Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Resumo

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Resumo

a transcrição do gene específico é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. O processo biológico é mediada por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras genómicas incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvido em torno histonas que são sujeitas a modificações químicas. Modificações das histonas ainda levar a transcrição de genes reprimida, activado ou equilibrado, trazendo assim mais um nível de regulamentação sintonia fina da transcrição de genes. As células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ou seja, agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco. Eles fornecem material suficiente em princípio para imunoprecipitação da cromatina (ChIP), uma tecnologia amplamente utilizada para identificar regiões reguladoras de genes. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano de cardiogenesis. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitirinvestigando paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou chip-sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.

Introdução

O coração é o primeiro órgão a ser formada e para se tornar funcional no embrião. O coração é construído a partir de muitas linhagens de células que surgem a partir dos primeiro e segundo campos cardíaco embrionário ^1. A partir do blastocisto pós-fertilização organizar-se para o coração em forma, as células embrionárias têm, assim que tomar muitas decisões destino celular. Gene transcrição é regulada de forma tempo e dependente do espaço e é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. Um tal processo é mediada por factores de transcrição específicos que se ligam a regiões reguladoras dentro do genoma incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvida em torno de histonas, que são sujeitos a modificações tais como acetilação, metilação, ubiquitinação, e / ou fosforilação. Histona modificação conduz a transcrição do gene reprimida, activado ou preparada dependendo de qual o resíduo de lisina de histona é modificado ^2.

jove_content "> ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), foi criado anos atrás ³ e é atualmente a tecnologia mais amplamente utilizada, a fim de identificar alvos, tanto de histonas modificadas ou fatores de transcrição ^4. Após imunoprecipitação de histonas ou fatores de transcrição, o DNA ligado pode ser quer amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou sequenciados. chip tem tecnicamente superar mais desafiantes ensaios de retardamento em gel ^5. no entanto chip não implica a ligação directa de um factor de transcrição de ADN, uma vantagem do ensaio de retardamento em gel. por outro lado, Chip combinados para sequenciamento de DNA, abriu uma nova perspectiva de todo o genoma na regulação dos genes.

Células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ie., Agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco ⁶ e fornecer material suficiente em princípio para o chip. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano da cardiogenesis embora o seu potencial cardiogênico depende da sua assinatura epigenética ^7. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitir investigar paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. No entanto, o genoma é transcrita em um tempo e modo específico de células do tipo ^8. regulação epigenética da transcrição de genes tem que ser estudado dentro de regiões localizadas. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.

Protocolo

1. ADN-proteína de reticulação

1. Fixam em 15 ml tubos de células-ES colhidas (2 x 10 ⁶ células para Chip regulares, 2 x 10 ⁵ células para Microchip), corpos embrióides (EBS) gerados a partir de células-tronco embrionárias e tecidos cardíacos embrionárias dissecados de embriões de rato E9.5 (atrioventricular canal, via de saída e ventrículo), utilizando 1% de formaldeído em PBS para as células ou em tampão PB2 permeabilização de tecidos embrionários. Colocar os tubos num agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm à temperatura ambiente durante exactamente 10 min.
2. Parar a reacção de reticulação por adição de glicina para uma concentração final de 125 mM e incuba-se durante 5 min à temperatura ambiente no agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm.

2. Lise celular e fragmentação da cromatina

1. Lavar duas vezes as células com ligações cruzadas ressuspensas em 10 ml de PBS 1x ou tecidos embrionários ressuspensas em 1 ml de PB2. Centrifugar a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
2. Adicionar inibidores da protease para tamponar PB1 ou PB2 (2 ug / mL de leupeptina, 1 ug / mL de aprotinina, e PMSF 0,1 mM) (Tabela 1). Ressuspender o sedimento celular ou de tecido embrionário a partir do passo 2.1 em 1 ml de tampão ou PB1 PB2 respectivamente. Pipeta cima e para baixo e voltar a suspender as células ou tecidos. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 21 para homogeneizar células ou tecido. Incubar a 4 ° C (em uma roda) durante 10 min.
3. Girar a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender o sedimento em 300 ul de tampão respectivas SB (Quadro 1) suplementado com inibidores de protease num tubo limpo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios) para evitar qualquer degradação de ADN. Incubar durante 15 a 30 min em gelo.
5. Sonicar as amostras a 4 ° C para cortar a cromatina utilizando um sonicador de acordo com programas listados na Tabela 2 para cada material. Ajustar a duração de sonicação dependendo da próxima aplicação ( ou seja, PCR ou sequenciação). tamanho DNA cortado deve ser em torno de 500 pb para PCR e 300 pb para o sequenciamento.
6. Centrifugar o lisado celular sonicada durante 10 min a 6000 xg, a 4 ° C, transferir o sobrenadante (cromatina) em um tubo de 1,5 ml limpo e rejeitar o sedimento.
7. Dilui-se a cromatina em solução (sobrenadante tampão B) por 10 vezes com água e avaliar a densidade óptica utilizando 1,5 uL de uma nano-espectrofotómetro. Obter a concentração de proteínas em ug / ul usando a seguinte fórmula: 1,55 x OD _280-0,76 X OD _260.

Amortecedor	Utilização	Composição				materiais
UMA	permeabilização	PB1: TUBOS 5 mM pH 8; 85 mM KCl; 0,5% de NP40				Todos
		PB2: 15 mM de HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl, mM de MgCl2 4 mM de KCl 60, 0,5% de Triton X-100				tecido embrionário
B	Lise / sonicação	SB1: 1% de SDS; EDTA 10 mM; Tris-HCl 50 mM pH 8				ESC
		SB2: 50 mM HEPES-KOH pH 7,9; 140 mm; EDTA 1 mM; 0,1% de desoxicolato; 0,1% de SDS				EBs
		SB3: 15 mM de HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl; KCl 60 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM; 1% de Triton-X100, 0 0,1% de SDS, 0,5% laurilsarcosina				tecido embrionário
C	tampão ChIP	NaCl 150 mM; Tris-HCl 50 mM pH 7,5; EDTA 5 mM; 0,5% de NP40; 1% de Triton-X100.				Todos
D	DNA / proteína A eluição	D1: 1% de SDS; 100de NaHCO 3 mM D2: Tris 50 mM pH 7,6 / EDTA 5 mM, DTT 15 mM, SDS a 2%
E	DNA preparação esferas de ligação	E: 20% de PEG 8000; NaCl 2,5 M; Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1mM

Tabela 1. Os tampões de chip.

Material	programa de sonicação
Células-tronco embrionárias	15 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos OFF
corpos embrióides	30 ciclos de 30 seg ON e 30 segundos OFF
tecidos embrionários	21 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos OFF

Tabela 2. Programas sonicação.

3. A imunoprecipitação eLavagens

1. Lavar as pérolas A-3 vezes conjugado de proteína com tampão C. Tome 100 ul de pérolas num tubo limpo de 1,5 ml e adicionar 1 mL de tampão C (Tabela 1). O tubo é em seguida transferida para um íman; esperar durante 1 minuto e aspirar o sobrenadante. Repita duas vezes o passo de lavagem.
2. Incubar anticorpo criado contra histonas modificados ou factor de transcrição (as concentrações listadas na Tabela 3), com 20 ul de proteína lavado grânulos conjugados e 1 ml de tampão C suplementado com inibidores de protease em um tubo de 1,5 ml limpo. Definir as amostras num rotor a 40 rpm durante pelo menos 2 horas a 4 ° C.
3. Lavar de anticorpo-complexos esferas 3 vezes com 1 ml de tampão C (manipulação descrito em 3.1).
4. Prepare a 2 tubos, um contendo 150 ^ g de complexos de cromatina e anticorpo de grânulos e o outro tubo contendo 150 ug de cromatina e 20 ul de pérolas lavadas; Adicionar 1 mL de tampão C suplementado com inibidores da protease a cada tuboe incuba-se as amostras sobre uma roda a rodar a 40 rpm, durante a noite a 4 ° C.
   NOTA: A concentração de cromatina deve ser de pelo menos 300 ug de imunoprecipitar um factor de transcrição ou para o chip sequencial.

Padrão	concentração (ng / mL)	Volume (uL)	Concentração total de ADN (ng)
UMA	10.0	1	10.0
B	5.00	1	5.00
C	2.50	1	2.50
D	1,25	1	1,25
E	0,625	1	0,625
F	0,3125	1	00,3125
G	0,156	1	0,156
H	0.0	1	0.0

Tabela concentrações 3. Normas.

4. DNA eluição,-link Cruz Reversão e Proteinase K Digestão

1. Definir as amostras na cremalheira magnética. Recuperar o sobrenadante contendo cromatina anticorpo não ligado.
   NOTA: As amostras pode ser rapidamente congelada em azoto líquido a essa etapa e armazenado a -80 ° C. Cromatina pode ser utilizado em outros ensaios de imunoprecipi tacão com outro anticorpo. Lava-se cada amostra de 3 vezes com 1 ml de tampão C (descrito antes) de manipulação.
2. Elui-se a proteína ligada ao anticorpo pela adição de 150 ul de tampão de D1 ou D2 se ChIP sequencial tem de ser feito (Tabela 1) para materiais ChIP lavadas e incubar as amostras durante 20 min a 50 ° C num bloco de aquecimento.
3. Retirar os tubos deo bloco de aquecimento e colocar as amostras no rack magnético, recuperar o sobrenadante em um tubo de 1,5 ml limpo (certificada RNase-, DNase e livre de pirogénios) e descartar as contas.
4. Use sobrenadante para um chip sequencial adicionando 1 a 3 ug do segundo anticorpo, em 2 volumes de tampão C ou reverter a reticulação por adição de NaCl 5 M para se obter uma concentração final de 200 mM.
5. Prepara-se uma amostra de entrada de cromatina em um tubo de 1,5 ml limpo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios) tendo a mesma quantidade de cromatina que o da amostra IP (150 ug) num volume final de 150 ul de água (RNase DNase água livre). Adicionar NaCl 5M para uma concentração final de 200 mM. Incubar as amostras durante a noite a 65 ° C.
6. No dia seguinte, recolher amostras a partir do bloco de aquecimento, adicionar EDTA 250 mM para se obter uma concentração final de 12,5 mM e proteinase K para se obter uma concentração final de 250 ug / ml no material de aparas e digerir a 55 ° C durante 2 horas na bloco de aquecimento.

5. Isolamento de ADN utilizando pérolas de ligação de ADN

1. Preparação dos grânulos
   1. Comece a trazer os grânulos à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min, vortex os grânulos muito cuidadosamente. Beads se estabelecer, por isso o trabalho rápido quando pipetagem. Transferir 1 ml de contas no limpo tubo de 1,5 ml (certificado RNase-, DNase e livre de pirogénios).
   2. Ajuste no ímã, esperar por 2-3 min para a solução de esclarecer, sobrenadante de descarte. Retire do ímã, adicionar 1 ml de EDTA 0,5 M e misture por vórtex breve.
   3. Repetir o passo 5.1.2, duas vezes e descartar o sobrenadante no final.
   4. Retire do ímã, adicionar 1 ml de tampão E e lentamente voltar a suspender as esferas. Transferir toda a mistura de grânulos (em tampão E) em 50 ml de tampão E. Coloque, num agitador e deixar misturar lentamente à temperatura ambiente durante 1 h.
   5. grânulos de teste de ligação de ADN seguindo o protocolo de purificação descrito a seguir, utilizando condições experimentais 3: 50 ul de contas / 50 uL de ADN (1 volume / volume de 1), 100 ul de pérolas/ 50 uL de ADN (2 volumes / 1 volume) e 125 ul de contas / 50 uL de ADN (2,5 volumes / 1 em volume). Vamos migrar ADN purificado num gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos (Figura 1A).
2. purificação de DNA
   1. Adicionar 425 ul (2,5 volumes) de ADN de ligação esferas magnéticas para cada amostra de ADN (cerca de 170 uL). Ressuspender lentamente por pipetagem para cima e para baixo (cerca de 10 vezes) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Coloque em ímã para 5 min, em seguida, aspirar o sobrenadante e descartar (no ímã).
   3. Adicionar 600 mL de etanol acabado de fazer 80% ao tubo no ímã, aguarde 1 min, aspirar o sobrenadante e descartar e, em seguida, repita o passo anterior mais uma vez.
   4. Dê um giro rápido, por 5 s (microcentrífuga), colocar o tubo no ímã e remover as últimas gotas de etanol. Deixar secar durante 1 min a RT
   5. Elui-se o DNA pela adição de 20 ul de DNase RNase água livre. Retire do ímã e vortex a amostra.
   6. Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, colocar as amostras no íman. Aspirar o DNA eluído para um novo tubo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios).
   7. Executar o ADN a partir da fracção de entrada num gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA (Figura 1B).

