг второго антитела в 2 объемами буфера C или обратного сшивок добавлением 5 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию 200 мМ.
5. Подготовьте входной образец хроматина в чистом 1,5 мл трубки (Гарантированный RNase-, DNase- и апирогенной) принимать такое же количество хроматина, как и у образца IP (150 мкг) в конечном объеме 150 мкл воды, (РНКазы ДНКазы вода). Добавьте 5 М NaCl до конечной концентрации 200 мМ. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 65 ° С.
6. На следующий день, удалить образцы из нагревательного блока, добавляют 250 мМ ЭДТА, чтобы получить конечную концентрацию 12,5 мМ и протеиназы К, чтобы получить конечную концентрацию 250 мкг / мл в микросхеме материала и переваривают при 55 ° С в течение 2 часов в Китайской нагревательный блок.

5. Выделение ДНК с использованием ДНК-связывающих шарики

1. Приготовление шариков
   1. Начинают приносить бусинки при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 мин, вихревые гранулы очень тщательно. Бусинки осесть, поэтому работать быстро, когда пипеткой. Передача 1 мл шариков в чистую 1,5 мл трубки (сертифицировано RNase-, DNase- и апирогенной).
   2. Установить на магните, подождите в течение 2 - 3 мин для раствора для уточнения, сброшенных супернатанта. Удалить из магнита, добавляют 1 мл 0,5 М ЭДТА и перемешать с помощью краткого встряхиванием.
   3. Повторите шаг 5.1.2 дважды, и отбросить супернатант в конце.
   4. Удалить из магнита, добавьте 1 мл буфера Е и медленно ресуспендирования бисером. Перенесите всю смесь (шарики в буфере E) в 50 мл буфера E. Место на шейкере и дайте ему смешивать медленно при комнатной температуре в течение 1 ч.
   5. Тест ДНК-связывающий бусинки следующий протокол очистки, описанной ниже, с использованием 3 условий эксперимента: 50 мкл бус / 50 мкл ДНК (1 объем / объем): 1 100 мкл бус/ 50 мкл ДНК (2 тома / 1 объем) и 125 мкл шариков / 50 мкл ДНК (2,5 объема / 1 объем). Пусть мигрировать очищенную ДНК на агарозном геле 1,5% , чтобы проверить размер фрагментов (рис 1А).
2. ДНК Очистка
   1. Добавить 425 мкл (2,5 объемов) ДНК-связывающим магнитных шариков для каждого образца ДНК (приблизительно 170 мкл). Ресуспендируют медленно пипетированием вверх и вниз (примерно в 10 раз) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
   2. Поместите на магнит в течение 5 мин, затем аспирата супернатант и выбросьте (на магните).
   3. Добавьте 600 мкл свежеприготовленного 80% этанола в пробирку на магнит, подождите в течение 1 мин, аспирация супернатант и выбросьте, а затем повторите предыдущий шаг еще раз.
   4. Дайте быстрый спин, в течение 5 сек (микроцентрифуге), поместите трубку на магнит и удалить последние капли этанола. Дайте высохнуть в течение 1 мин при комнатной температуре
   5. Элюции ДНК путем добавления 20 мкл ДНКазы РНКазы свободной воды. Удалить из магнита и вихрь образца.
   6. Выдержите в течение 3 мин при комнатной температуре, а затем поместить образцы на магните. Отберите элюировали ДНК в новую пробирку (сертифицированный RNase-, DNase- и без пирогенов).
   7. Запуск ДНК из входной фракции на агарозном геле 1,5% , чтобы проверить размер фрагментов ДНК (рис 1В).

6. ДНК Количественное Использование флуоресцентной детекции инструмента

1. Серийно разбавить в воде в концентрации 1 мкг ДНК (1 т.п.н. лестничного) с получением в общей сложности 7 разведений плюс точка не-ДНК (разведений , собранные в таблице 3).
2. Приготовьте раствор PCR Green I красителя, достаточный для всех образцов (очищенной ДНК и стандартных разведений АГ): разбавьте 10,000x зеленый краситель в буфере 1x TE.
3. Добавляют 1 мкл каждого ДНК (ДНК очищали и стандартных разведений AH) до 10 мкл 1x смесь зеленого красителя в капиллярах кюветах следует читать в флуориметре при 488 нм. Для анализа не-ДНК, используют 1 мкл буфера 1x TE.
4. строитькалибровочную кривую с использованием графического программного обеспечения и определения относительных концентраций в диапазоне образцов ДНК в нг / мкл. Затем ДНК готов для ПЦР или сделать библиотеки секвенирования.

7. ПЦР

1. Выбор праймеров
   1. Дизайн праймеров, представляющие интерес для допросить геномных областей, представляющих интерес. Дизайн праймеров для амплификации усиливающие областей генов с использованием генома браузера УСК. Расширители далее предсказаны с использованием H3K4me1 или р300 ^{Обломок-9} SEQ данных , имеющихся в наборе данных GEO.
2. ПЦР
   1. Реакции Запуск ПЦР в течение 45 циклов (8 сек 95 ° С, 8 сек 60 ° С, 8 сек 72 ° C) с использованием ПЦР в реальном времени Термоциклер в 25 мкл смеси зеленого красителя, 2 нг ДНК, и смешать праймер 0,5 мкл (20 мкМ раствор) ^10.
3. Анализ обогащения
   1. Подсчитайте Абсолютное обогащение , предполагая , что не более чем 1% от нуклеосом иммунопреципитировали ^11.
   2. ConsideR геномный, как обогащенный, если 10 образцов нг IP показывают большее обогащение по сравнению с 0,1 нг входной ДНК.
   3. Экспресс результаты как кратное увеличение обогащения над необогащенных области после нормализации на входе и корректировки с неспецифическим контрольным образцом.
   4. Рассмотрим входной ДНК быть разбавлен 100 (коэффициент разбавления или DF).
   5. Нормализация вход , используя следующее уравнение 2 ^-ΔCt х 100%, где -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input х DF].
   6. Настройка управления с помощью следующего уравнения (& Delta; CТ [IP] -ΔCt [NS]), где NS является неспецифическим образца (без антитела IP или IgG IP).
   7. Вычислить кратное обогащение образца как 2 ^-ΔΔCt. Файл, включая все этапы расчетов с формулами, в которых только каждый образец ПЦР можно ввести облегчит анализ результатов.

Результаты

Фигура 1А иллюстрирует первый получение шариков ДНК-связывающих и контроля качества с использованием ДНК разных размеров (1 кб зачёт). 0ne, 2 и 2,5 объема (от 1 до 3) из бисера добавляли к одному объему образца для очистки высоких и низких фрагментов ДНК размером мол?...

Обсуждение

Epigenetics стала важной областью исследований в области биологии развития. Как генетическая программа активируется в эмбриональных клетках, чтобы позволить клеткам приобретать определенную идентичность в эмбриональном линии был в течение длительного времени является ключевым вопросом...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues