La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

Resumen

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Resumen

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Introducción

Antígeno de células 1 (Sca1, o Ly6A / E) del tallo fue identificado por primera vez como un marcador de superficie celular expresada por hematopoyéticas y mesenquimales células ^5,6. La fracción vascular del estroma (SVF) de tejido adiposo obtenido de los depósitos de grasa del ratón es una población heterogénea de células que comprenden de fibroblastos, macrófagos, células endoteliales vasculares, células neuronales y células progenitoras de los adipocitos ^7. Las células progenitoras de los adipocitos o células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son células no cargadas de lípidos que residen en la matriz extracelular rica en colágeno perivascular (ECM) ^8. Aproximadamente el 50% de la SVF constan de ASC, que se caracterizan como linaje negativo (Lin ^-) y CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} La mayoría de estas células se Sca1 ^+: CD24 ^- progenitores de adipocitos, que son capaces de diferenciación de adipocitos in vitro; sin embargo, sólo una fracción de células (0,08% de SVF) constituye Sca1 +: CD24 ⁺ células que son plenamente capaces de proliferar y diferenciarse en adipocitos en las condiciones in vivo ^9. A pesar de la advertencia potencial del uso de Sca1 ⁺ SVF sin discriminar las células CD24 ⁺ CD24 de ^- células, aislar Sca1 ⁺ ASC de los depósitos de grasa utilizando la separación celular inmunomagnética es un método eficaz y práctico para determinar el fenotipo de células autónomas de las células progenitoras de los adipocitos primaria.

En el campo de la obesidad y la diabetes, fibrosis tisular y la inflamación juega un papel crítico en el desarrollo y mantenimiento de la diabetes de tipo 2 ^3. Recientemente, Tokunaga et al. mostraron que las células aisladas de ^alto Sca1 inguinal (o subcutánea, SQ) y perigonadal (o visceral, VIS) los depósitos de grasa C57BL6 / J exhiben diferentes firmas de genes y la remodelación de ECM in vitro ^10. MMP14 (MT1-MMP), un miembro prototípico de la membrana-tmetaloproteinasa de matriz ipo (MMP) de la familia media en el desarrollo del tejido adiposo blanco (WAT) a través de su actividad colagenolítica ^1.

Los ejemplos de experimentos que pueden llevarse a cabo con las células aisladas y enriquecidas a través de la siguiente protocolo incluyen cultivo en tres dimensiones, los estudios de diferenciación, los ensayos de degradación de colágeno, y la secuenciación de ARN ^10,11. Ensayos de degradación deben llevarse a cabo con el colágeno extraído con ácido para asegurar la preservación de telopéptido ^11,12. El siguiente protocolo demostrará los métodos para aislar células del estroma vascular primarias de diferentes depósitos de grasa y enriquecer las células progenitoras de los adipocitos mediante separación celular inmunomagnética. La validez de la clasificación de células se evaluó con citometría de flujo y mediante el uso de ratones Sca1-GFP que expresan GFP en células Sca1 ^+, dirigido por un promotor Sca1 ^13.

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Protocolo

Declaración de Ética: La Universidad de Michigan, el Comité de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) ha aprobado todos los métodos y protocolos, de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación de Animales de Laboratorio, Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Los ratones se mantienen en un vivero Universidad de Michigan y se les da acceso libre a comida y agua y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de oscuridad / luz.

1. Preparativos

1. Preparar medios de cultivo primario con DMEM, 10% de FBS, 1 x P / S / G, y 1x antibióticos / antimicóticos. Esto se utiliza para mantener los tejidos en la digestión antes. Coloque el almacén, la alícuota en baño de agua 37 ºC.
2. Preparar cinco mililitros de solución de colagenasa de tipo III en 5 mg / ml disueltos en HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almohadilla de grasa que se aislaron, hasta cinco ratones. Por ejemplo, cuando se aísla SQ y VIS de un solo genotipo, hacer 10 ml, si es de tipo salvaje y mutante SQ y el VIS, hacen 20 ml. Ajustar el pH a 7,4 y steirritar filtro. Alícuota en 50 ml tubos. Ponga a un lado de la luz.
3. Utilice 70% de etanol para desinfectar campo quirúrgico. Limpie y cubra con una almohadilla azul. Rociar un poco de etanol en la plataforma azul.
4. Utilice las agujas de 22 G de precisar una almohadilla absorbente a la base de poliestireno y recortar con tijeras. Rocíe la almohadilla con etanol y después fijar la placa en la plataforma azul y cubrir con otra almohadilla azul hasta que comienza la disección.
5. Llenar dos tubos de 50 ml con etanol y colocar en una posición adyacente al campo quirúrgico. Coloque las tijeras y pinzas en el etanol.
6. Llene otro tubo de 50 ml con PBS más 1 x anti-anti etanol para enjuagar fuera herramientas quirúrgicas.
7. En la capilla, etiqueta placas de 60 mm para cada tipo de tejido y se llenan de medios de cultivo se calentó a 37 ºC. Colocar las placas adyacentes a la zona quirúrgica.

2. Aislamiento del subcutánea (SQ) de grasa de ratones

1. La eutanasia de ratón con una sobredosis de isoflurano y neumotórax.
2. Suavementerocíe ratón con 70% de etanol y poner en posición supina. Fijar las patas al tablero de la espuma con 22 agujas G.
3. Hacer un pequeño corte en la piel de la parte inferior del abdomen. Sosteniendo la parte superior del corte con las pinzas, tomar las tijeras y separar la piel del peritoneo.
4. Una vez que la piel se separa de el peritoneo desde el abdomen al tórax, reflejar la piel de la peritoneo hacia la cabeza, mediante cortes laterales en la piel a lo largo del lado del cuerpo.
5. Reflejar la piel restante sostiene la grasa inguinal lejos del cuerpo y fijar abajo a la placa con 22 agujas G.
6. Cambiar a unas tijeras finas y pinzas. Coge la almohadilla de grasa inguinal con las pinzas en el origen cerca del peritoneo y cortar distancia entre la piel y la grasa inguinal avanzar hacia la ingle evitando la contaminación de la SQ con la piel.
7. Coloque la almohadilla de grasa inguinal insolated en el plato marcado 60 mm.

3. Aislamiento de Visceral (VIS) almohadillas de grasa

1. De una manera similar a la etapa 2.5, cortar el peritoneo abierto para exponer la almohadillas de grasa y el intestino visceral.
2. Mover el intestino de distancia hacia el tórax.
3. Coge la almohadilla de grasa VIS en el extremo distal y tire suavemente hacia arriba. Diseccionar la almohadilla de grasa VIS teniendo cuidado de excluir del epidídimo (o del útero, si se utilizan ratones hembra) de tejido.
4. Colocar en el plato de la etiqueta y repita el paso 3.3 para la plataforma de VIS restante.

4. La colagenasa digestión de la grasa de ratones

1. Mueva placas de 60 mm a la campana de cultivo de tejido y aspirar fuera de los medios de comunicación.
2. Picar las almohadillas de grasa con tijeras curvas a continuación, añadir a la solución de colagenasa. Asegúrese de enjuagar las tijeras y pinzas entre tipos de tejidos con etanol y PBS.
3. Se agita a 300 rpm y 37 ° C durante 10-20 minutos hasta que los tejidos se digieren. Es aceptable si algunas piezas de SQ son todavía visibles. Este problema se solucionará en un paso posterior.
4. Se añaden 25 ml de medio de cultivo a la solución de colagenasa para detener la collagENasa tratamiento, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta serológica de 10 ml para dispersar a los tejidos digeridos.
5. células de la cepa utilizando un filtro de células de 100 micras. Centrifugar durante 10 min a 300 x g.
6. decantar con cuidado los medios de comunicación de no perturbar el pellet y añadir 5 ml de agua estéril al sedimento y suavemente pipeta para suspender las células. Espere 2 minutos para lisar los eritrocitos.
7. Se añaden 25 ml de medio con FBS células y deformación del 10% a través de un nuevo filtro de células de 100 micras.
8. Centrifugar durante 10 min a 300 x g. medios Decantar y pellet se resuspende en 1 ml de medio de cultivo.
9. Recuento de células con un hemocitómetro usando 1: 1 de azul de tripano.
10. Placa 1 x 10 ⁶ células en un pocillo en una placa de 6 pocillos.

5. separación celular magnética

1. Después de aproximadamente 4 a 6 horas de la adhesión celular, enjuagar las células dos veces con HBSS (-Ca, Mg). Disociar las células adherentes utilizando tripsina al 0,05%. Diluir la suspensión celular de tripsina en tampón de separación de 1 ml y se giro para5 min a 300 x g.
2. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 l de tampón. Retirar una alícuota de 10 l y contar las células usando un hemocitómetro.
3. Centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g.
4. Aspirar el sobrenadante por completo. Resuspender las células en 90 l de tampón. Añadir 10 anticuerpo primario anti-Sca1-FITC l. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
5. Lavar las células con 1 ml de tampón y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. Aspirar el sobrenadante por completo.
6. Resuspender las células en 80 l de tampón. Añadir 20 microperlas anti-FITC mu l. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
7. Lavar las células con 1 ml de tampón y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g.
8. Retire sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en 500 l de tampón.
9. Colocar la columna en el soporte magnético y enjuagar la columna con 500 l de tampón.
10. Añadir suspensión de células a la columna. Evitar las burbujas durante el pipeteado.
11. Recoger el Sca1 sin etiqueta ^{- <}/ Sup> células y lavar la columna 3 veces con 500 l de tampón. Sólo añadir nueva memoria intermedia cuando el depósito está vacío. Evitar las burbujas durante el pipeteado.
12. Retirar la columna del soporte magnético y colocar en un tubo cónico de 15 ml.
13. Añadir 1 ml de tampón de columna y eluir Sca1 ⁺ empujando el émbolo suministrado a través del depósito de la columna.
14. Centrifugar fracciones de células durante 5 minutos a 300 x g. Resuspender las células en medios de cultivo de 1 ml.
15. Retirar una alícuota de 10 l de las fracciones etiqueta y etiqueta y contar las células usando un hemocitómetro.
16. Placa de cada fracción de células en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos.

6. Verificación de separación inmunomagnética de Sca1 ^alta SCA con Citometría de Flujo

1. Enjuagar las células dos veces con HBSS (-Ca, Mg) y disociar las células utilizando tripsina al 0,05%.
2. centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Resuspender las células en medios de cultivo de 1 mL y un recuento usando un hemocitómetro.
3. Obtener> 10 ⁶ células en 1 ml de medios de cultivo y centrifugar a 300 xg durante 5 min.
4. Aspirar el sobrenadante y repita el paso 6.3 dos veces más.
5. Resuspender las células con 1 ml de suero de cabra 2% + 2% de BSA y de bloque durante 30 minutos a RT.
6. centrifugar las células a 300 xg durante 5 min.
7. Retire la solución de bloqueo.
8. Añadir rata IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) o anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), en 100 l de PBS con 2% de suero de cabra y 2% BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
9. Añadir 1 ml de PBS frío a las células. Centrifugadora 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
10. Aspirar el sobrenadante y repita el paso 6.9 dos veces más.
11. Resuspender las células en 1 ml de PBS. Pasar las suspensiones de células a través de un filtro de células de 100 micras en preparación para análisis de citometría de flujo.

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Resultados

El enriquecimiento de ^altos ASC Sca1 de diferentes almohadillas de grasa.

Las células del estroma vascular aisladas de la grasa SQ pantalla similar a fibroblastos, estiran la forma celular, independientemente del nivel de expresión Sca1 (Figura 1A). Células de ^baja Sca1 ^alta y Sca1 Por otro lado, VIS (derivados de eWAT) demuestran clara diferencia en su forma de la célula. ...

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Discusión

En este documento se demuestra el aislamiento y separación de células inmunomagnética de ASC murinos de diferentes almohadillas de grasa y su uso para experimentos in vitro. El método presentado es eficaz para el aislamiento rápido de gran número de ASC Sca1-positivo, que es ventajoso con respecto a los técnicamente complejo y costoso aislamiento FACS mediada de ASC ^9,14. A diferencia de FACS, separación celular inmunomagnética no permite el uso de antígeno múltiple para la identificación...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094