6. DNA quantificação utilizando um instrumento de detecção de fluorescência

1. Serialmente diluídas em água 1 ug de ADN (uma escada KB) para dar um total de 7 diluições além de um ponto de não-ADN (diluições reunidos na Tabela 3).
2. Prepara-se uma solução de PCR Green I corante, suficiente para todas as amostras de ADN purificado (e diluições padrão AH): 10.000x diluir o corante verde em 1x tampão TE.
3. Adicionar 1 mL de cada amostra de DNA (DNA purificado e diluições padrão AH) a 10 ul de 1x mistura corante verde em capilares cuvetes para ser lido num fluorímetro a 488 nm de comprimento de onda. Para o ensaio não-ADN, usar 1 ul do tampão TE 1X.
4. Construiruma curva de calibração usando um software gráfico e determinar as concentrações relativas para a gama de amostras de ADN em ng / mL. O ADN é então pronto para PCR ou para fazer bibliotecas de sequenciação.

7. PCR

1. Selecção dos iniciadores
   1. Projeto iniciadores de interesse para interrogar as regiões genômicas de interesse. Conceber iniciadores para amplificar as regiões potenciadoras de genes utilizando o navegador genoma UCSC. Potenciadores são ainda previsto usando H3K4me1 ou p300 ChIP-seq ⁹ dados disponíveis no conjunto de dados GEO.
2. PCR
   1. reacções Executar PCR para 45 ciclos (8 seg 95 ° C, 8 s 60 ° C, 8 seg 72 ° C) utilizando um tempo real termociclador de PCR em 25 ul de mistura de corante verde, DNA 2 ng e 0,5 ul de mistura de iniciadores (20 solução estoque uM) ^10.
3. Análise de enriquecimento
   1. Calcular enriquecimento absoluto supondo que, no máximo, 1% de nucleossoma foram imunoprecipitados ^11.
   2. consider o genómico como enriquecida se 10 amostras IP ng mostrar um maior enriquecimento, quando comparado com 0,1 ng de ADN de entrada.
   3. Expresso de resultados como as vezes de aumento no enriquecimento sobre uma região não enriquecido após a normalização para o ajuste de entrada e com uma amostra de controlo não específico.
   4. Considere o ADN de entrada para ser diluído por 100 (factor de diluição ou DF).
   5. Normalizar a entrada usando a seguinte equação 2 ^-ΔCt x 100%, onde -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Entrada x DF].
   6. Ajuste de controlo utilizando a seguinte equação (ΔCt [PI] -ΔCt [NS]) em que NS é a amostra não-específico (sem anticorpo IP, IP ou IgG).
   7. Calcular o enriquecimento dobra da amostra, tal como 2 ^-ΔΔCt. Um arquivo incluindo todas as etapas de cálculos com fórmulas em que apenas cada amostra de PCR podem ser inseridos irá facilitar a análise dos resultados.

Resultados

A Figura 1A ilustra a preparação em primeiro lugar de grânulos de ligação de ADN e de controlo de qualidade utilizando ADN de tamanhos diferentes (escada de 1 kb). 0ne, 2 e 2,5 volumes (1 a 3) de grânulos foi adicionada a um volume de amostra a purificar fragmentos de DNA de alto e baixo peso molecular.

As Figuras 1 B, C, D são exemplos típicos de géis de DNA a partir de DNA sonicado ...

Discussão

Epigenética tornou-se um importante campo de pesquisa em biologia do desenvolvimento. Como um programa genético é activada em células embrionárias para permitir que as células a adquirir uma identidade específica dentro de uma linhagem embrionário tem sido por muito tempo uma questão essencial para biólogos do desenvolvimento.

Chip tem sido amplamente utilizada nos últimos anos e combinados para sequenciamento de DNA seguinte melhoria na resolução de sequenciamento. Isto tornou-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues